凝胶电泳法(SDS-PAGE)测定乳与乳制品中 β-乳球蛋白的含量

β-乳球蛋白标准品 牛奶平行样
奶粉平行样 奶酪平行样
图 1 5%分离胶分离效果
β-乳球蛋白标准品
牛奶平行样 奶粉平行样 奶酪平行样
图 2 12%分离胶分离效果
β-乳球蛋白标准品
牛奶平行样 奶粉平行样 奶酪平行样
图 3 15%分离胶分离效果
2 结果与分析
2.1 分离胶浓度的选择 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳有两种系统，即只
Han Yiyi, Huang Feifei, Wang Jianjun，Lv Chun
（Shanghai Dairy Products Quality Supervision and Inspection Center, Shanghai 200436, P. R. China）
Abstract: A rapid quantitative method for determination of β-lactoglobulin in milk and dairy products by SDS-PAGE electrophoresis has been developed. The method had good relativity (r=0.99) and good analytic precision (RSD<10 %), with the LOD of 24 mg/100mL in milk and 240 mg/100g in milk powder and cheese. This method is fast, simple, reliable，so it can be applied in the determination of β-lactoglobulin in milk and dairy products. Key words: β-lactoglobulin; SDS-PAGE electrophoresis; milk and dairy products
5 μL
25 μL
12 %分离胶 12 mL — 7.5 mL 300 μL 10 mL
20 μLБайду номын сангаас
200 μL
1.2.3 上样 将制备好的凝胶放入电泳槽中，并灌入新配
置的电极缓冲液。用微量进样器分别加入 β-乳球 蛋白标准溶液 2 μL 和试样 2 μL。 1.2.4 参考电泳条件
（恒电流）：浓缩胶中浓缩 30 mA；分离胶中分 离 30 mA。 1.2.5 染色及脱色
乳清蛋白主要由乳白蛋白、乳球蛋白组成， 乳白蛋白约占乳清蛋白的 68％，乳白蛋白还可细 分为：α-乳白蛋白约占乳清蛋白的 19.7%，β-乳 球蛋白约占乳清蛋白的 43.6%，血清白蛋白约占 乳清蛋白的 4.7%。有文献报道，β-乳球蛋白具有 降低胆固醇的功效，在酸性胃肠道内具有抗酸能 力，能够进入人体循环系统，容易被吸收。另外， β-乳球蛋白能够对脂溶性营养素如维生素 A 和 维生素 E 进行预结合，从而促进它们的吸收[1]。因 此被认为是多功能蛋白，在营养上的角色备受重 视。定量检测乳与乳制品中 β- 乳球蛋白的含量， 可以明示乳制品的营养价值，给予消费者以更好 的选择。
其他乳清蛋白和酪蛋白较好的分离效果。同时， 随着分离胶浓度的增大，β-乳球蛋白的迁移距离 越短，因此，在 β-乳球蛋白的迁移距离相同的情 况下，分离胶浓度越大，电泳时间也逐渐增加，考
虑到时间因素，我们认为 12%的分离胶浓度更加 适用于 β-乳球蛋白的检测。 2.2 电流的选择
对相同样品在 12%分离胶上分别在 10 mA、 15 mA、20 mA、30 mA 以及 60 mA 电流下进行电 泳，电泳时间与电流强度的比较表 3。
韩奕奕等：凝胶电泳法（SDS-PAGE）测定乳与乳制品中 β-乳球蛋白的含量
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RAD 公司）。 1.2 实验方法 1.2.1 样品制备
液体样品：取 1 mL 样品，依次加入 1 mL 水 和 2 mL 样品缓冲液，沸水浴加热 3-5 min，磁力 搅拌器搅拌 4 h，离心 5 min，去除脂肪，取清液分 装，在-20 ℃保存，备用。
凝胶用水清洗三次，浸泡在盛有考马斯亮蓝
染色液的器皿中，染色 12 h。染色后的凝胶用脱 色也浸泡脱色，至凝胶背景无色为止。用光密度 仪对凝胶进行测定分析，根据光密度值计算 β-乳 球蛋白的含量。
受到较大的阻力而被滞后，这样蛋白质在电泳过 程中就会根据其各自分子量的大小而被分离。因 此，采用不连续系统，对相同样品，相同电流下， 在 5%、12%、15%以及 20%的分离胶上进行电泳， 对分离效果进行了比较，见图 1-图 4。
图 4 20%分离胶分离效果
奶酪平行样
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《乳业科学与技术》 2009 年第 2 期 （总第 135 期）
通过图 1-图 4，可以看出，由于 5%的聚丙烯 酰胺凝胶对 β-乳球蛋白和其他乳清蛋白和酪蛋 白没有明显的阻碍作用，因此，5%的分离胶无法 将蛋白质分开；10%-20%浓度的凝胶具有较小的 孔径，对蛋白质能够起到分子筛的作用，因此与
按表 1 所示配制 12 ％分离胶及 3 %浓缩胶
表 1 不连续电泳的凝胶配方（垂直电泳）
贮液 丙烯酰胺单体贮备液 浓缩胶缓冲液贮备液 分离胶缓冲液贮备液 十二烷基磺酸钠溶液（10%）
水 N,N, N′,N′-四甲基乙二胺溶液
（TEMED） 过硫酸铵溶液/100g·L-1
3 %浓缩胶 2.5 mL 0.6 mL — 50 μL 1.82 mL
果。
详见表 4。
表 4 不同浓度的 β-乳球蛋白与光密度值的线性关系
浓度（/ mg·mL-1）
0.238 0.594 1.188 1.782 2.376 2.97
3.56 4.572 5.94 7.128
光密度值
0.253 0.346 0.544 0.66 1.104 1.25 1.552 1.944 2.586 3.116
2.5 确定检出限 根据限量要求，对 0.2376 mg/mL 的标准样品
（较接近于空白样品）20 个平行样进行电泳，得到 标准偏差，由 LOD=3×SD 得到检出限。液态奶中 为 24 mg/100mL，奶粉、奶酪中为 240 mg/100g。 2.6 实际样品的测定
改良考马斯亮蓝染色 1.75
2.04
1.81
1.95
1.75
1.98
1.77
1.89
1.94
9.3
传统考马斯亮蓝染色 2.05
2.14
2.14
1.76
1.74
1.84
2.15
1.74
1.87
8.0
由表 3 可以看出，同一样品使用不同的染色 2.4 标准曲线的建立
方法，得到的 β-乳球蛋白含量基本一致。综上所
目前 β-乳球蛋白常用的检测方法有高效液 相色谱法[2-3]和电泳法[4-8]，与液相方法相比，电泳 法具有成本低、操作简单，耗时短，重复性高等特 点。
收稿日期：2008-10-22
1 材料与方法
1.1 材料与仪器 30%丙烯酰胺单体贮备液、1 mol/L Tris-HCl
缓 冲 液 ，pH 6.8、1.5 mol/L Tris -HCl 缓 冲 液 ，pH 8.8、10%过硫酸铵、10%SDS 溶液、N,N, N’,N’-四 甲基乙二胺（TEMED）溶液；样品缓冲液（4 mg 溴 酚蓝，1.6 mL 1 mol/L Tris-HCl 缓冲液，pH 6.8，4 mL SDS 溶液，1.2 mL β-巯基乙醇，100％甘油 2.2 mL，全部混合后用水稀释定容至 20 mL）；
在考察染色时间、脱色时间、图像背景的同 时，对同一样品分别在两块凝胶上做 8 个平行 样，进行凝胶电泳，两块胶分别采用两种方法染 色，得到的 β-乳球蛋白含量如表 3。
表 3 同一样品使用不同染色方法得到 β-乳球蛋白含量
浓度（/ mg·mL-1）
1
2
3
4
5
6
7
8
平均值/
RSD
（mg·mL-1） /%
有分离胶的连续系统和有浓缩胶与分离胶的不 连续系统。在不连续系统中，样品在电泳过程中 首先通过浓缩胶，在进入分离胶前由于等速电泳 现象而被浓缩。进入分离胶后，由于聚丙烯酰胺 的分子筛作用，小分子的蛋白质可以容易的通过 凝胶孔径，阻力小，迁移速度快；大分子蛋白质则
β-乳球蛋白标准品
牛奶平行样 奶粉平行样
固体样品:称取 1 g 样品，精确到 0.1 mg，加 适量水溶解，定容至 10 mL，取 1 mL 依次加入 1 mL 水和 2 mL 样品缓冲液，沸水浴加热 3-5 min， 磁力搅拌器搅拌 4 h，离心 5 min，去除脂肪，取清 液分装，在-20 ℃保存，备用。 1.2.2 分离胶及浓缩胶制备
用 SDS -PAGE 测 定 β - 乳 球 蛋 白 的 标 准 溶
述，改良的考马斯亮蓝染色与传统考马斯亮染色 液，其测定结果表明 β-乳球蛋白的标准溶液与
相比，不仅使用低毒的有机试剂，缩短了脱色时 光密度值之间存在着较好的线性关系，相关系数
间，并且能达到与传统考马斯亮蓝染色的定量效 r 为 0.99，回归方程分别为 Y＝1.5452X-0.7139，
表 2 电流强度与电泳时间一览表（单胶）
电流/mA
10
15
20
30
60
耗时/min 180
90
70
60
30
通过上表可以看出，电流越大，电泳时间越
短；另一方面，当电流增加到 60 mA 时，可以明显
感觉到电泳中产生的热量，由于产生的热量会引
起介质温度升高，这会对分离效果造成潜在的影
响。综合考虑，我们选择 30 mA 的电流，既可快速 地进行电泳，又不会在电泳过程中产生大量的热
电极缓冲液 （Tris-甘氨酸系统：0.025 mol/L Tris，0.192 mol/L 甘氨酸，0.1 % SDS，pH 8.3）；
考马斯亮蓝染色液，2.5 g/L； β-乳球蛋白 1 标准品 （纯度≥90 %，SIGMA 公司）：精确称取 0.0100 g β-乳球蛋白标准品，用 样品缓冲液定容至 10 mL，沸水浴中加热 3-5 min，在-20 ℃以下保存；配制成相当浓度的系列 β-乳球蛋白标准溶液。 BIO-RAD 凝胶电 泳仪及光密 度 仪 （BIO -
中图分类号：TS252.1
文献标识码：A 文章编号：1671-5187(2009)02-0074-04
The Determination of β-lactoglobulin Content in Milk and Dairy Products by SDS-PAGE Electrophoresis
量。
2.3 染色剂的选择 SDS-聚丙烯酰胺凝胶常用的染色剂为考马
斯亮蓝 R-250，在进行电泳时使用两种方法进行 染色。2 种染色液的成分及操作如下：（1）传统考 马斯亮蓝染色法：清洗后的凝胶用染色液（45.4% 甲醇、4.6%乙酸、0.25%考马斯亮蓝 R-250） 着色 过夜，再经洗脱液（5%甲醇、7.5%乙酸）过夜脱色 至背景清晰。（2）改良考马斯亮蓝染色法：清洗后 的凝胶用染色液 （20%乙醇、10%磷酸、10%硫酸 铵、0.25%考马斯亮蓝 R-250）着色过夜，再经洗 脱液（5%甲醇、7.5%乙酸）脱色 3-4 次，即可背景 清晰。通过试验，我们发现使用传统的考马斯亮 蓝染色法，脱色时间较长，一般需要 1-2 d，需要 用到大量的有毒、易挥发的试剂，胶体颜色不易 脱去，在胶体背景处取 20 个点，光密度的平均值 为 0.00057，胶体背景较高。使用改良考马斯亮蓝 染色法，用低毒的乙醇代替甲醇，采用高酸、高离 子染色液，与蛋白质结合选择性高，脱色时间大 大缩短，只需要 3-4 h，在胶体背景处取 20 个点， 光密度的平均值为 0.00011，获得了背景清晰的 胶体。
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《乳业科学与技术》 2009 年第 2 期 （总第 135 期）
凝胶电泳法（SDS-PAGE）测定乳与乳制品中 β-乳球蛋白的含量
韩奕奕，黄菲菲，王建军，吕 春
（上海市乳品质量监督检验站，上海 200436）
摘 要：建立一种快速、准确测定乳与乳制品中 β-乳球蛋白含量的 SDS-PAGE 方法。β-乳球蛋白标准 溶液在 0.238-7.128 mg/L 范围内呈线性相关(r=0.99),具有良好的重复性（RSD<10 %），液态奶及奶粉的 检出限分别为 24 mg/100mL、240 mg/100g。通过对 β-乳球蛋白的重复性和灵敏度实验，表明 SDS-PAGE 方法具有操作简单、准确可靠的特点，适用于乳与乳制品中 β-乳球蛋白含量的测定。 关键词：β-乳球蛋白；凝胶电泳法；乳与乳制品