超分辨成像-高婧
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17
18
离子型蛋白-磷脂相互作用介导的EGFR成簇模型
19
小结
双色成像显示 EGFR 与脂筏共定位，表明脂筏在 EGFR 成簇 中起一定作用。 酸性磷脂PIP2参与介导了EGFR蛋白簇的形成。 EGFR富含正电荷氨基酸残基的近膜区 (JM区)通过结合PIP2 分子与质膜相互作用，在EGFR成簇和信号激活过程中有重 要作用。
N端保守序列(ND)、卷曲结构域(COILED COIL)、DNA结合区(DNA)、涉及转 录的连接区(LD)、SH2结构域(SH2)、转录激活区(TAD)；所有STAT蛋白均有 Tyr磷酸化位点，STATs 1, 3, 4, 5A和5B还有Ser磷酸化位点。
Horvath, C. M., et.al, TiBS, 2000
NL
EGFR蛋白以Alexa647偶联的Cetuximab单抗标记 标尺：10 μm
9
10
COS-7细胞上EGFR分布
标尺：10 μm
11
小结
EGFR在细胞膜上以蛋白簇的形式存在。
EGFR蛋白簇在不同细胞表面的分布和形态不同，在人肺癌 细胞上蛋白簇的数目比正常肺细胞上多，尺寸也更大。
EGFR蛋白簇在同一种细胞的不同表面分布情况也不同，上 表面形成的蛋白簇与下表面相比更多更大，而悬浮细胞膜 上EGFR的簇数目和尺寸则介于二者之间，表明细胞极性和 外界环境因素对EGFR成簇均有影响。
28
a. 不同周期下STAT1蛋 白水平变化 b. 核内与胞质内STAT1 蛋白数目比率变化 c. 蛋白免疫印迹检测 STAT1蛋白水平
26
STAT1蛋白簇特征分析
簇数目
簇尺寸
27
小结
在细胞周期各个阶段，整个细胞内都有 STAT1 的蛋白簇， 推测为STAT1寡聚体或与其他家族成员形成的异聚体。 从G1到G2这一间期过程，蛋白簇的数目和尺寸都在不断增 加，而转录就发生在这一阶段，表明转录和细胞周期的其 他生命活动促进了 STAT1 蛋白簇的形成，缩短蛋白之间距 离，有利于快速的信号传导。 为进一步研究细胞周期调控的信号分子成簇机制打下基础。
6ຫໍສະໝຸດ Baidu
2.EGFR的质膜成簇分布
表皮生长因子受体（Epidermal growth factor receptor, EGFR）是一种主 要定位于细胞膜的跨膜受体酪氨酸激酶，其配体是EGF 生长因子家族 的成员，比如EGF或TGFα。
促进DNA合成 和细胞增殖， 调控细胞迁移、 存活、黏附以 及抗凋亡等生 命过程
20
4.不同细胞周期下STAT1的胞内定位
STAT 简介
Signal transducer and activator of transcription 信号传导和转录激活因子 家族成员：
STAT1, STAT2, STAT3, STAT4, STAT5A, STAT5B和STAT6
蛋白结构和功能域：
EGFR：Alexa647偶联Cetuximab标记
PIP2: PH-PLCδ-mEos3.2标记 标尺： 10 μm 和 200 nm
15
水解PIP2抑制EGFR蛋白簇形成
Ctrl SJ2
标尺： 10 μm
16
JM区与PIP2的结合介导EGFR成簇
293T cell
WT PM DM
标尺： 10 μm
21
STAT入核过程
生长因子/细胞因子与受体结合 STAT被JAK或PTK磷酸化 聚合为同源或异源二聚体 进入细胞核 与靶基因特定位点结合 促进转录 发育、增殖、免疫、存活……
Reich, N. C., et.al, Nat. Rev. Immunol., 2006
22
细胞周期和同步化处理
细胞周期概念图 细胞同步化
Citri, A. et al., Nat. Rev. Mol. Cell Biol., 2006
7
EGFR结构及其激活过程
Endres NF, et. al., Curr. Opin. Struct. Biol., 2011
8
EGFR质膜上成簇分布
人肺癌细胞 (LC)
LC
正常肺上皮细胞 (NL)
12
3. EGFR成簇机理的调控
EGFR蛋白簇与脂筏共定位
标尺： 10 μm 和 200 nm
13
MβCD破坏脂筏影响EGFR蛋白簇
apical
basal
标尺：10 μm
14
PIP2参与调控EGFR蛋白簇形成
EGFR PIP2
1
2
3
dSTORM与PALM双色成像COS-7细胞膜上PIP2与EGFR簇
利用超分辨显微镜研究
蛋白质分布及定位
报告人：高 婧
指导老师：王宏达 研究员
单位：中国科学院长春应用化学研究所
2015. 6. 10
内容纲要
1. 研究背景
2. EGFR的质膜成簇分布
3. EGFR成簇的调控机制 4. 不同细胞周期下STAT1的胞内定位
2
1. 研究背景
光学显微镜的分辨极限
在 x-y 水平方向上， PSF的FWHM约为 △xy≈0.61λ/NA
胸腺嘧啶核苷(TdR)双 阻断法，使细胞处于 G1/S期交界处，不同时 间点收集即得不同周期 的细胞
23
STAT1在间期细胞内的分布
刺激前 加EGF刺激使其入核
标尺：10 μm 和 2 μm
24
STAT1在分裂期细胞内的分布
前期
中期
后期
末期
标尺：10 μm
25
不同细胞周期下STAT1的胞内定位
Bo Huang, et al. Cell, 2010
3
超分辨显微镜的简介
• 利用图样式照明实现超分辨成像
受激发射损耗显微镜(STED) 饱和结构照明显微镜(SSIM) 可逆的饱和光学线性荧光跃迁显微镜(RESOLFT)
•另一种是基于单个荧光分子的定位
(直接)随机光学重建显微镜(STORM, dSTORM)
光激活定位显微镜(PALM)
4
超分辨定位显微镜的机理
van de Linde, S., et al. Chem. Biol, 2013
5
超分辨显微镜的应用
分别用Alexa Fluor532和Alexa Fluor647双标微管，进行双色 dSTORM成像
A. Lampe, et.al, Biol. Cell, 2012
18
离子型蛋白-磷脂相互作用介导的EGFR成簇模型
19
小结
双色成像显示 EGFR 与脂筏共定位，表明脂筏在 EGFR 成簇 中起一定作用。 酸性磷脂PIP2参与介导了EGFR蛋白簇的形成。 EGFR富含正电荷氨基酸残基的近膜区 (JM区)通过结合PIP2 分子与质膜相互作用，在EGFR成簇和信号激活过程中有重 要作用。
N端保守序列(ND)、卷曲结构域(COILED COIL)、DNA结合区(DNA)、涉及转 录的连接区(LD)、SH2结构域(SH2)、转录激活区(TAD)；所有STAT蛋白均有 Tyr磷酸化位点，STATs 1, 3, 4, 5A和5B还有Ser磷酸化位点。
Horvath, C. M., et.al, TiBS, 2000
NL
EGFR蛋白以Alexa647偶联的Cetuximab单抗标记 标尺：10 μm
9
10
COS-7细胞上EGFR分布
标尺：10 μm
11
小结
EGFR在细胞膜上以蛋白簇的形式存在。
EGFR蛋白簇在不同细胞表面的分布和形态不同，在人肺癌 细胞上蛋白簇的数目比正常肺细胞上多，尺寸也更大。
EGFR蛋白簇在同一种细胞的不同表面分布情况也不同，上 表面形成的蛋白簇与下表面相比更多更大，而悬浮细胞膜 上EGFR的簇数目和尺寸则介于二者之间，表明细胞极性和 外界环境因素对EGFR成簇均有影响。
28
a. 不同周期下STAT1蛋 白水平变化 b. 核内与胞质内STAT1 蛋白数目比率变化 c. 蛋白免疫印迹检测 STAT1蛋白水平
26
STAT1蛋白簇特征分析
簇数目
簇尺寸
27
小结
在细胞周期各个阶段，整个细胞内都有 STAT1 的蛋白簇， 推测为STAT1寡聚体或与其他家族成员形成的异聚体。 从G1到G2这一间期过程，蛋白簇的数目和尺寸都在不断增 加，而转录就发生在这一阶段，表明转录和细胞周期的其 他生命活动促进了 STAT1 蛋白簇的形成，缩短蛋白之间距 离，有利于快速的信号传导。 为进一步研究细胞周期调控的信号分子成簇机制打下基础。
6ຫໍສະໝຸດ Baidu
2.EGFR的质膜成簇分布
表皮生长因子受体（Epidermal growth factor receptor, EGFR）是一种主 要定位于细胞膜的跨膜受体酪氨酸激酶，其配体是EGF 生长因子家族 的成员，比如EGF或TGFα。
促进DNA合成 和细胞增殖， 调控细胞迁移、 存活、黏附以 及抗凋亡等生 命过程
20
4.不同细胞周期下STAT1的胞内定位
STAT 简介
Signal transducer and activator of transcription 信号传导和转录激活因子 家族成员：
STAT1, STAT2, STAT3, STAT4, STAT5A, STAT5B和STAT6
蛋白结构和功能域：
EGFR：Alexa647偶联Cetuximab标记
PIP2: PH-PLCδ-mEos3.2标记 标尺： 10 μm 和 200 nm
15
水解PIP2抑制EGFR蛋白簇形成
Ctrl SJ2
标尺： 10 μm
16
JM区与PIP2的结合介导EGFR成簇
293T cell
WT PM DM
标尺： 10 μm
21
STAT入核过程
生长因子/细胞因子与受体结合 STAT被JAK或PTK磷酸化 聚合为同源或异源二聚体 进入细胞核 与靶基因特定位点结合 促进转录 发育、增殖、免疫、存活……
Reich, N. C., et.al, Nat. Rev. Immunol., 2006
22
细胞周期和同步化处理
细胞周期概念图 细胞同步化
Citri, A. et al., Nat. Rev. Mol. Cell Biol., 2006
7
EGFR结构及其激活过程
Endres NF, et. al., Curr. Opin. Struct. Biol., 2011
8
EGFR质膜上成簇分布
人肺癌细胞 (LC)
LC
正常肺上皮细胞 (NL)
12
3. EGFR成簇机理的调控
EGFR蛋白簇与脂筏共定位
标尺： 10 μm 和 200 nm
13
MβCD破坏脂筏影响EGFR蛋白簇
apical
basal
标尺：10 μm
14
PIP2参与调控EGFR蛋白簇形成
EGFR PIP2
1
2
3
dSTORM与PALM双色成像COS-7细胞膜上PIP2与EGFR簇
利用超分辨显微镜研究
蛋白质分布及定位
报告人：高 婧
指导老师：王宏达 研究员
单位：中国科学院长春应用化学研究所
2015. 6. 10
内容纲要
1. 研究背景
2. EGFR的质膜成簇分布
3. EGFR成簇的调控机制 4. 不同细胞周期下STAT1的胞内定位
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1. 研究背景
光学显微镜的分辨极限
在 x-y 水平方向上， PSF的FWHM约为 △xy≈0.61λ/NA
胸腺嘧啶核苷(TdR)双 阻断法，使细胞处于 G1/S期交界处，不同时 间点收集即得不同周期 的细胞
23
STAT1在间期细胞内的分布
刺激前 加EGF刺激使其入核
标尺：10 μm 和 2 μm
24
STAT1在分裂期细胞内的分布
前期
中期
后期
末期
标尺：10 μm
25
不同细胞周期下STAT1的胞内定位
Bo Huang, et al. Cell, 2010
3
超分辨显微镜的简介
• 利用图样式照明实现超分辨成像
受激发射损耗显微镜(STED) 饱和结构照明显微镜(SSIM) 可逆的饱和光学线性荧光跃迁显微镜(RESOLFT)
•另一种是基于单个荧光分子的定位
(直接)随机光学重建显微镜(STORM, dSTORM)
光激活定位显微镜(PALM)
4
超分辨定位显微镜的机理
van de Linde, S., et al. Chem. Biol, 2013
5
超分辨显微镜的应用
分别用Alexa Fluor532和Alexa Fluor647双标微管，进行双色 dSTORM成像
A. Lampe, et.al, Biol. Cell, 2012