细胞工程原理成体干细胞及组织工程学

这是世界首例自体干细胞移植治疗心肌梗塞成 功的病例。
组织工程的三大难点：
地球重力限制了细胞的三维生长； 离体培养难以确保器官形成所需的多种条件； 细胞间相互促进或抑制的机理尚未研究清楚；
组织工程（体外）三大步骤：
制备干细胞，诱导定向分化； 建立由细胞和可降解材料构成的三维空间复合
体； 采用稳定的培养系统，是工程组织维持长期的
分化状态。
体内植入研究
组织相容性； 材料降解与细胞功能的发挥同步化； 代谢活动，营养来源，血管化过程及方式； 与生长发育的关系，细胞的作用及转归，植入体
已为一个男孩培养了一 个胸廓，并在裸鼠身上 制造出了人耳。
人工心脏：
2001年8月，德国杜塞尓多夫大学医院施特劳 尓教授等宣布，从心肌梗塞患者的脊椎中取出 干细胞，经处理后将其注入借助“球体膨胀法” 撑开的梗塞动脉中。术后10周，患者心肌梗塞 的规模便缩小了近1/3，心脏功能也得到明显 改善。
具有自我更新和分化形成任何类型细胞的能力， 有形成完整个体的分化潜能。
可分化成为全身200多种细胞类型，进一步形成 机体的所有组织、器官。
成体干细胞——多能干细胞（pluripotent stem cell），单能干细胞（unipotent stem cell）。
多能干细胞能产生多种类型细胞的能力，但却失去了 发育成完整个体的能力，发育潜能受到一定的限制。
①生物相容性好 ②有可吸收性 ③ 有可塑性 ④表面化学特性和表面微结构利于细胞的粘附和生长 ⑤降解速率可根据不同细胞的组织再生速率而进行调整。
细胞外基质的研究——组织工程所
应用的材料
天然ECM ：采用胶原制作人工皮和血管的模型 人工的ECM ：聚乳酸、聚羟基乙酸、两者的共聚物
（PGA-PLA）、聚ρ-羟基丁酯（PHB）；聚乳酸-已内 酯的共聚物（PLC）、聚原酸酯、聚磷本酯、聚酸酐 天然高分子同合成高分子的复合物 ，如胶原-PCA的复 合物等 有机材料同无机材料的复合物，如羟基磷灰石-甲壳素 的复合物，羟基磷灰石-PLA的复合物等
造血干细胞的分化：
造血干细胞微环境
血管周围微环境、骨内膜微环境：维持干细胞
“干性”
造血干细胞的分离与鉴定
人HSC表面标志物：CD34+、Lin-、c-kit+、 sca-1+，Thy-1, IL-7Rα, Flt3, CD150。
流式细胞分选技术，免疫磁珠分选。
HSC的功能鉴定：致死剂量放射线照射动物， HSC移植可以重建骨髓的造血功能，长期 （>16周）产生多系成熟血液细胞。
1998年，Okano报道，成人脑室下区存在神 经干细胞。
1999年，Johnasson证实，成年哺乳动物脑 室管壁的室管膜细胞是神经干细胞。
1999年，Doetsch报道，成年哺乳动物脑内室 下区的星形胶质细胞是神经干细胞。
NSC的表面标志物：
巢蛋白(nestin)： 仅在胚胎早期神经上皮表达，
成体干细胞三大特征：
自我更新
种系定向分化能力：具有多能分化特性，能够分
化为特定组织的多种细胞类型，但分化潜能有限。
在特定组织定居：大多数成体干细胞处于休眠状 态（G0期），病理因素或诱导后表现再生和更新 能力，替代受损细胞或死亡细胞。
胚胎干细胞与成体干细胞
胚胎干细胞——全能干细胞（totipotent stem cell）
材料改性等）
体内植入（材料生物相容度、降解与细胞功能的同步化、营养支
持、血管生成、种子细胞的转归）
检测和管理 临床验证 产业化
种子细胞：
胚胎干细胞：存在伦理 问题，来源不易。
成体干细胞：易获得， 自身的成体干细胞没有 免疫原性。
干细胞定向分化的基因策略：
体外途径：从病人体内获取细胞，体外培 养并进行基因转移后，重新输入患者体内。
首都医科大学附属神经外二科主任黄红云等自 2001年起在世界上率先开展流产胎（婴）儿嗅 鞘细胞（一种干细胞）移植治疗脊髓损伤。
已经治疗近400例，部分完全性脊髓损伤患者 恢复部分功能。
表皮干细胞：
表皮干细胞终生都在更新； 体外培养表皮干细胞技术已经非常成熟； 治疗的效果易于观察，万一发生不良反应可方
CSCs and stem cell niche
在肿瘤细胞中存在着小部分的肿瘤干细胞（cancer stem cells, CSCs），是肿瘤形成、复发、转移和耐 药的决定性原因和基础。
成体干细胞来源：
可能是胚胎细胞残留于机体，并在干细胞微环 境的作用下保持静息状态。
存留的组织需要修复，便在特定微环境下被激 活并分化成所需的细胞。
容易获得； 体外扩增109倍仍不失多向分化潜能； 外源基因容易插入； 免疫原性较弱；
常见的组织工程种子细胞
肝干细胞（hepatic stem cell）：
肝干细胞位于Hering’s管区域内，直接参与肝 脏的生长和发育，同时也是肝细胞再生的重要 细胞来源。
HSC、脐带血干细胞和MSC在一定培养条件 下也可以向肝细胞分化。
单能干细胞只能向单一方向分化，产生一种类型的细胞。
干细胞横向分化 （transdifferentiation）
组织干细胞通过活化潜 在的其他分化程序，改 变了组织干细胞的特异 性种系分化进程 。
造血干细胞向非造血组 织细胞分化、神经干细 胞向血液系统细胞分化
造血干细胞（HSC）
胚胎期——定位于胎肝（Fetal liver, FL）
组织工程（Tissue Engineering）
定义：
应用生命科学与工程学的原理与技术，在正确
认识哺乳动物的正常及病理状态下的组织结构、 功能关系的基础上，研究、开发用于修复、维护、 促进人体各种组织或器官损伤后的功能和形态的 生物替代物的一门新兴学科。
组织工程研究内容：
种子细胞 支架材料和细胞外基质 细胞与材料的体外复合培养（细胞生长环境方式、应力，
人工皮肤
人工皮肤“Apligraf”已经 在美国面市； Organogenesis公司研制的 与人类皮肤相同的Apligraf， 是第一个获得食品及药物管 理局（FDA）批准的人造组 织。
它最初用于治疗腿部溃疡， 也可用于治疗足部溃疡和烧 伤。
人工软骨——人耳鼠：
一种能够使膝关节软骨 再生的产品已经面市。
出生后停止表达。一旦神经前体细胞分化即停 止表达，Nestin被广泛用于神经干细胞的鉴定。 A2B5蛋白 vimentin、 胶质细胞标志物(GFAP)等。 细胞表面抗原：CD133+/CD34-/CD45-；
神经干细胞治疗临床应用
帕金森病（Parkinson disease，PD）； 阿尔兹海默病（Alzheimer disease，AD）； 亨廷顿病（Huntington disease，HD）；
成年哺乳动物——骨髓，外周血、脐带血
转录因子MLL（mixed-lineage-leukemia gene），RunX1，TEL/ETV6，SCL/Tal1， LMO2对胚胎期HSC分化发育有重要调节作用。
HSC特性：
多向分化潜能
自我更新
干细胞 的数量相对稳定。
便地移去； 已经成功应用于遗传性水疱病、大疱性表皮松
懈症的基因治疗。
1996，我国徐荣祥在烧伤创面上找到皮肤器官原 位再生的原始细胞“角蛋白十九型皮肤干细胞”， 他们成功诱导上皮组织基底层的干细胞分化生成 皮肤细胞，使受伤的皮肤得以迅速康复，实现人 体器官原位再生，获得美国专利。
该技术显示我国干细胞研究已进入组织和器官的 原位干细胞修复和复制阶段，在国际上处于领先 地位。
成体干细胞及组织工程学
临床血液教研室
什么是成体干细胞？
（somatic stem cell or adult stem cells ）
指存在于分化组织中的未分化细胞，具有自我更 新、构建和补充相应组织中各种类型细胞的潜能。
成体干细胞存在于机体的各种组织器官中。
主要的成体干细胞：
造血干细胞（hematopoietic stem cell, HSC）
体内途径：直接将基因或改造后的病毒 （插入目的基因）导入人体患病组织中。
干细胞基因治疗关键：
选择安全、无毒、容易穿过细胞膜的基因 载体将治疗基因导入细胞内。
理想载体的条件：
➢ 易获得高滴度的纯品； ➢ 能稳定、高效地转染体内非增殖状态的细胞； ➢ 可以长期、稳定地表达外源基因而不会引起细胞毒性、感染或免疫应
化学诱导剂：DMSO、地塞米松（Dex）、丁 酸钠（NaB）和制瘤素（OSM）
2000年8月，日本筑波大学把鼠肝干细胞体外 培养后移植到肝功能衰竭的鼠肝中，40天后干 细胞发育成新的肝组织，分泌出鼠肝特异清蛋 白。
神经干细胞（NSC）：
1992年Reynolds和Weiss首先从成年小鼠的 纹状体和海马中分离出NSC。
人肝干细胞特征性标志物：
角蛋白19（cytokeratin 19, CK19）， 神经细胞粘附分子（neural cell adhesion
molecule，NCAM） 上皮细胞粘附分子（EpCAM） claudin-3（CLDN-3）
肝干细胞定向分化：
细胞因子：成纤维细胞生长因子2（FGF-2）、 人activin A、肝细胞生长因子（HGF）和骨形 成蛋白2（BMP2）。
答； ➢ 能特异地识别靶组织，在其中表达外源基因；
转基因干细胞安全性问题：
西班牙马德里自治大学博尔纳德教授和丹麦欧 登塞大学医院布瑞恩斯称（2005年5月《癌症 研究》），体外培育人体充质干细胞六至八周 是安全的，但超过四到五个月，这种干细胞会 发生自发转化。体外培养八个月、分裂了90至 140代的人体充质干细胞移植至动物体内后， 发现“最老的”细胞发生了癌变。
的最终结局； 体内生物力学，免疫学； 对药物治疗的反应。