浅析基因定点诱变在蛋白质工程中的应用
蛋白质工程原理与技术
蛋白质工程原理与技术蛋白质工程与原理技术1、什么是蛋白质工程？P1答：蛋白质工程（Protein engineering ）是通过对蛋白质结构与功能关系的了解，借助于生物信息学的知识和手段，利用基因定点诱变和基因重组等技术特异性地改造蛋白质的结构基因，产生具有新的特性的蛋白质的技术。
2、什么是基因定点诱变？答：就是在DNA水平上，通过对蛋白质结构基因中某个或某些氨基酸编码顺序加以改变，从而改变蛋白质结构的技术。
该技术不仅可用于改造天然蛋自质，而且可以用于确定蛋白质中每一个氨基酸在结构和功能上的作用，以收集有关氨基酸线形顺序与其空间构象和生物学活性之间的对应关系，为人工改造蛋白质提供理论依据。
3、什么是表达载体？P27答：表达载体：就是在克隆载体基本骨架的基础上增加表达元件（转录和翻译所必需的DNA序列，如启动子、终止子等），使外源DNA片段能够在宿主细胞中表达蛋白质。
包括原核细胞表达载体和哺乳动物细胞表达载体两类。
4、什么是克隆载体？P27答：克隆载体：在载体上插入合适大小的外源DNA片段，并引入到宿主细胞中进行大量繁殖，使外源DNA片段得到大量扩增。
5、基因克隆的基本程序？P29答：（1）获得目的基因；（2）与克隆载体连接，形成新的重组DNA分子；（3）用重组DNA分子转化受体细胞，并能在受体细胞中复制和遗传；（4）对转化子筛选和鉴定；（5）对获得外源基因的细胞或生物体通过培养，获得所需的遗传性状或表达出所需要的产物。
6、真核基因在大肠杆菌中的表达方式？（条件）P34答：基本条件：①大肠杆菌没有剪切内含子的功能，所以，真核细胞的目的基因必须来自于cDNA;②真核基因mRNA缺乏结合细菌核糖体的SD序列，因此cDNA的起始密码子(ATG)上游部分(5‘端非编码区)是无用的，必须除去。
对于一些分泌性蛋白，还应除去信号肽部分；③表达载体应是含有大肠杆菌RNA聚合酶所能识别的启动子和SD序列的大肠杆菌表达载体; ④载体上只能用大肠杆菌启动子，将外源基因克隆在启动子下游，以便大肠杆菌RNA聚合酶识别启动子，并带动真核基因在大肠杆菌细胞中转录。
蛋白质工程的定点突变
20世纪80年代以来，基因克隆技术与DNA化学合成方法相结合，建立和发展了定点突变技术。
可以按照预定设计，在已知的DNA序列中增删或转换核苷酸，精确地是靶基因在特定位点发生碱基序列的变化，进而使基因表达及调控，基因产物发生相应改变。
这种快速精确的基因突变已经被广泛地应用与基因工程和蛋白质工程之中。
定点突变有多种方法，有的改变特定核苷酸，有的则是对一段最可能影响蛋白质功能的基因序列进行随机突变，产生一系列突变蛋白质。
寡核苷酸诱导的定点突变基本上分两类：一类是用单链噬菌体M13作载体的寡核苷酸介导的单链模板定点突变；另一类用双链质粒作载体，双引物法定点突变。
为了在体外导入特定的点突变，小的限制性片段可以切除，并被包含所需要突变的合成接头所替代（称为盒式诱变）。
如果不行，插入片段可以克隆到产生单链DNA的噬菌粒载体中，由所设计的错配引物指导DNA复制，产生异源双链的复制型，并在下面的复制循环中产生野生型和突变的复制型。
单链噬菌体作载体的定点突变的基本原理是，用已知序列的环状DNA变性后为模板，人工合成一段引物，将所要设计的定点突变寡核苷酸置于引物中，也就是说人工所合成的引物不是完全和模板互补，而是在某个位点有意识地让碱基突变，和模板上的碱基不能配对，由于其他的碱基是互补的，所以任然可以通过复性，使引物和模板特异性结合。
在M13单链环状模板上杂交一段寡核苷酸引物，利用DNA聚合酶和连接酶的作用，从引物延伸合成链，得到一个闭合环状的异源双链分子。
由于预先在寡核苷酸引物中人为地引入碱基的错配对，插入或缺失，然后在将杂合双环DNA转化到细菌中，因此异源双链DNA经转化和筛选就可以分离到带有相应突变的DNA克隆。
由于复制是半保留复制，经克隆后将有一半的后代环状DNA产生了定点突变，另一半和正常的亲代链一样。
环状双链质粒DNA作为载体进行基因的改造有它的优点。
待改造基因中如有两个适当的限制性内切酶切点，可以用人工合成双链DNA片段置换两切点之间原有序列，在人工合成的双链DNA片段中包含有突变的序列。
基因定点诱变技术与DNA与蛋白质互作及定点突变介绍
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• EMSA • 还被
用于 研究 与蛋 白质 相结 合的 DNA • 序列 的特
异型。
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四）DNaseI足迹试验 （DNase I foot printing）
• 主要步骤： ① 用32P标记DNA双链末端，并用RE切去一端； ② 加入细胞特定周期蛋白质提取物，温育； ③ 加入适量DNaseI或硫酸二甲酯-六氢吡啶，使 DNA链发生断裂。 这一反应中，DNaseI或硫酸二甲酯的用量非常关键， 要保证一条链只发生一次断裂！ ④沉淀DNA（包括与DNA相结合的蛋白质）； ⑤进行DNA凝胶分析。
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酵母双杂交的基本原理示意图 25
二） 酵母单杂交系统
• 酵母单杂交系统是上世纪90年代中发展起来的研 究DNA-蛋白质之间相互作用的新技术，可识别稳 定结合于DNA上的蛋白质，在酵母细胞内研究真核 生物中DNA-
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一）酵母双杂交系统 （yeast two-hybrid system)
1. 原理：
• 真核生物的转录因子大多是由两个结构上分开、 功能上独立的结构域组成的，即 DNA结合域（BD） 和转录激活域（AD）。
• 单独地BD能与特定基因地启动区结合，但不能激 活基因的转录，而由不同转录因子的BD和AD所形 成的杂合蛋白却能行使激活转录的功能。
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4）一旦酵母细胞中表达的“诱饵”蛋白与“猎物” 载体中表达的某个蛋白质发生相互作用， 不同转录调控因子的AD和BD结构域就会 被牵引靠拢，激活报告基因表达。
5）分离有报告基因活性的酵母细胞，得到所 需要的“猎物”载体，获得与已知蛋白相互 作用的新基因。
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AD:Activation domain DNA-BD:Binding domain
基因工程与蛋白质表达
基因工程与蛋白质表达随着科技的不断进步，基因工程已经成为生物科学领域的一项重要技术。
基因工程涉及到对生物体中的基因进行操作和调控，从而改变其遗传信息与表达方式。
这项技术的应用范围广泛，其中之一就是在蛋白质表达领域的应用。
本文将从基因工程与蛋白质表达的关系、基因工程在蛋白质表达中的应用和未来发展方向三个方面对这个话题进行探讨。
一、基因工程与蛋白质表达的关系基因工程和蛋白质表达密不可分。
在生物体中，基因携带了蛋白质的合成信息，而蛋白质则是基因的表达产物。
基因工程通过对基因序列的修改和调控，可以实现对蛋白质合成的精确控制。
这种精确控制使得科学家们能够大规模、高效率地制备目标蛋白质，为生物制药、工业生产等领域提供了强有力的支持。
二、基因工程在蛋白质表达中的应用1. 重组蛋白质的生产基因工程技术可以将所需蛋白质的基因序列插入到高产蛋白质的表达载体中，然后将其导入到宿主细胞或其他表达系统中进行表达。
通过这种方式，科学家们可以大量制备目标蛋白质，这对于药物研发、工业酶的生产以及新型材料的研究等有着重要的意义。
2. 蛋白质的定点突变基因工程技术可以通过基因重组和点突变来改变蛋白质的结构和功能。
例如，在药物研究中，科学家们可以通过基因工程技术对蛋白质进行修改，使其具有更好的药理特性和生物活性。
3. 糖基化蛋白的工程化表达基因工程技术可以使得在非糖基化的宿主细胞中产生糖基化蛋白。
这是因为基因工程技术可以将糖基化酶的基因插入非糖基化细胞中，从而实现对糖基化蛋白的表达。
三、基因工程与蛋白质表达的未来发展基因工程与蛋白质表达领域仍然有很大的发展空间和潜力。
1. 新型表达系统的开发目前已经存在的表达系统在某些方面还有局限性，例如蛋白质的折叠、修饰等问题。
未来的研究可以致力于开发更多的表达系统，使得科学家们能够更好地表达复杂蛋白质。
2. 定向进化技术的应用定向进化技术是一项将基因工程与进化学相结合的技术，可以通过人工干预改变蛋白质的序列与结构。
基因定点突变技术
寡核苷酸介导的定点突变
• 寡聚核苷酸定点诱 变技术是由加拿大 的生物化学家 ( michael smith )发明 的.
寡核苷酸定点突变基本原理
• 合成一段寡聚脱氧核糖核苷酸作为引物，使其与带有目的基因 完全互补。
• 合成的寡核苷酸引物除短的错配区外，与目的基因完全互补。 • 然后用DNA聚合酶使寡核苷酸引物延伸，完成单链DNA的复制。 • 由此产生的双链DNA，一条链为野生型亲代链，另一条为突变型
子代链。 • 将获得的双联分子通过转导入宿主细胞，并筛选出突变体其中
基因已被定向修改
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
盒式突变
• 1985年Wells提出的一种基因修饰技术—盒式突变。
• 盒式突变：用一段人工合成具有突变序列的DNA片段，取代 野生型基因中的相应序列。
• 然而，并非所有变异区附近都能找到合适的限制位点，如 果不存在限制位点，就要用寡核苷酸指导的定位诱变引入 限制位点。
• 定点突变技术的潜在应用领域很广，比如研究蛋白质相互 作用位点的结构、改造酶的不同活性或者动力学特性，改 造启动子或者DNA作用元件，引入新的酶切位点，提高蛋白 的抗原性或者是稳定性、活性、研究蛋白的晶体结构，以 及药物研发、基因治疗等等方面。
应用前景
• 不同于定点突变的是基于PCR的随机突变，通过改变PCR条件提 高PCR过程中的随机出错，这种方法适用于未知的蛋白质，作全 局性分析，所以有人称为饱和突变（saturation mutagenesis）。 不过这种方法由于没有目的性，分析操作相当繁琐，并且不会出 现一个位点2个以上碱基突变，因而应用上有局限性。定点突变 适用于蛋白结构已有初步了解的基因，比PCR随机突变更有目的 性，也更为精确，简单，同时改造基因更加“随心所欲”。由于 定点突变技术在蛋白质组学中有这非常广泛的应用前景，相信这 个技术在不远的将来还会有更大的改进和发展，也必将为更多人 熟悉应用。
定点突变的原理及应用
定点突变的原理及应用1. 简介定点突变（Site-directed mutagenesis）是一种通过有意诱导改变DNA的特定位置的技术。
通过改变DNA序列，可以产生新的突变型，并用于研究基因功能、蛋白质结构与功能关系、以及药物设计等领域。
本文将介绍定点突变的原理及应用。
2. 原理定点突变技术主要有两种方法：化学法和分子生物学法。
以下是两种方法的原理说明：2.1 化学法化学法主要通过碱基修饰剂来改变DNA序列。
常用的方法是使用化学修饰剂N-methyl-N-nitro-N-nitrosoguanidine (MNNG) 或nitrous acid (HNO2)处理DNA，使其发生碱基突变。
这些碱基修饰剂会引起DNA中的碱基发生氧化、甲基化、烷基化等修饰，导致DNA序列的变化。
2.2 分子生物学法分子生物学法是目前应用较广泛的定点突变方法。
主要有以下几个步骤： 1）设计引物：根据目标突变位点的上下游序列，设计引物。
2）PCR扩增：使用设计的引物进行PCR扩增，得到含有突变位点的DNA片段。
3）点突变：使用特定的酶和突变体模板进行点突变反应，使目标位点发生突变。
4）验证突变：通过测序或其他技术手段验证突变是否成功。
3. 应用定点突变技术在许多领域都有广泛的应用，包括但不限于以下几个方面：3.1 研究基因功能定点突变可以用于研究基因功能和调控机制。
通过引入特定的突变体，可以观察到基因功能的变化，进而研究基因在生物体内的作用机制。
3.2 蛋白质结构与功能关系研究蛋白质的结构与功能之间具有密切的关系。
定点突变可以通过改变蛋白质的氨基酸序列，研究蛋白质结构与功能之间的关系。
通过观察突变体的结构和功能变化，可以揭示蛋白质的结构与功能之间的关联。
3.3 药物设计与筛选定点突变技术在药物设计与筛选中也有重要应用。
通过针对特定的基因位点进行突变，可以筛选出与目标药物相互作用的突变体，从而为药物设计和筛选提供理论依据。
浅析基因定点诱变在蛋白质工程中的应用
物合成率下降， 而且这些非全长 的序列需除去 以免影
响后续应用。最后 ， 在寡核苷酸的合成中也会出现大 量的错误 ， 而且出错误率随长度增加而增加。对于较 长的基因往往需要分成若干小的片段进行合成 ， 然后
— ●●———————一
进 行 Ｐ Ｃ Ｒ ｌ ｂ
第２ ９ 卷第 ８ 期
２ ０１ ３拄
中学生物学
Ｍｉ ｄ ｄ ｌ ｅ Ｓ ｃ ｈ ｏ ｏ ｌ Ｂ ｉ ｏ ｌ ｏ ｇ ｙ
Ｖｏ １ ． ２ ９ Ｎｏ ． ８ ２ Ｏ ｌ ３
文件编 号 ： １ ０ ０ ３—７ ５ ８ ６ （ ２ ０ １ ３ ） ０ ８—０ ０ ０ ３—０ ２
以下 三种 。
盒式定点诱变是利用一段人工合成 的含有突变 序列的寡核苷酸片段 ，取代野生型基因中相应序列。 其中， 合成的 Ｄ Ｎ Ａ片段称为“ 盒” 。通常的做法是 ： 先
制备好含有正常 目的基因的重组质粒 ， 然后在 目的基 因需要突变 的部位附近找两个 限制酶位点 ， 利用合适 的 限制 酶将 二者 之 间 的 Ｄ Ｎ Ａ序列 切掉 ，而 由一 段人 工合成含有 突变碱基 的双链 Ｄ Ｎ Ａ片段通过 Ｄ Ｎ Ａ连
物时引入变异碱基 ， 便可使 Ｐ Ｃ Ｒ产物（ 目的基 因） 的
末端引入变异。 ② 变异部位位于基因的中间。 这种情 况需要借助重组 Ｐ Ｃ Ｒ方法 ， 可在 Ｄ Ｎ Ａ任意部位产生 定点诱变（ 图２ ） 。 首先在需要诱变的位置合成含有变
异碱基的互补引物（ 引物 ｂ 和ｃ ） ， 然后分别与 ３ 引物
１ ， ３ Ｐ Ｃ Ｒ介 导的 定点诱 变
－
碱基位 于中间的寡核苷酸 ， 一般长度约 １ ５ ～ ２ ０ ｂ ｐ 。这 条寡核苷酸链除了突变碱基外 ， 其余 的序列与野生型 Ｄ Ｎ Ａ分子中的相应序列完全一致。然后将合成的寡
(教学指导) 蛋白质工程的原理和应用Word版含解析
第4节蛋白质工程的原理和应用课标内容要求核心素养对接1.概述人们根据基因工程原理，进行蛋白质设计和改造，可以获得性状和功能符合人类要求的蛋白质。
2．举例说明依据人类需要对原有蛋白质结构进行基因改造、生产目标蛋白的过程。
1.生命观念：说明基因的碱基排列顺序—蛋白质的结构—蛋白质功能的关系。
2．科学思维：尝试通过蛋白质工程技术，根据人类需要的蛋白质结构，设计改造某一蛋白质的设计流程。
1．概念(1)基础：蛋白质分子的结构规律及其与生物功能的关系。
(2)手段：通过基因改造或基因合成，对现有蛋白质进行改造，或制造一种新的蛋白质。
(3)目的：获得满足人类的生产和生活需求的蛋白质。
2．理论和技术条件：分子生物学、晶体学以及计算机技术的迅猛发展。
二、蛋白质工程崛起的缘由1．基因工程的实质：将一种生物的基因转移到另一种生物体内，后者可以产生它本不能产生的蛋白质，进而表现出新的性状。
2．基因工程的不足：基因工程在原则上只能产生自然界中已存在的蛋白质。
3．天然蛋白质的不足：天然蛋白质的结构和功能符合特定物种生存的需要，却不一定完全符合人类生产和生活的需要。
4．实例：玉米中赖氨酸的含量比较低，赖氨酸合成中两种酶的氨基酸被替换，就可以使玉米叶片和种子中游离赖氨酸分别提高5倍和2倍。
三、蛋白质工程的基本原理1．目标：根据人们对蛋白质功能的特定需求，对蛋白质的结构进行设计改造。
2．方法：改造基因或合成基因。
3．流程：预期蛋白质功能→设计预期的蛋白质结构→推测应有的氨基酸序列→找到相对应的脱氧核苷酸序列(基因)或合成新的基因→获得所需要的蛋白质。
四、蛋白质工程的应用1．在医药工业方面的应用(1)研发速效胰岛素类似物：科学家通过改造胰岛素基因使B链28位脯氨酸替换为天冬氨酸或者将它与29位的赖氨酸交换位置，从而有效抑制了胰岛素的聚合，研发出速效胰岛素类似物。
(2)提高干扰素的保存期：将干扰素分子上的一个半胱氨酸变成丝氨酸，提高了干扰素的保存时间。
高中生物学选择性必修3课时作业15
新教材·生物（RJ） 选择性必修3
解析：基因工程和蛋白质工程均是对基因进行操作，基因工程合成的是 天然存在的蛋白质，而蛋白质工程可以合成非天然存在的蛋白质，A 错误； 可以通过对 X 蛋白基因进行修饰或人工合成获得 X1 蛋白基因，B 正确；蛋 白质工程是在基因工程的基础上延伸出来的第二代基因工程，其过程中也需 要酶和载体作为工具，C 错误；细胞内合成 X1 蛋白与 X 蛋白的过程中，遗 传信息的流向是相同的，D 错误。
新教材·生物（RJ） 选择性必修3
11．(2021 江苏扬州市高二期末)蛋白质工程是新崛起的一项生物工程，又 称第二代基因工程。下图示意蛋白质工程流程。下列有关叙述错误的是( A )
A．蛋白质工程就是根据人们需要，直接对蛋白改造 C．①②过程为转录和翻译 D．蛋白质工程是从④开始的
新教材·生物（RJ） 选择性必修3
解析：细胞中蛋白质糖基化是一种翻译后修饰，主要发生在内质网中， A 错误；糖基化对蛋白质的空间结构有影响，进而影响蛋白质的溶解度、稳 定性、活性等特性，B 正确；基因控制蛋白质的合成，据此可推测蛋白质糖 基化工程可通过基因工程改变糖基化途径中有关酶实现糖基化途径的改变， C 正确；进行合适的糖基化修饰可改变蛋白质的空间结构，进而可以提高治 疗性蛋白质的疗效，D 正确。
新教材·生物（RJ） 选择性必修3
6．(2021 山东青岛二中高二期末)某团队用化学法人工合成了脑啡肽 N 端五肽(能与细胞膜上某种受体特异性结合)的编码区，使其与人干扰素基因 连接，在大肠杆菌中成功表达出一种融合蛋白，该融合蛋白抑制肿瘤细胞生 长的活性显著高于单纯的干扰素。下列叙述错误的是( B )
定点诱变的原理和应用
定点诱变的原理和应用1. 引言定点诱变是一种基因工程技术，可以通过人为干预基因组，使其发生特定的变异。
定点诱变技术在科研、生物医药等领域具有重要的应用价值。
本文将介绍定点诱变的原理和应用。
2. 定点诱变的原理定点诱变的原理是通过人为设计和构建特定的DNA片段，然后将其导入宿主细胞中，通过一系列的分子生物学技术将该DNA片段插入到细胞染色体的目标位点上。
定点诱变技术主要有以下几个关键步骤：•设计目标位点：首先需要确定要进行定点诱变的目标位点，通常是某个特定基因或基因组区域。
•构建修饰DNA片段：根据目标位点的序列信息，设计和合成能够与目标位点配对的DNA片段。
这些DNA片段通常包含所需的突变基因或序列。
•导入宿主细胞：将修饰DNA片段导入宿主细胞中，常用的方法有电转化、化学法和病毒介导的转导等。
•插入目标位点：通过一系列的分子生物学技术，将修饰DNA片段插入到细胞染色体的目标位点上。
常见的方法有CRISPR/Cas9技术、基因敲除、基因转座等。
3. 定点诱变的应用定点诱变技术在科研、生物医药等领域具有广泛的应用价值。
以下是其中几个常见的应用领域：3.1 基因功能研究定点诱变技术可以用来研究基因的功能和表达调控机制。
通过在目标位点上插入突变基因，研究者可以观察到这些突变对基因功能和表达的影响，进而揭示基因的作用机制和生物学功能。
3.2 疾病模型构建定点诱变技术可以用来构建疾病模型，以研究疾病的发生机制和治疗方法。
通过在目标位点上插入与特定疾病相关的突变基因，可以模拟疾病的发生过程，进一步研究疾病的发病机理，并寻找治疗疾病的新方法。
3.3 转基因作物育种定点诱变技术可以用来改良作物品种，提高其产量、抗病性等性状。
通过在目标位点上插入与所需性状相关的突变基因，可以直接导入所需性状，避免传统杂交育种中的不可控性，并加快育种进程。
3.4 基因治疗定点诱变技术可以用来进行基因治疗，治疗一些遗传性疾病或基因突变导致的疾病。
蛋白质工程的应用实例
胰蛋白酶酶活力的测定
三、试剂和器材
1.材料 新鲜或速冻的猪胰脏 2.仪器 剪刀、镊子；绞肉机；研钵；大玻璃漏斗；布
氏漏斗；抽滤瓶； 显微镜；纱布；恒温水浴锅；紫外分光光度计；
计时器；pH试纸。
胰蛋白酶酶活力的测定
三、试剂和器材
胰蛋白酶（EC3.4.21.4）是丝氨酸蛋白酶类，它 是一条单链肽，由223个氨基酸残基组成，N末 端为异亮氨酸。主要作用于精氨酸或赖氨酸羧 基端的肽键。是特异性最强的蛋白酶，在决定 蛋白质的氨基酸排列中，它成为不可缺少的工 具。
第三节 蛋白质工程的应用实例
一、胰蛋白酶
胰蛋白酶极易自溶，自溶产物经层析分离后， 会得到4个具有胰蛋白酶活性的片段。通过对N 末端残基的分析，表明这些活性产物是由于 Arg117-Val118、Lys145-Ser146及Lys159-Ala160处发生了 断裂而出现的。人们运用了蛋白质工程手段， 对Arg117位自溶点进行了缺失突变，最终得到了 稳定性明显提高的突变株。
第一节 蛋白质工程概述
二、蛋白质概述
（一）蛋白质的组成 组成人体蛋白质的氨基酸仅有20种其中除甘氨
酸和脯氨酸外，均属于 L-α-氨基酸第一节 蛋白质工程概述
二、蛋白质概述
（二）蛋白质的结构 一级结构 二级结构 三级结构 四级结构
第一节 蛋白质工程概述
二、蛋白质概述
（三）蛋白质结构与功能的关系 1.蛋白质一级结构与功能的关系 (1)相似的结构具有相似的功能 (2)不同结构具有不同的功能 2.蛋白质空间结构与功能的关系 空间结构发生改变，其功能活性也必然会随之
第三节 蛋白质工程的应用实例
四、组织纤维蛋白溶酶原激活因子
分子生物学 定点诱变liu
第一节
定点诱变
一、定点诱变的概念
利用分子生物学技术，在体外通过碱基取代、插入 或缺失可以使基因DNA序列中任何一个特定的碱基 发生改变。这种体外特异性改变某个碱基的技术， 称谓定点诱变（site directed mutagenesis）。 定点诱变具有简单易行、重复性高等优点，现已发 展成为基因操作的一种技术。这种技术不仅适用于 基因结构与功能的研究，还可通过改变基因的密码 子来改造天然蛋白质。
延伸 5′……AAGGCTTTGCCGATAGGCCATAAGCAGTGCA.. ..3′ ……TTCCGAAACGGCTATCCGGTATTCGT 5′ 5′ AGGCTTTGCCGATAGGCCATAAGCAGTGCA…. 3′ …..T TCCGAAACGGCTATCCGGTATTCGTCACGT.. 5′
Michael Smith 1/2 of the prize Canada
四、定点诱变的常用方法
（一）M13DNA寡核苷酸诱变
基因工程中,噬菌体是一种常用的基因载体,其中又 以M13 和λ 为最常用。 M13噬菌体是一种环形DNA，基因组大小为6.4kb， 在颗粒中包装的仅是正链的DNA，有时也称为感染 型单链DNA(single stranded DNA, ssDNA) 。 当感染型单链M13噬菌体感染大肠杆菌后，在菌体 内借助宿主的酶系统先把ssDNA复制为双链 （dsDNA），称为复制型（replication form,RF） M13（RF- M13）。 广泛用于DNA序列分析和噬菌体表面展示系统 （phage display)和因定点诱变的意义
用于研究基因的结构与功能；
通过改变基因的密码子来改造天然蛋白质，
定点突变和饱和突变
定点突变和饱和突变是两种常用的蛋白质工程技术，它们都可以改变目标基因的序列，从而影响蛋白质的结构和功能。
但是，这两种技术也有很大的不同，主要体现在以下几个方面：突变的范围定点突变是指在目标基因的特定位点上，引入预先设计好的碱基替换、插入或缺失，从而产生特定的氨基酸替换、添加或删除的突变体。
定点突变的目的是根据已有的关于蛋白质结构、功能、催化机理等信息，有目的地改变蛋白质性能或特异性。
饱和突变是指在目标基因的某一位点或某几个位点上，将原来的碱基替换成所有可能的其他碱基，从而产生所有可能的氨基酸替换的突变体。
饱和突变的目的是探索蛋白质功能和结构之间的关系，以及寻找具有改善或新颖性能的蛋白质突变体。
因此，定点突变是一种有选择性的突变技术，它只改变目标基因中感兴趣的部分；而饱和突变是一种无选择性的突变技术，它改变目标基因中所有可能的部分。
突变的方法定点突变通常采用PCR方法来实现，即利用合成的含有突变碱基的引物来扩增目标基因片段，并将其克隆到载体中。
这种方法虽然能够在特定位点引入特定碱基突变，但一次只能引入一种突变碱基，若进行饱和突变需要合成多条突变引物。
这样做既费时又费力，而且容易出错。
饱和突变则采用其他更高效和简便的方法来实现，比如使用简并密码子、随机引物、DNA重组等技术。
简并密码子是指可以编码多种氨基酸的密码子，比如NNK或NNS（N表示任意碱基，K表示G或T，S表示G或C），它们可以编码20种氨基酸中的19种（除了色氨酸）。
随机引物是指含有随机碱基序列的引物，它们可以产生各种不同组合的密码子。
DNA重组是指利用限制性内切酶、连接酶等酶来切割和连接不同来源或不同位置的DNA片段，从而产生新型DNA序列。
这些方法都可以在目标基因上产生大量不同类型和位置的突变，并且操作简单快速。
突变的效果定点突变和饱和突变对蛋白质性能和稳定性的影响也不尽相同。
定点突变通常是根据已知信息进行设计和预测的，因此它们往往能够达到预期的效果，比如增强或减弱蛋白质活性、改善或降低蛋白质亲和力、增加或减少蛋白质稳定性等。
文档：蛋白质工程的实际应用
蛋白质工程的实际应用【提高稳定性】提高蛋白质的稳定性包括以下几个方面:(1)延长酶的半寿期;(2)提高酶的热稳定性;(3)延长药用蛋白的保存期;(4)抵御由于重要氨基酸氧化引起的活性丧失。
葡萄糖异构酶(GI)在工业上应用广泛，为提高其热稳定性，朱国萍等人在确定第138位甘氨酸(Gly138)为目标氨基酸后，用双引物法对GI基因进行体外定点诱变，以脯氨酸(Pro138)替代Gly138，含突变体的重组质粒在大肠杆菌中表达，结果突变型GI比野生型的热半衰期长一倍;最适反应温度提高10~12℃;酶比活相同。
据分析，Pro替代Gly138后，可能由于引入了一个吡咯环，该侧链刚好能够填充于Gly138附近的空洞，使蛋白质空间结构更具刚性，从而提高了酶的热稳定性。
【融合蛋白质】脑啡肽(Enk)N端5肽线形结构是与δ型受体结合的基本功能区域，干扰素(IFN)是一种广谱抗病毒抗肿瘤的细胞因子。
黎孟枫等人化学合成了EnkN端5肽编码区，通过一连接3肽编码区与人α1型IFN基因连接，在大肠杆菌中表达了这一融合蛋白。
以体外人结肠腺癌细胞和多形胶质瘤细胞为模型，采用3H-胸腺嘧啶核苷掺入法证明该融合蛋白抑制肿瘤细胞生长的活性显著高于单纯的IFN，通过Naloxone竞争阻断实验证明，抑制活性的增高确由Enk导向区介导。
【活性改变】通常饭后30~60min，人血液中胰岛素的含量达到高峰，120~180min内恢复到基础水平。
而目前临床上使用的胰岛素制剂注射后120min后才出现高峰且持续180~240min，与人生理状况不符。
实验表明，胰岛素在高浓度(大于10-5mol/L)时以二聚体形式存在，低浓度时(小于10-9mol/L)时主要以单体形式存在。
设计速效胰岛素原则就是避免胰岛素形成聚合体。
类胰岛素生长因子-I(IGF-I)的结构和性质与胰岛素具有高度的同源性和三维结构的相似性，但IGF-I不形成二聚体。
IGF-I的B结构域(与胰岛素B链相对应)中B28-B29氨基酸序列与胰岛素B 链的B28-B29相比，发生颠倒。
酶的定向进化
酶的定向进化关键词：酶氨基酸蛋白质试剂标准物质北京标准物质网一、概念及一般步骤定点诱变方法在蛋白质工程中起到了至关重要的作用。
然而，定点诱变只能对天然蛋白质序列中的部分单独氨基酸进行替换或修改，因而对其生物活性提高的作用有限。
同时，该方法仅适用于三维结构明确、结构与功能的相互关系也清楚的蛋白质，应用空间相对有限。
这些定向诱变技术本身的局限性制约了其更为快速的发展和更广泛的应用。
酶的定向进化技术，则是在不了解酶的空间结构和作用机制的情况下，通过人为创造特殊条件模拟自然进化过程，在体外使其基因发生大量变异，并定向筛选获得具有特定性质或功能的突变酶分子。
相对于传统的定点诱变蛋白质理性设计方法，定向进化被称为蛋白质的非理性设计方法。
酶的定向进化技术一般步骤为：选择已经存在的酶分子作为进化起点，确立目标酶的性质或功能；通过随机突变和基因体外重组创建基因突变文库；确定目标酶分子的筛选方法；选择结果相对最好的突变株。
通常，酶的定向进化是一个循环递进的过程，以一次循环所得的最佳突变株作为下一个突变循环起点，逐渐累积正突变直至获得期望的目标酶分子。
酶的定向进化技术是一种更接近自然进化方式的蛋白质工程新策略，使原本在自然界中需要数千万年的进化过程缩短至几个月内完成，并能定向得到符合需要的新型酶分子，大大加速了蛋白质工程的发展。
目前，蛋白质的合理设计策略与酶分子的定向进化方法互相补充，为研究蛋白质的结构和功能开辟了新的道路，拓宽了蛋白质工程的研究范围和应用前景。
二、定向进化的研究方法定向进化一般包括随机诱变、体外重组、筛选鉴定三部分，每一部分都有多种研究技术。
1.随机诱变易错PCR技术是通过改变传统PCR方法的反应条件，使碱基在一定程度上随机错配而引入多点突变，进而构建突变基因库。
该方法多用于较小的基因片段，其遗传变化只发生在单一分子内部，属无性进化范畴。
由于在突变过程中有益突变的概率很低，因此该方法较为费力耗时。
一般易错PCR过程均需要连续反复进行使得每一次的正向突变累积直至产生重要的有益突变。
基因工程在蛋白质方面的应用
基因工程定义：通过将外源基因通过体外重组后导入受体细胞内，从而使这个基因能在受体细胞内复制、转录、翻译表达。
它是用人为的方法将所需要的某一供体生物的——DNA提取出来，在离体条件下用适当的工具酶进行切割后，把它与作为载体的DNA分子连接起来，然后与载体一起导入某一更易生长、繁殖的受体细胞中，以让外源物质在其中进行正常的复制和表达，从而获得新物种的一种崭新技术。
原理：基因重组应用：1在生产领域，人们可以利用基因技术,生产转基因食品二、在环境保护上基因工程做成的DNA探针能够十分灵敏地检测环境中的病毒、细菌等污染。
三、在医疗方面基因治疗即是基因工程的一种技术方法。
此外运用“DNA探针”检测肝炎病毒等病毒感染及遗传缺陷，不但准确而且迅速，在医疗上也应用广泛，四、在基因工程药物的研究方面将生物合成相应药物成分的基因导入微生物细胞内，让它们产生相应的药物，不但能解决产量问题，还能大大降低生产成本。
蛋白质工程的研究进展及前景展望由于基因工程的发展，人们已经可以运用基因重组等理论和方法去设计并制造出预想的各种性能的蛋白质。
这种改变蛋白质的操作可以在蛋白质水平上，也可以在基因水平上。
如基因水平的改变，是在功能基因开发的基础上，对编码蛋白质的基因进行改造，小到可改变一个核苷酸，大到可以加入或消除某一结构的编码序列。
蛋白质水平的改变则主要是对制造出的蛋白质进行加工、修饰，如磷酸化、糖基化等。
蛋白质的化学修饰条件剧烈，无专一性，而基因操作则比较方便，在实施基因操作时，必须预先知道是哪个氨基酸或哪几个氨基酸影响着蛋白质的性状。
就现代生物技术发展水平看，大量新蛋白质通过检测，来确定改变的蛋白质是否具有预期的性状，技术上已是可行的。
２．２定点突变技术目前，在蛋白质工程中最常采用的技术是定点诱变技术，即在特定的位点改变基因上核苷酸的种类，从而达到改变蛋白质性状的目的。
蛋白质工程发展至当代，利用专一改变基因中某个或某些特定核苷酸的技术，可以产生具有工业上和医药上所需性状的蛋白质。
基因定点突变技术
定点突破旳措施
• 寡核苷酸介导旳基因突变指用具有突变碱基旳寡聚核苷酸
片断作为引物，在聚合酶旳作用下开启DNA分子进行复 制。
• 盒式突变是利用一段人工合成旳含基因突变序列旳寡核
苷酸片段，取代野生型基因中旳相应序列。
• PCR介导旳基因突变
寡核苷酸介导旳定点突变
• 寡聚核苷酸定点诱 变技术是由加拿大 旳生物化学家 ( michael smith )发明 旳.
在分子生物学和基因工程中旳应用
探明未知序列旳构造和功能旳关系，如开启子诱变筛选，真 核旳TATA盒保守序列拟定。 载体构建：调控元件，强开启子，多接头。 研究基因调控序列，如AUG前加入ACC序列最佳。
在蛋白质工程中旳应用
降低毒性，如TNF 变化亚型和种旳特异性，如IFN旳23位AAG（赖氨酸），AGG （精氨酸），使IFN2a变成IFN2b。123位Try（酪）变甘/丝， 使IFN种属特异性明显变化，对人抗病毒活性不大于牛。 提升活性和稳定性，如IFN- βser17（cys变ser） 提升蛋白质作用旳专一性，如IFNβ旳9-56位被IFNa旳7-54位 取代后，活性提升40倍。
• 定点突变技术旳潜在应用领域很广，例如研究蛋白质相互 作用位点旳构造、改造酶旳不同活性或者动力学特征，改 造开启子或者DNA作用元件，引入新旳酶切位点，提升蛋白 旳抗原性或者是稳定性、活性、研究蛋白旳晶体构造，以 及药物研发、基因治疗等等方面。
应用前景
• 不同于定点突变旳是基于PCR旳随机突变，经过变化PCR条件提 升PCR过程中旳随机犯错，这种措施合用于未知旳蛋白质，作全 局性分析，所以有人称为饱和突变（saturation mutagenesis）。 但是这种措施因为没有目旳性，分析操作相当繁琐，而且不会出 现一种位点2个以上碱基突变，因而应用上有不足。定点突变合 用于蛋白构造已经有初步了解旳基因，比PCR随机突变更有目旳 性，也更为精确，简朴，同步改造基因愈加“随心所欲”。因为 定点突变技术在蛋白质组学中有这非常广泛旳应用前景，相信这 个技术在不远旳将来还会有更大旳改善和发展，也必将为更多人 熟悉应用。
蛋白质工程的原理和应用课件-高二生物人教版(2019)选择性必修3
A
酪氨酸 酪氨酸
终止 终止 组氨酸 组氨酸 谷氨酰胺 谷氨酰胺 天冬酰胺 天冬酰胺 赖氨酸 赖氨酸 天冬氨酸 天冬氨酸 谷氨酸 谷氨酸
G
半胱氨酸
半胱氨酸
C
终止、硒代半胱氨酸
A
色氨酸
G
精氨酸
U
精氨酸
C
精氨酸
A
精氨酸
G
丝氨酸
U
丝氨酸
C
精氨酸
A
精氨酸
G
甘氨酸
U
甘氨酸
C
甘氨酸
A
甘氨酸
G
基 因 定 点 诱 变 技 术 的 示 意 图
第4节 蛋白质工程的原理和应用
最早被发现的荧光蛋白是绿色荧光蛋白，科学家通过改造它，获得了各种颜色的荧 光蛋白。
科学家是怎样对蛋白质分子进行设计和改造的呢？
一 蛋白质工程崛起的缘由
1.基因工程的实质： 将一种生物的基因转移到另一种生物体内，后者可以产生它本不能 产生的蛋白质，进而表现出新的性状
2.基因工程的不足： 基因工程在原则上只能生产自然界中已存在的蛋白质
(4)研究人员经鉴定、筛选获得一只转基因杂合鼠F0,并确认突变基因已经稳定同源替代IKK基因,请你设计完成获得 SCID模型鼠的实验步骤: ①杂交亲本: F0×野生鼠 ,杂交得F1; ②F1雌、雄鼠随机交配得F2; ③提取F2每只小鼠的基因组DNA,采用分子生物学方法,利用IKK基因探针和突变基因探针进行筛选,
三 蛋白质工程的应用
1.研发速效胰岛素类似物 定点突变
天然蛋白质易形成 预期 降低胰岛素 二聚体或六聚体 功能 的聚合作用
多肽链
翻译
转录
mRNA
新胰岛 素基因
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浅析基因定点诱变在蛋白质工程中的应用
作者：胡文斌朱云波
来源：《中学生物学》2013年第08期
在蛋白质工程中对蛋白质结构进行的设计改造，最终还必须通过基因来完成。
设计改造后的蛋白质在自然界生物中不存在相应的基因，往往需要通过人工化学合成或基因修饰获得，其中基因修饰的主要方法就是基因定点诱变。
如在高中生物人教版选修3教科书“蛋白质工程的崛起”这一节中谈到：“将天冬氨酸激酶的第352位的苏氨酸变成异亮氨酸，将二氢吡啶二羧酸合成酶中104位的天冬酰胺变成异亮氨酸，就可以使玉米叶片和种子中的游离赖氨酸分别提高5倍和2倍。
”这个实例中，改造后的蛋白质基因与原始基因只有一个碱基对的差异，其所用的方法就是基因定点诱变。
但是，基因突变往往是不定向的，是随机的，研究者如何让基因按照人的意愿进行定向突变呢？为什么没有用化学合成法合成基因呢？化学合成法有什么弊端吗？下面就这些问题作简要分析和阐述。
1 基因定点诱变的原理和方法
基因定点诱变技术是蛋白质工程研究中的一种重要方法，其实质是利用化学合成寡核苷酸和基因重组技术相结合的方法，按照预定设计，对已知基因的特定碱基进行定点增删或转换，最终改变对应的氨基酸序列和蛋白质结构。
最具代表性的定点诱变方法有以下三种。
1.1 寡核苷酸介导的定点诱变
利用人工合成的寡核苷酸可以制造任何部位的突变，而不受限制酶切点的限制（图1）。
如果希望改变某个DNA的某个特定碱基，可以先合成一条突变碱基位于中间的寡核苷酸，一般长度约15～20 bp。
这条寡核苷酸链除了突变碱基外，其余的序列与野生型DNA分子中的相应序列完全一致。
然后将合成的寡核苷酸与由单链噬菌体做载体所携带的DNA克隆互补链混合，进行分子杂交。
这段配对的寡核苷酸可以做为引物，在DNA聚合酶作用下合成完整的互补链，再用DNA连接酶连接起来。
将此双链DNA导入大肠杆菌中，经扩增就可以得到大量可稳定遗传的的突变DNA克隆。
1.2 盒式定点诱变
盒式定点诱变是利用一段人工合成的含有突变序列的寡核苷酸片段，取代野生型基因中相应序列。
其中，合成的DNA片段称为“盒”。
通常的做法是：先制备好含有正常目的基因的重组质粒，然后在目的基因需要突变的部位附近找两个限制酶位点，利用合适的限制酶将二者之间的DNA序列切掉，而由一段人工合成含有突变碱基的双链DNA片段通过DNA连接酶连接取代，从而达到基因定点突变的目的。
此法的缺点在于突变区段的两侧需存在一对限制酶位点，限制了该方法的广泛应用。
1.3 PCR介导的定点诱变
任何基因，只要知道两端及需要变异部位的序列，就可用PCR诱变去改造该基因序列。
由于方法简便易行，结果准确高效，因此PCR介导的定点诱变已成为最常用的方法。
PCR定点诱变有两种情况。
①变异部位位于基因的末端。
这种情况只需在人工合成5'端或3'端引物时引入变异碱基，便可使PCR产物（目的基因）的末端引入变异。
②变异部位位于基因的中间。
这种情况需要借助重组PCR方法，可在DNA任意部位产生定点诱变（图2）。
首先在需要诱变的位置合成含有变异碱基的互补引物（引物b和c），然后分别与3'引物（引物a）和5'引物（引物d）进行PCR，这样便可得到两个PCR产物分别含有变异碱基，由于二者中间有一段序列彼此互补重叠，在重叠部位经重组PCR就能得到基因的中间含变异碱基PCR产物。
重组PCR不仅可在基因任意位点引入变异，还可在不同基因片段之间发生重组连接。
2 化学合成法的局限性
DNA的化学法合成不需要模板，在蛋白质改造中可以依据研究人员设计的核苷酸序列直接合成基因。
那么为什么不都用化学方法直接合成突变基因呢？这是由于化学法合成DNA的缺陷造成的。
首先，化学合成的是单链，这个问题可通过合成互补链退火来部分解决。
其次，在化学合成中不能保证前一步产物能100%延长到下一步的产物，随着长度的延长，产物合成率下降，而且这些非全长的序列需除去以免影响后续应用。
最后，在寡核苷酸的合成中也会出现大量的错误，而且出错误率随长度增加而增加。
对于较长的基因往往需要分成若干小的片段进行合成，然后经拼接才能得到完整的基因，这使得基因制备难度加大，并且费用相对比较昂贵，从而导致化学合成法的应用具有一定的局限性。
从上述可以看到，定点突变技术在蛋白质工程中具有重要应用价值。
自1982年Zoller和Smith发表寡核苷酸介导的定点突变方法以来，通过不断发展和创新，定点突变技术已经成为研究蛋白质结构和功能之间的复杂关系的有力工具，也是实验室中改造、优化基因常用的手段，其应用领域非常广泛，在研究蛋白质相互作用位点的结构、改造酶的活性或者动力学特性，提高蛋白的抗原性或稳定性，改造启动子或DNA作用元件，以及药物研发、基因治疗等方面都有非常重要的应用。
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