植物激素测定方法述评_鲁哲
植物激素免疫测定指南
植物激素的酶联免疫吸附测定法（ELISA）免疫测定是利用抗原、抗体特异性反应而建立的，根据可视化方法的不同可分为：酶联免疫、放射免疫、荧光免疫、化学发光免疫测定、生物发光免疫测定、浊度免疫测定法等。
由于酶联免疫吸附分析法（Enzyme-linked Immunosorbent Assays, 简称ELISA）具有灵敏性、特异性高，且方便、快速、安全、成本低廉的特点，而日益被广泛应用于植物激素测定。
目前，几大类植物激素IAA,ABA, GA3、GA4、iPA、ZR、DHZR等都建立了相应的ELISA方法并有试剂盒出售。
植物激素的酶联免疫检测方法有两种形式（见下图），一种是在固相载体上直接包被抗体（直接法，先包被二抗，再加一抗），另一种是包被抗原（间接法）。
直接法利用游离抗原和酶标抗原与吸附的抗体进行竞争。
间接法利用游离抗原和吸附抗原与游离抗体进行竞争。
间接法的原理可用下式表示：Ab+H+HP=AbH+AbHP其中Ab表示抗体，H表示游离激素，HP表示吸附在板上的激素－蛋白质复合物。
根据质量作用定律，当该反应体系中Ab及HP的量确定时，游离H越多，结合物AbH形成的就越多，而AbHP形成的就越少，即结合在板上的抗体就越少，通过酶标二抗检测结合物AbHP的多少，就可以确定游离H 量的多少。
材料、试剂及设备1 材料各种新鲜植物材料2 仪器设备研钵，冷冻离心机，台式快速离心浓缩干燥器或氮气吹干装置，酶联免疫分光光度计，吸水纸，恒温箱，冰箱，酶标板（40孔或96孔），可调微量液体加样器（10μl，40μl,200μl,1000μl），带盖瓷盘（内铺湿纱布）。
3 试剂(1) 包被缓冲液：称取１.５g Na2CO3, 2.93g NaHCO3, 0.2g NaN3（可不加）, 用量筒加1 000 ml蒸馏水，pH为9.6.(2) 磷酸盐缓冲液（PBS）：称取8.0g NaCl, 0.2g KH2PO4 , 2.96g Na2HPO4 ·12H2O，用量筒加1 000 ml蒸馏水，pH为7.5。
激素测定方法
激素测定方法激素的测定方法参考王学奎（2015）《植物生理生化实验原理与技术》一书中的高效液相色谱法，以2016年采自尚志市水稻田的野慈姑球茎为材料，6-12月每个月测定一次野慈姑球茎内CA3和ABA的含量。
试验材料的处理称取1-2g样品，在冰浴下研磨匀浆，加入80%的预冷甲醇20ml，保鲜膜密封，在4℃冰箱里冷浸过夜。
浸提液抽滤，10ml甲醇润洗研钵2次，过滤后与浸提液合并，40℃下减压蒸发至没有甲醇残余。
剩余水相完全转移到三角瓶中，用30ml石油醚萃取脱色2次，弃去醚相。
加0.01gPVPP（交联聚乙烯吡咯烷酮，crosslinked polyvinylpyrrolidone），超声30mim，抽滤用30ml，乙酸乙酯萃取3次，合并酯相，40℃下减压蒸干。
用甲醇（色谱纯）溶解残留物并定容至2ml，经0.45μm微孔滤膜过滤得待测液，保存于4℃冰箱中。
测定（1）标准曲线的绘制取一定量GA3和ABA标准品，用甲醇（色谱纯）溶解，配制成不同浓度的溶液，点击“运行控制”菜单，再选择“运行方法”，手动或自动进样器进样10-30μL，进行液相检测分析。
在一定浓度范围内，4种激素峰面积与浓度呈良好线性关系时，即可绘制标准曲线。
（2）取同样体积的待测样品，进样。
待样品峰全部出完，冲洗30min待基线平直后，即可分析下一个样品。
（3）定性根据标准品的保留时间判断样品中的对应激素峰。
选择与已知标样具有相同保留时间的样品的峰面积，并根据对应的标准曲线查出对应激素的浓度ρ（μg/mL），然后根据下式计算鲜样（FW）中各激素的含量：样品中激素含量（μg/kg FW）=ρ·V Tm·V S式中：ρ为根据样品峰面积从标准曲线查得的对应激素浓度（μg/mL）；V T为待测样总体积（mL）；V S为进样量（μL）；m 为样品鲜质量（g）。
【论文】高效液相色谱法检测植物激素方法的建立
摘要植物激素是植物体内合成的对植物生长发育有显著作用的几类微量有机物质。
也被称为植物天然激素或植物内源激素。
它们在细胞分裂与伸长、组织与器官分化、开花与结实、成熟与衰老、休眠与萌发以及离体组织培养等方面，分别或相互协调地调控植物的生长、发育与分化。
由于它在植物体内含量甚微，一般水平为1000 ng/g鲜重，建立一种有效，简便的检测方法对于研究植物激素具有指导性意义。
目前植物激素的定性和定量分析主要以理化方法为主，理化测试法包括气相色谱法、液相色谱法、气象－质谱联用等。
本次研究是利用高效液相色谱法来检测植物体内的酸性激素，即吲哚乙酸IAA,吲哚三丁酸IBA，赤霉素GA3,以及脱落酸ABA。
以HPLC进行分析测试，非常适合用于分析那些不能汽化或者在易于裂解不稳定的物质，用HPLC分析植物激素（IAA、IBA、GA3、ABA），采用二极管阵列检测器检测，本次研究的前处理方法为固相萃取法。
通过本次实验，得到了一种简便易操作的前处理方法，找到了液相色谱的最佳工作条件，并通过检测实际样品，证明了该方法是一种有效可行的植物酸性激素的定性定量分析方法。
关键字：植物激素，提取，高效液相色谱。
AbstractPlant hormone is several kinds of trace of organic matter that synthesized in the plant,and it have significant effect on plant growth. They separately or coordinatively regulate of plant growth, development and differentiation. Because it is a trace contect in plants and general level, 1000 ng / g in fresh weight. Therefore, the establishment of an effective and simple detection method for the study of plant hormones is very significant.Present plant hormones qualitative and quantitative analysis mainly based on physical and chemical methods, physical and chemical testing methods including GC, HPLC, GC-MS.with high performance liquid chromatography, the acidic hormones of IAA, indole-3 butyric IBA, gibberellic acid GA3, and ABA in plants are detected. It is suitable for the analysis of those which do not vaporize easily at high temperatures by HPLC. Analysis of plant hormones (IAA, IBA, GA3, ABA), usually use UV monitor testing, and this study of pre-treatment method for solid phase extraction.A simple and easy pre-treatment methods was established, and found the best conditions for liquid chromatography.With detecting the actual samples, Iit shows that it is the feasible and effective method of the acidic hormones analysis .Key words: plant hormones, extraction, detection, HPLC.目 录第一章 前 言 (1)1.1 植物激素的研究背景与意义 (1)1.2 植物激素的种类及性质 (1)1.2.1植物激素概述 (1)1.2.2植物激素——生长素 (2)1.2.3植物素——赤霉素 (3)1.2.4植物激素——细胞分裂素 (4)1.2.5植物激素——脱落酸 (4)1.2.6植物激素——乙烯 (4)1.3液相色谱法的研究 (5)1.3.1液相色谱仪 (5)1.3.2 液相色谱法的主要类型 (8)第二章 实验材料与方法 (11)2.1仪器与试剂 (11)2.2 实验方法 (11)2.2.1 芽样品激素含量的测定 (12)2.2.2种子样品激素含量的测定 (12)2.2.3 C18柱系统的处理及使用（需临时处理） (12)2.2.4 高效液相色谱分析 (12)2.2.5溶液的配制 (13)2.2.6 标准曲线的测定 (14)2.2.7 稳定性实验 (15)2.2.8回收率的测定 (16)2.2.9 检出限的测定 (16)第三章 实验结果与讨 (17)3.1标准曲线的绘制 (17)3.1.1 IAA标准曲线的绘制 (17)3.1.2 IBA标准曲线的绘制 (17)3.1.3 ABA标准曲线的绘制 (18)3.1.4 GA3标准曲线的绘制 (19)3.2稳定性实验 (20)3.3 实际样品激素含量测定 (21)3.4回收率的测定 (22)3.4.1 GA3回收率谱图 (22)3.4.2 IAA回收率谱图 (23)3.4.3 ABA回收率谱图 (24)3.4.4 IBA回收率谱图 (24)3.5 检出限的测定 (25)第四章 结论 (27)参考文献 (28)致谢 (30)第一章前言1.1 植物激素的研究背景与意义植物激素是存在于植物体内的具有调节植物生长发育作用的微量元素。
植物激素 整理
植物激素的检测方法1. 生物测试生物测试法是最早采用的植物激素测定方法它是利用植物激素的生理活性通过某些植物的组织和器官对植物激素产生的特异性反应进行测定的。
优点：简便易行也能反映植物激素的生理活性缺点：专一性较差且植物体内含有生长素类似物~ 拮抗物等影响测定的结果需在前处理中尽可能纯化所要测定的组分过程复杂此外重复性差工作量大2. 免疫检测免疫学技术应用于植物激素的测定有力地促进了激素定量研究的发展它的基本原理是利用抗原和抗体的特异性竞争结合。
优点：了检测灵敏度可检测出10-12 g 的微量物质相应其前处理也得到了简化又改善了测定的专一性。
缺点：抗体的制备较复杂。
3.物理化学方法物理化学方法分光谱法和色谱法两种1）分光谱法：主要有紫外吸收光谱~ 红外吸收光谱和荧光法优点：灵敏度高缺点：专一性差2）色谱法：利用物质在不同介质中的分配原理进行测定的，包括纸上层析，薄层层析(TLC) ，气相色谱(GC) ，高效液相色谱(HPLC) 以及气质联用(GC-MS) 等，将分离和测定结合起来是色谱法的基本特点。
（1）纸上层析和TLC：优点：设备简单易操作缺点：分离效率和灵敏度有限制（2）G C 和HPLC：是在纸上层析和TLC 的基础上装备了商品化的色谱柱和检测器，保证了检测方法的专一、灵敏和准确（3）GC 和HPLC 方法:分析植物激素, 灵敏度和选择性高, 重复性好, 但对前处理要求较高; 又因保留时间的分辨有一定限制, 若达不到所需纯度要求可能会出现多种化合物的保留时间相同或接近而影响测定结果。
（4）在植物激素的理化检测中, 仪器联用是当代的发展趋势：最常用的结合系统是气相色谱-质谱联用(GCMSD，技术, 它是目前最为可靠的激素检测方法, 还可验证其它测定方法的可靠性, 而且还可鉴定未知物质的结构，但需经冗长的样品纯化程序, 设备昂贵, 使用和维护成本高。
此外有气液相色谱( GLCD 配以火焰热离子检测器(FTDD 快速灵敏地对植物细胞分裂素定量测定[25], 也有薄层色谱与气相色谱结合分析ABA。
植物激素生物测定
2、苋红素合成法
29
2、苋红素合成法
注意： 1、尾穗苋黄化苗对光十分敏感，整个试 验需在暗室内进行。 2、尾穗苋种子有较长的休眠期，新收获 的种子不能发芽。可放在冰箱中经2-3个 的低温处理后发芽使用。
30
3、组织培养鉴定法
经典方法之一。 大豆愈伤组织、烟草茎的髓部、胡萝卜根 韧皮部等都对细胞分裂素有较高敏感性。 此法专一性强，缺点是需时较长。
33
四、脱落酸的生物测定
1、小麦胚芽伸长法 与生长素的测定方法完全相同，只是脱落 酸的作用是抑制小麦胚芽鞘的伸长。与对 照相比，脱落酸处理组的小麦胚芽鞘伸长 少，脱落酸浓度愈高，胚芽鞘的伸长愈少。
34
2、棉花外植体脱落法
脱落酸能诱导离区细胞中纤维素酶和果胶 酶的生物合成，从而促进植物离层的形成， 导致器官脱落。叶柄对外源脱落酸很敏感， 在一定的浓度范围内，脱落率与浓度成正 比，脱落时间与脱落酸浓度成反比。
25
1、萝卜子叶增重法
细胞分裂素有促进萝卜子叶增大的效应， 其主要原因是促进了细胞的分裂和扩大。 在一定浓度范围内（激动素为2-25mg/L）， 子叶增重与浓度呈线性关系。
26
1、萝卜子叶增重法
27
2、苋红素合成法
原理：尾穗苋（Amaranthus caudatus） 在光照下由幼苗合成一种红色色素-苋红 素（Amaranthin或Betacyanin）。在暗中 发芽的尾穗苋子叶不能合成苋红素，子叶 呈白色。但如供给细胞分裂素和酪氨酸， 暗中萌发的尾穗苋子叶就能合成苋红素。 在激动素浓度为0.01-3mg/L范围内，色素 的量与激动素浓度增加成比例。
3
4
第五章：植物激素的生物测定
植物激素的测定分析采用薄层层析(thin layer chromatography,TLC)、气相色谱 (gas chromatography,GC)、高效液相层 析(high performance liquid chromatography,HPLC)和质谱分析(mass spectrography,MS)等，其原理大都是基 于不同物质在不同介质中有不同的分配系 数。
植物激素的测定方法-精品文档
二、免疫球蛋白的分子结构
免疫球蛋白的基本结构
• 四肽链结构 ，链间二硫键连接 • 两条重链（H）和两条轻链（L） • 氨基端和羧基端。
可变区与恒定区
• 根据氨基酸排列顺序的不同分为： 可变区（V）和恒定区（C） • 可变区（V区）：氨基酸组成、排列顺序变化较 大 • 恒定区（C区）：氨基酸数量、种类、排列顺序 及 含糖量都比较稳定
注意事项 ：
（ 1 ）微量加液器应注意保养并定期校正，否则结果误差 较大，同时加样时不可出现气泡，以免反应物间不能充分 混匀反应。 （ 2 ）洗涤时力求次数足够，且避免形成气泡，否则洗涤 不完全。 （3）温育时要力求受热均匀，同时避免液体蒸发。 （ 4 ）比色时反应管内不能留有气泡，管底不能存有水滴， 否则出现较大误差。
测定标准物各浓度和各样品490nm
处的OD值。
数据分析
在波长 450nm 处分别读取各标准孔和样本孔 OD 值， 以 OD值为横坐标，“标样激素含量的对数”为纵坐
用酶标仪进行比色，以0 ng/ml标准孔为空白孔，
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ标，在半对数坐标纸上画出标准曲线，以测定孔的
利用反对数求得ABA的绝对含量。
OD值在标准曲线上查出待测样品的 ABA含量的对数。
植物激素的酶连免疫分析法
几种酶标分析仪
DNM-9602G酶标分析仪
DNM-9602A酶标分析仪
DNM-9602 标配酶标分析仪
操作步骤
包被---温育---洗涤---竞争--温育---洗涤---加二抗---温育--
-洗涤---显色---比色---计算
包 被
• 每小孔中加入100μl包被缓冲液，然后
植物激素的测定方法？
生物活性法 气相色谱（气-质联机） 液相色谱（液-质联机） 酶连免疫法（ ELISA 法）
植物激素及其检测技术
植物激素及其检测技术什么是植物激素？植物激素是植物合成的一类痕量有机化合物，他们在极低的浓度下就能引发生理反应，在植物的生长发育和环境应答中具有非常重要的作用。
他们几乎参与了植物的每个生命过程，包括种子休眠、萌芽、营养、生长、分化、生殖、成熟和衰老。
1928年，温特证实了首个植物内源激素——生物素的存在，随后其他植物激素陆续被科学家发现。
以前，人们将植物内源激素分为五大类：生长素（auxins）、赤霉素（gibberellins）、细胞分裂素（cytokinins）、乙烯（ethylene）、脱落酸（abscisic acid）。
前三类激素能促进植物的生长发育，乙烯主要促进植物器官成熟，而脱落酸抑制生长发育。
水杨酸（salicylic acid）油菜素内酯（brassinosteroids）、茉莉酸（jasmonic acid，JA）、多胺（polyamines）、酚类（phenolic compounds）、独角金内酯（Strigolactones）等植物激素陆续被发现。
图1. 植物激素。
表1. 主要的植物激素及其代表化合物的分子结构、名称及含量范围（李艳华2011）。
为什么要检测植物激素？一方面，植物激素对于植物生长、发育和对环境响应起着非常重要的调控作用。
另一方面，植物作为重要的农业产品、园艺产品等，植物激素（如细胞分裂素、生长素、油菜素内酯）能显著调节植物的株型结构和产量构成，从而大幅提升作物的产量和品质，茉莉酸、水杨酸、油菜素内酯等多种激素在植物对抗病虫害中发挥重要作用。
因此植物激素的定性、定量在研究植物激素作用机理、植物生命过程、提高农产品/园艺植株质量、和人类定向植物改造方面起到重要作用。
但是植物激素检测具有以下几个难点：1、作为植物的次生代谢产物，含量极低。
1g鲜样中的通常为ng级植物激素，甚至pg级；2、不同样本含量差异大；样本越新鲜越好。
3、基质效应干扰严重。
基质是样品中分析物以外的组分，常对分析物的分析鉴定产生干扰，影响结果的准确性，这种干扰被称为基质效应。
植物激素生物测定
20
1、水稻幼苗叶鞘伸长“点滴”法
21
2、大麦胚乳法
大麦种子吸水萌动后，胚中产生的赤霉素 将胚乳最外的糊粉层中的α -淀粉酶激活。 无胚的大麦半粒种子不能产生赤霉，因此 没有α -淀粉酶活性。它被成功地应用于 赤霉素类物质的测定。
22
2、大麦胚乳法
23
3、矮生玉米叶鞘法
以赤霉素浓度的对数为横坐标,叶鞘长度的 对数为纵坐标。
28
2、苋红素合成法
29
2、苋红素合成法
注意： 1、尾穗苋黄化苗对光十分敏感，整个试 验需在暗室内进行。 2、尾穗苋种子有较长的休眠期，新收获 的种子不能发芽。可放在冰箱中经2-3个 的低温处理后发芽使用。
30
3、组织培养鉴定法
经典方法之一。 大豆愈伤组织、烟草茎的髓部、胡萝卜根 韧皮部等都对细胞分裂素有较高敏感性。 此法专一性强，缺点是需时较长。
6
7
第五章：植物激素的生物测定
生物测定法是通过测定激素作用于植株或 离体器官后所产生的生理生化效应的强度， 从而推算植物激素含量的方法。
8
第五章：植物激素的生物测定
植物激素的生物测定法要求有较强的专一 性, 较高的灵敏性和较短的实验周期, 尤 其是对粗提物的未知激素的粗筛, 常可得 到定性定量的相对结果。测定时, 对环境 条件和植物材料都有较严格的要求。
24
三、细胞分裂素的生物测定法
细胞分裂素(cytokinins)是植物体内普遍存 在的一类激素，其生理作用主要是促进细胞 分裂和扩大，延迟叶片衰老。 细胞分裂素生物测定依据： A：细胞分裂，细胞数目增加或组织增重； B：细胞扩大，即体积的增加； C：延迟叶片衰老，即叶绿素的降解延缓； D：诱导素的合成，即苋红素的合成。
植物激素的检测方法
比色谱法是最早应用于生长 素分析的光谱法，但由于该法选 择性差，现很少被应用。荧光分 析法是进行痕量、超痕量甚至分 子水平上分析的重要手段，它具 有选择性好、取样少、灵敏度高 以及简便快速等优点，近年来在 植物激素分析中得到广泛应用。
电化学分析法
电化学分析法相对于气相色谱(GC)、液相色 谱(HPLC)、毛细管电泳(CE)、免疫法等分析方法具 有简单、方便和仪器价廉等特点. 在早期的研究中, 植物激素的电化学分析方法主要是针对脱落酸、赤 霉素、玉米素和激动素等植物激素标准品的电化学 行为进行探讨. 通过研究发现, 植物激素存在的本底 溶液的性质和pH 对测定结果会产生很大影响。
色谱法和光谱法
色谱法
光谱法
色谱学是利用物质在不同介质中的 分配原理进行测定的, 包括纸上层析、薄 层层析( TLC)、气相色谱( GC)、高效相 色谱( HPLC) 以及气质联用( GC-M S) 等, 将分离和测定结合起来是色谱法的基本 特点。根据色谱学理论, 某种化合物在一 定色谱条件下的出峰时间(保留时间) 是 固定的, 这是色谱学定性的依据； 而色 谱峰面积(或峰高) 与物质的含量(或总量) 成正比, 这是色谱学定量的基础。
植物激素 的 检测方法
目录
CONTENTS
01
02
03
04
植物 激素 定义
植物 激素 分类
植物 激素 检测 方法
参考 文献
1
植物激素的定义
植物激素的定义
天然植物激素或内源性植物激素, 是植 物自身代谢产生的一类具有高度生物活 性的有机小分子化合物. 它们一般先在 植物的某一部位合成, 然后再转运到其 他部位去发挥作用。植物激素虽是小分 子, 却调控着几乎整个植物生命周期, 如 种子萌发、茎叶伸长、果实成熟以及脱 落等生理过程。植物激素还能感应植物 所处生存环境的外界刺激, 如水分、光 照、温度和损伤等, 并作出相应的反应。
植物激素类检测
植物激素类检测植物激素是由植物自身代谢产生的一类有机物质，会从产生部位移动到作用部位，在极低浓度下就有明显生理效应的微量物质，也称为植物天然激素或植物内源激素。
它是植物细胞接受特定环境信号诱导产生的、低浓度时可调节植物生理反应的活性物质。
在细胞分裂与伸长、组织与器官分化、开花与结实、成熟与衰老、休眠与萌发以及离体组织培养等方面，分别或相互协调地调控植物的生长发育与分化。
常见的植物激素有五类，生长素类、赤霉素类(GAs)、细胞分裂素类(CTKs)、乙烯(ETH)和脱落酸(ABA)。
前三类都是促进生长发育的物质，脱落酸是一种抑制生长发育的物质，而乙烯则主要是一种促进器官成熟的物质。
植物激素的离子色谱图植物激素的二级全扫描质谱图迪信泰检测平台采用液质联用(HPLC-MS或LC-MS/MS)的方法，常用Thermo Scientific的U3000快速液相色谱对样品进行分离，随后采用Thermo Scientific™ Q Exactive™对样品进行鉴定，可以高效、精准的检测植物激素的含量变化。
目前可检测的植物激素包括吲哚乙酸(IAA)、玉米素（ZR）、赤霉素（GA3)、脱落酸（ABA)等。
对于常见激素或以上激素的同类物质，可结合标样进行检测，对于稀有的激素分子，如提供标准样品，迪信泰检测平台可提供定制检测。
此外，我们还提供HPLC测定植物激素的服务，以及植物激素系列检测试剂盒产品，以满足您的不同需求。
植物激素类检测项目玉米素（ZA）检测赤霉素（GA）检测吲哚乙酸（IAA）检测脱落酸（ABA）检测水杨酸（SA）检测茉莉酸（JA）检测生长素（Auxin）/植物生长激素检测细胞分裂素（CTK）检测玉米素核苷（ZR）/反式玉米素核苷（TZR）检测吲哚丁酸（IBA）/吲哚-3-丁酸检测6-苄氨基腺嘌呤/6-苄氨基嘌呤（6-BA）检测激动素（KT）检测萘乙酸（NAA）检测异戊烯基腺嘌呤（IP/2ip）检测异戊烯基腺嘌呤核苷（IPA/2ipr）检测结合吲哚乙酸检测结合脱落酸检测水杨酸甲酯（MESA）检测茉莉酸甲酯（MeJA）检测油菜素内酯/芸苔素/油菜素甾醇（BR/BL）检测独角金内酯（SLs）检测褪黑素(MT)/褪黑激素/褪黑色素检测样品制备激素提取方法（此部分涉及到公司的核心工艺，以下提供常规的提取工艺）1）称量约0.5 g的新鲜植物样品；2）液氮研磨至粉碎；3）加入5 mL异丙醇/盐酸缓冲液，4℃震荡30 min；4）加入10 mL二氯甲烷，4℃震荡30 min；5）4℃，13000 rpm离心5 min，取下层有机相；6）避光，氮气吹干有机相，用250 μL-500 μL甲醇(0.1%甲酸)溶解；7）0.45 μm的微孔滤膜过滤，用HPLC-MS/MS检测。
植物激素的测定方法
资料仅供参考,不当之处，请联系改正。
注意事项 ：
（1）微量加液器应注意保养并定期校正，否则结果误差 较大，同时加样时不可出现气泡，以免反应物间不能充分 混匀反应。 （2）洗涤时力求次数足够，且避免形成气泡，否则洗涤 不完全。 （3）温育时要力求受热均匀，同时避免液体蒸发。 （4）比色时反应管内不能留有气泡，管底不能存有水滴， 否则出现较大误差。
资料仅供参考,不当之处，请联系改正。
加 抗体
➢在微孔中加入一定量的抗体,混匀后每孔加 50μl，然后将酶标板加入湿盒内开始竞争。
➢竞争条件37℃左右0.5h。
资料仅供参考,不当之处，请联系改正。
洗板
将反应液甩干并在报纸上拍净。第一 次加入洗涤液后要立即甩掉。然后再接着 加第2次。共洗涤3次。
资料仅供参考,不当之处，请联系改正。
资料仅供参考,不当之处，请联系改正。
包被
• 每小孔中加入100μl包被缓冲液，然后 将酶标板放入内铺湿纱布的带盖瓷 盘内。
• 37 ℃下1.5小时。
资料仅供参考,不当之处，请联系改正。
洗板
将反应液甩干并在报纸上拍净。第一 次加入洗涤液后要立即甩掉。然后再接着 加第2次。共洗涤3次。
资料仅供参考,不当之处，请联系改正。
资料仅供参考,不当之处，请联系改正。
比色
在酶联免疫分光光度计上依次 测定标准物各浓度和各样品490nm 处的OD值。
资料仅供参考,不当之处，请联系改正。
数据分析
用酶标仪进行比色，以0 ng/ml标准孔为空白孔， 在波长450nm处分别读取各标准孔和样本孔OD值， 以OD值为横坐标，“标样激素含量的对数”为纵坐 标，在半对数坐标纸上画出标准曲线，以测定孔的 OD值在标准曲线上查出待测样品的ABA含量的对数。 利用反对数求得ABA的绝对含量。
植物激素的检测方法
植物激素的检测方法摘要：植物激素是植物体内的微量信号分子，它们几乎调节着植物生长发育的所有过程，植物，植物激素的检测常用方法有关键词：植物激素的检测；生物试法；色谱检测法；免疫检测法1 植物激素的介绍植物激素是指植物细胞接受特定环境信号诱导产生的、低浓度时可调节植物生理反应的活性物质。
植物激素有六大类：即生长素（auxin）、赤霉素（GA）、细胞分裂素（CTK）、脱落酸（abscisic acid，ABA）、乙烯（ethyne，ETH）和油菜素甾醇（brassinosteroid，BR）。
它们都是些简单的小分子有机化合物，但它们的生理效应却非常复杂、多样。
2 植物激素检测方法研究2.1 生物试法生物试法是最早检测植物激素的方法，它是依据植物激素的生理活性，通过某些植物的组织或器官产生的特异性反应来进行检测。
1928年F W Went首先建立了检测植物生长素的燕麦芽鞘弯曲测试法,但方法复杂,若没有熟练的技巧,就很难取得准确的结果。
因此在1933年, Thimann K V 和J Bonner把这个方法改变了一下建立了燕麦叶鞘切断伸长法,简化了操作方法。
此后,随着ABA、CTK、GA等激素的逐一发现,相应的各类激素的测定方法也被广泛建立。
例如,小麦胚芽鞘切断抑制法检测ABA;烟草髓愈伤组织鉴定法和胡萝卜根愈伤组织鉴定法鉴定CTK;矮生豌豆法、大麦胚芽鉴定法和点滴法鉴定GAs等等[1]。
生物试法具有简便易行的特点，能够反应植物激素的生理活性，还可以鉴定新的植物激素和生理活性物质，因此至今仍然得到广泛的应用。
但其不足之处在于，植物体内往往存在许多激素分子的类似物、代谢物、拮抗物或其他干扰物质，从而影响生物试法的检测结果[2]。
此外还要尽量控制环境因子和使用的植物材料的均一性，以便检测结果的准确、可靠。
20世纪90年代Wout Boerjan[3]等建立的重组DNA技术定量检测生长素和细胞分裂素的方法可谓是这一领域的一个重要进展。
植物激素定量分析方法
(2) 固相萃取： 固相萃取(SPE)技术是一个包括液相和固相的物理 萃取过程, 其主要目的是把痕量被测定组分进行浓缩和富集. 固相 萃取柱用以保留目标化合物, 并尽量减少干扰杂质的保留, 选择合 适的溶剂将干扰杂质淋洗掉, 然后再用另一溶剂把感兴趣的分析物 从固定相上洗脱下来; 反之, 也可让目标化合物直接通过固定相而 不被保留, 同时大部分干扰物质被保留在固定相上, 从而得到分离. 与传统的液相萃取技术相比, 固相萃取不需要大量互不相溶的有机 溶剂, 可供选择的固定相种类较多, 具有快速、可靠、消耗试剂少 、易于实现自动化等优点, 能够对复杂基质样品中的目标化合物进 行纯化和富集,满足了人们对处理方法的高效、快捷、简单和低消 耗的要求, 被广泛用于植物激素类样品的处理.
电化学生物传感器利用具有生物活性的物质作为识别元件(识别元件所 用的生物活性物质主要有酶、微生物、动植物组织、抗体和核酸等), 通过特定反应使被测成分消耗或产生相应化学计量数的电活性物质, 电极上流过的电流或电极表面与溶液的电势差会随之发生变化, 从而 实现了特定物质的检测. 李春香等人提出了一种以绿豆芽叶片组织-二茂铁修饰的碳糊电极 (LFMCE)作为测定植物激素IAA 的组织生物传感器. 其基本原理是绿 豆芽叶片组织内含有一定量的IAA 氧化酶, 能够催化IAA 的氧化代谢, 而存在于植物组织内的IAA 氧化酶因原有生理环境, 稳定性较高, 可用 作修饰电极的敏感材料, 利用此修饰电极的氧化峰峰电流的升高来定 量测定IAA, 其中二茂铁起了电子传递媒介体的作用. 近年来, 受到生物科学、信息科学和材料科学发展成果的推动, 生物传 感器技术飞速发展. 其具有灵敏度高、检测速度快、操作简便、可进 行连续动态监测等优点, 但生物传感器的应用也同时受到稳定性、重 现性和使用寿命等诸多因素的限制, 在植物激素分析应用领域中一直 停留在方法学研究的阶段.
植物激素研究实验报告
一、实验背景植物激素是植物体内的一类微量有机化合物，它们在植物的生长发育、生殖和应激反应等过程中起着至关重要的调控作用。
为了深入了解植物激素的作用机制，本研究选取了生长素、细胞分裂素、赤霉素和脱落酸等四种常见的植物激素，通过实验探讨它们对植物生长发育的影响。
二、实验目的1. 观察不同植物激素对植物生长发育的影响。
2. 分析植物激素之间的相互作用及其在植物生长发育中的作用机制。
3. 为植物栽培和育种提供理论依据。
三、实验材料与方法1. 实验材料：水稻种子、番茄种子、黄瓜种子、花生种子、植物激素（生长素、细胞分裂素、赤霉素、脱落酸）。
2. 实验方法：（1）种子处理：将不同植物种子分别浸泡在含有不同浓度植物激素的溶液中，浸泡时间分别为24小时、48小时和72小时。
（2）发芽实验：将处理过的种子播种在发芽盒中，在适宜条件下进行发芽实验，观察种子发芽率、发芽时间和幼苗生长状况。
（3）生长实验：将发芽后的幼苗移栽到培养皿中，分别添加不同浓度的植物激素，观察植物的生长速度、叶片数量、植株高度和根系生长状况。
（4）数据分析：采用统计学方法对实验数据进行分析，比较不同植物激素对植物生长发育的影响。
四、实验结果与分析1. 生长素对植物生长发育的影响：（1）生长素浓度对水稻种子发芽率的影响：随着生长素浓度的增加，水稻种子发芽率呈先升高后降低的趋势，在生长素浓度为0.1mg/L时发芽率最高。
（2）生长素浓度对番茄幼苗生长的影响：生长素浓度对番茄幼苗的生长速度、叶片数量和植株高度有显著影响，生长素浓度为0.1mg/L时，番茄幼苗的生长状况最佳。
2. 细胞分裂素对植物生长发育的影响：（1）细胞分裂素浓度对黄瓜种子发芽率的影响：细胞分裂素浓度对黄瓜种子发芽率无显著影响。
（2）细胞分裂素浓度对花生幼苗生长的影响：细胞分裂素浓度对花生幼苗的生长速度、叶片数量和植株高度无显著影响。
3. 赤霉素对植物生长发育的影响：（1）赤霉素浓度对水稻种子发芽率的影响：赤霉素浓度对水稻种子发芽率无显著影响。
植物生长激素分析技术优质高效栽培技术
植物生长激素分析技术优质高效栽培技术植物生长激素是一类能够调控植物生长发育的天然化合物。
通过分析植物体内的生长激素含量，可以了解植物的生长状态以及生长环节中的调节机制，从而提高植物的生长和产量。
本文将介绍一种优质高效的植物生长激素分析技术，并探讨其在栽培技术中的应用。
一、植物生长激素分析技术概述植物生长激素主要包括赤霉素、生长素、脱落酸、玉米素等几类。
这些激素在植物生长发育过程中起着重要的调控作用。
因此，准确测定植物体内生长激素的含量对于了解植物的生长状态及调控机制非常重要。
目前，常用的植物生长激素分析技术主要包括气相色谱质谱联用（GC-MS）、高效液相色谱法（HPLC）、生物传感技术等。
其中，GC-MS具有高灵敏度、高分辨率和高选择性等优点，在植物内源激素的测定中被广泛应用。
二、植物生长激素分析技术的优势1. 高灵敏度：植物生长激素在植物体内的含量很低，因此需要一种高灵敏度的分析方法来测定其浓度。
GC-MS技术具有高灵敏度，可以达到ppb（10-9）到ppt（10-12）级别的检测限。
2. 高分辨率：植物生长激素种类繁多，其中一些结构非常相似。
GC-MS技术能够通过对植物样品进行分离和鉴定，准确测定各类生长激素的含量，并可以分析同分异构体。
3. 高选择性：GC-MS技术具有高选择性，可以排除植物体内其他物质对植物生长激素测定的干扰。
三、植物生长激素分析技术在栽培技术中的应用植物生长激素分析技术在现代农业的栽培技术中发挥着重要的作用。
通过准确测定植物内源激素的含量，可以指导农民合理施肥和植物生长的调控，提高作物产量和品质。
1. 调控植物生长：植物生长激素的含量与植物的生长状态密切相关。
通过分析植物体内激素的变化，可以调节植物的生长速度、促进植物的延伸生长或侧枝的分化等。
2. 促进开花结果：植物生长激素在植物的开花和结果过程中起着重要作用。
测定植物内源激素的含量，可以合理地施肥和调整水分、光照等环境因素，促进植物的开花和结果。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
植物激素测定方法述评鲁 哲,邹振华,路 婧,王若仲*(湖南农业大学植物激素与生长发育湖南省重点实验室,长沙410128)摘 要:分析了传统植物激素测定的方法,提出了新的技术发展下,对植物激素快速、原位实时、高灵敏、高通量检测的必要性,对植物激素测定方法的前沿技术做出分析,并初步探讨了植物激素测定技术的未来趋势。
关键词:植物激素;测定方法;原位实时;生物传感器中图分类号:Q94-331 文献标识码:A文章编号:1001-5280(2011)05-0531-04 DOI:10.3969/j.issn.1001-5280.2011.05.28Research Progress on Determination of PhytohormonesLU Zhe,ZOU Zhen-hua,LU Jing,WAN G Ruo-zhong*(Hunan Pr ov incial Key L abo rat or y o f Phyt ohor mo nes and G r ow th Develo pment,Hunan A g ricultural U niv ersit y,Chang sha,Hunan410128,China)Abstract:In this ar ticle,the tr aditional methods for deter mination o f phy toho rmo nes w er e analy zed,and the necessity of rapid,in situ real-t ime,hig h sensitivit y and hig h thro ughput detectio n of phy to ho rmo nes w as put fo rw ar ded under co nditio n of the development of new techniques.A t the sam e time,the fr ontier techniques fo r det erminat ion of phy toho rmo nes w er e a nalyzed,and t he developmental trend of determinatio n techniques o f phyt ohor mo nes w as discussed. Key words:P hyto hor mones;Det erminat ion metho d;Situ and r eal-time;Biosensor 植物激素是植物体内合成的对植物生长发育有显著作用的微量物质。
目前,植物激素有六大类,即生长素类(Auxins)、赤霉素类(GAs)、细胞分裂素类(CTKs)、脱落酸(abscisicacid,A BA)、乙烯(ethyne, ETH)和油菜素甾醇(Brassinosteroids,BR)[1]。
植物激素作为植物体内的微量信号分子,调节植物几乎所有的生长发育过程。
长期以来,植物激素与植物生长调节剂一直是生物学和农学领域的研究热点,其成果为农业科技进步做出了巨大的贡献。
例如,各种植物生长调节剂的广泛使用,已成为实现农作物高产优质的重要措施之一,在推动“绿色革命”、大幅度提高作物产量和保证国家粮食安全方面发挥了不可替代的作用[2]。
由于植物激素在植物体内含量极低(一般每克植物组织鲜样中的含量为1～100ng),易被光解、热解和氧化,因此,如何对微量植物激素进行简便、快速和准确的定量分析,一直是植物激素研究领域的难题之一。
近年 收稿日期:2011-03-23作者简介:鲁 哲(1984-),男,内蒙古赤峰人,硕士研究生。
*通讯作者。
基金项目:湖南省科研条件创新专项重点项目(2010T Y1004);教育部新世纪优秀人才支持计划项目(NCET-10-0143)。
来,随着功能基因组学、代谢组学(m etabolom ics)等整体性“组学”方法的提出以及生物学研究对活细胞单分子行为测定的日益关注,对植物激素等重要代谢调节物的测定技术提出了更高的要求。
同时植物激素的生理功能具有时空特异性,植物激素作用机理和信号转导等前沿领域更是迫切需要对微量植物样品的超微量植物激素进行高灵敏、原位、实时测定。
研究植物激素在植物组织或细胞中的分布特点及消长规律,目前常采用化学手段对内源激素水平进行检测,但测定结果的准确性较差[3],而且无法对激素进行定位研究,因为许多激素引起的很多生理反应常发生在激素受体分布的细胞器内[2],因此对植物激素的高灵敏、高通量、原位实时测定新技术提出了迫切要求。
传统植物激素和植物生长调节剂测定方法主要有以早期简单的小麦胚芽鞘切段伸长法为代表的生物测定法[4]、以气相色谱法[5](Gas Chro matography,GC)和高效液相色谱法[6](Hig h Performance Liquid Chr omatogr aphy,HPLC)为代表的理化测定法,及以酶联免疫吸附法[7](Enzy me Linked Immune sorbent Assays,ELISA)为代表的免疫测定法。
传统植物激素和植物生长调节剂测定方法各有优缺点,下面分别进行评述。
1 生物鉴定法生物鉴定法是最早使用的激素测定方法,它是利用激素作用于植株组织或器官后产生生理生化上的变化,通过该变化的大小推算植物激素含量的一种方法。
1928年,荷兰研究生Fritz Went在研究燕麦胚芽鞘弯曲程度与琼脂中生长素浓度的关系时,发现二者呈正相关,这种测定法后来被称为燕麦测试法[8]。
生物鉴定法虽然简单,对检测仪器要求不高,但是对样品纯度要求高,专一性和重复性较差,近年来已很少使用。
但对于从大量人工合成的化合物中筛选植物生长调节剂,生物鉴定法仍然是一种有效的植物激素定性分析方法[9]。
2 光谱及色谱检测法传统光谱法如比色法测定植物激素,由于专一性差,已较少使用[10]。
利用荧光技术与其它方法结合进行光谱测定的新方法成为光谱法检测植物激素的主流方法。
薛泉宏等[10]对以往的赤霉素荧光测定的方法进行了改进,该法适合于发酵液及固态产品中赤霉素的测定。
光谱测定植物激素法近年鲜有报道。
色谱法是利用不同物质在不同相态的选择性分配,以流动相对固定相中的混合物进行洗脱,混合物中不同的物质会以不同的速度沿固定相移动,最终达到分离的效果。
早期采用的色谱测定方法主要是纸层析(Paper Chromatog raphy,PPC)和薄层层析(T hin Layer Chro matogr aphy,TLC),先将植物样品通过层析进行分配再通过显色等方法进行鉴定。
这两种方法操作简便,所需设备简单,但是分离效率和灵敏度有限,因而现在已很少单独使用。
将薄层层析与高效液相色谱(HPLC)和酶联免疫吸附法(ELISA)等检测技术相结合可以有效地提高检测的灵敏度。
如李兆亮[11]等先用薄层层析纯化样品,然后利用HPLC定量分析植物叶片中的水杨酸的含量,获得了较理想的结果。
气相色谱和高效液相色谱是20世纪60年代开始应用于激素测定的技术,现在已经成为植物激素检测的主要方法。
气相色谱法是指以气体为流动相的色谱法。
气相色谱分析速度快,可用于分析测定所有的植物激素,但前提是待测激素必须形成易挥发的衍生物。
大部分植物激素都含有极性基团,沸点较高,因此在进行GC分析前必须制备成为合适的挥发性衍生物[12]。
已有一些衍生化方法被应用于植物激素分析。
如张有林等[13]用溴甲基五氟苯对ABA和IAA进行衍生、酯化,在气相色谱柱上分离效果良好,对电子检测器反应敏感,ABA和IAA的最小检测限各为10-12g/mL和10-13g/m L。
乙烯是以气态存在的植物激素,因而可以不经过衍生化直接用GC测定[14]。
此外,杜黎明等建立了一种530 m大口径毛细管气相色谱测定法,可以不经衍生化处理,直接进样[15]。
HPLC可用于除乙烯外的所有植物激素的分析检测,其结果准确性和灵敏度较高,且与GC相比前处理简单,对所测激素结构无破坏,因此已经成为植物激素测定的一种常用方法。
HPLC可以选用不同的检测器,如荧光检测器[16]、紫外检测器[17]等。
其中紫外检测器是一种较为常用的检测方法。
由于HPLC和GC在测定过程中对保留时间的分辨有一定限制,若前处理过程达不到所需纯度要求可能会出现几种化合物的保留时间相同或接近而影响测定结果的准确性。
将质谱(Mass Spectrog raphy,M S)技术与HPLC或GC联合使用[18～21],可以有效地提高检测的选择性和灵敏度,因此仪器联用是目前植物激素测定技术的发展趋势。
3 传统免疫检测法放射免疫分析(Radio immuno assay,RIA)和酶联免疫法(ELISA)是植物激素免疫测定传统方法。
放射免疫方法具有较高的灵敏度,但需要特殊的操作技术和实验室设备,不适于作为常规检测方法。
相对而言,酶联免疫吸附分析方法[22]应用更为广泛。
但ELISA在灵敏度上还不能完全满足实际样品检测的需要。
因此开发间接的ELISA法检测GA3,利用GA3～GA7免疫家兔得到的抗血清,建立了检测结合态GA3的间接酶联免疫吸附测定方法。
免疫抗原与包被抗原用最常见的DCC活化羧基与蛋白质相联,检测极限为12.3ng/ mL,线性范围12.3～1000ng/m L。
抗血清与GA3的交叉反应率为2.3%,与GA,IAA,ABA和zR的交叉反应率均很小[23]。
随着ELISA技术的发展,利用该技术测定各类农作物中植物激素在代谢中作用的实例日渐增多[24～27],并且获得了稳定的结果。
近期,有报道运用免疫层析技术和液相电喷雾质谱法结合的ABA检测方法,利用样品在免疫层析凝胶的高专一性和灵敏度使其成为一种新型方便、高效和灵敏的分离纯化方法[28]。
气相色谱法(GC)、高效液相色谱法(HPLC)、气-质联用(GC/M S)或液-质联用(LC/MS)、酶联免疫分析(ELISA)、放射免疫分析(RIA)等方法各有优点,但都存在操作繁冗、灵敏度不佳、结果重复性差、仪器昂贵或者易出现假阳性结果等缺陷。
因此,开发高灵敏、简单、快速的用于植物激素检测的方法非常紧迫。
4 生物传感器检测法生物传感器(biosensor)技术是将生物所具有的特性和电子装置相结合的一种技术,利用生物间特异的亲和作用将信号转换成能够被识别的装置。
生物传感器具有快速、实时、高度特异性和高灵敏度等优点,能够制备成用于快速现场检测的装置[29]。
按分子识别元件将生物传感器分为酶传感器、免疫(抗原或抗体)传感器、微生物传感器、组织传感器、细胞器传感器、核酸传感器、分子印迹传感器等[30]。