第7章 亲和层析
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36
EDTA(10mmol/L)用以稳定蛋白质中能被重金属催 2016/2/17 化氧化的－SH基。
3.柱操作
选用柱的大小依据a.吸附剂的容量；b.需要纯化
的蛋白质的量。
由于亲和原理，可分离的容量大。样品量可达 总体积只需1～5ml。
1 2
柱体积。为提高分离效率，一般选用粗、短柱。
若靶蛋白是较低的结合常数﹥10-4/M可用较长的 柱，结合较牢、结合常数＜10-13 /M则选用短柱。
欲分离物质与亲和吸附剂结合，当结合量较强 时，配体与有效成分紧密结合，随着样品的加入， 亲和成分恒定增加并不断地吸附上柱，形成致密 的复合物带，使吸附容量增至最大，达到饱和。 影响吸附容量除亲和力外和还与pH、离子强度有 关。例：P120
复合物带
2016/2/17
32
样品中有效成分 在亲和吸附剂上的 吸附量，除了与它
2016/2/17 14
第二节
一、理想基质的性质
1.
操作
结构是松散的多孔网络，利于大分子的流动与渗透；
2.
颗粒均匀的球形，刚性好,不易溶性，操作压的变化 不引起变形；
物理化学性质稳定； 化学性质是惰性，以降低非特异性的吸附； 带有丰富的化学基团易活化，以结合较多的配体；
3. 4. 5. 6. 7.
2016/2/17 37
4. 柱流速的控制
在概念上，亲和层析的流速比较快，要求不严格。
但为了使纯化的蛋白质能得到尖的洗脱峰和最小
的稀释度及最大的回收率。故上样品时使用低流
速。 A.太高的流速会降低分离效果和容量； B.用可溶性配体/类似物进行竞争性洗脱时，解离动 力学可能成为速率限制；
C.亲和柱的线性流速需进行优化达到最大的结合容
2016/2/17
7
■ 亲和层析法的作用机理：
X
A (1) B A (2) (3) A
Washing
Elution
Sample
B 亲和基团 配体
固相载体 2016/2/17
X
B
8
2016/2/17
9
特异性配体亲和层析法和通用性配体亲和层 析法：
方法 特异性配体亲和 层析法 配体 性能
复杂的生命大分子 具有较强的吸附选 物质（如抗体、受 择性和较大的结合 体和酶的类似底物 力 等）
亲和层析法
利用生物大分子和固定相表面存在某种特异性吸附而进行选 择性分离的一种生物大分子分离的层析方法。
亲和层析法的实质
是在载体(无机或有机填料)的表面先键和一种具有一般反应 性能的间隔臂,随后再连接配体（酶、抗原、激素等）组成固定 相,而固载的配体高选择地吸附与其有生物特性的大分子而被保 留,非特异的分子不被保留先流出层析柱,保留在柱上的分子将以 2016/2/17 6 纯品形态洗脱下来。
柱层析柱小 Vt＝1～1.5ml。 上样量大,达 1/2Vt体积并 对样品的浓度与纯度要求 不高。
操作简单,时间快速。 柱子填充载体昂贵,配体的 特异性,有时找不到适宜的 配体,不适合所有生物大分 11 子样品。
■ 典型的亲和层析操作：
Protein
Activity
pH 2.05
*
2016/2/17
2016/2/17 21
专一性结合的生物体系
常用配体
酶蛋白 抗 体
分离对象
基质类似物、抑制剂、辅酶、底物、产物等 抗原、病毒、细胞
多糖、糖蛋白、细胞表面受体、结合蛋白 互补碱基序列、组蛋白、核酸聚合酶、结合 蛋白 受体、载体蛋白
外源凝集素 核 酸
激素及维生素
2016/2/17
细
胞
细胞表面特异性蛋白、外源凝集素
2016/2/17
28
不同活化剂活化载体的偶联条件
活化载体 溴化氰活化载体 温度/℃ pH值 4 9.5 9.5 9.5 时间/h 24 24 30
环氧氯丙烷活化载体 40 1,4-丁二醚活化载体 45
2016/2/17
29
用溴化氰活化载体
2016/2/17
30
2016/2/17
31
四、特异性吸附
柱层析柱小 Vt＝1～1.5ml。 上样量大,达 1/2Vt体积并 对样品的浓度与纯度要求 不高。
操作简单,时间快速。 柱子填充载体昂贵,配体的 特异性,有时找不到适宜的 配体,不适合所有生物大分 13 子样品。
内容提要
第一节 基本原理 第二节 操作
第三节 提高吸附剂的操作容量
第四节 应用实例
2016/2/17
35
2.结合吸附条件
目标蛋白质对配体的特异性结合需要最适合的 pH、 缓冲液盐浓度、离子强度、温度。pH起着调节目 标蛋白质分子以及配体分子的电荷基团性质的作 用。
中等盐浓度（0.1～0.15mol/L NaCl）可以稳定溶 液中的蛋白质并防止非特异性的作用。
高盐浓度（2mol/L(NH4)2SO4）能特异性地提高配 体和靶蛋白的疏水作用。
2016/2/17
量和最佳的分离。
38
5.洗脱方法
2016/2/17
39
大体积的平衡缓冲液洗脱亲和力较小的分子； 亲和力稍大时，线性梯度、阶梯分步洗脱；
可改变pH、离子强度实现非特异性的竞争，解吸已结合 的分子；
对亲和力特别大的复合物，除用高浓度的可溶性配体洗 脱外，还需6mol/L盐酸胍、pH1.5，使复合物在合理的 时间内解离。并不破坏靶蛋白的天然构象及生物活性。 以及洗脱后的除盐。
载体的活化
配体的偶联
测定配体结合量，每mL或每g 载体束缚配体的量mg （mg/mL）。一般用直接法和 间接法测定。
2016/2/17
结合能力的测定
25
测定方法
活化剂种类
溴化氰（CNBr） 环氧氯丙烷 1,4-丁二醚 戊二醛 高碘酸盐
2016/2/17
26
常见几种活化剂的活化条件
其它实用性基质
多孔玻璃：不受微生物的侵蚀，对有机溶剂和缓冲液的 组成改变不敏感。保留表面含有羟基，在水溶液中显轻 微负性的表面电荷，对酸性蛋白，病毒，多糖或核酸没 有阻挡和吸附，而可以吸附所有的强碱性蛋白质和一些 中性蛋白质及病毒。
琼脂糖：商品为Sepharose 2B,4B,6B表示2，4和6％的 琼脂糖浓度的珠状凝胶。其化学性质的稳定性弱于葡聚 糖和聚丙烯酰胺，热稳定性差，在pH4－9的环境使用， 在一定浓度的酸碱不导致凝胶颗粒的变化，不被有机溶 剂（乙醇，丙酮）引起收缩，能经受高浓度变性剂而不 2016/2/17 17 改变其吸附性能，故实用性广。
们之间的亲和力有
密切关系外，还与 样品的pH值和离子 强度有关系。
2016/2/17
Baidu Nhomakorabea33
五、层析步骤
样品制备
选择配体
结合步骤
凝胶与配体偶联
装柱操作
流速控制
柱子平衡
洗脱方法
淋洗
洗脱目标样品
柱子再生
2016/2/17
34
1.样品制备
除去颗粒、细胞碎片、膜片段等； 样品的浓缩、除去蛋白酶及其抑制剂； 可以通过盐析方法沉淀杂蛋白或离子交换 层析法对样品进行预处理。
2016/2/17
3
内容提要
第一节 基本原理 第二节 操作
第三节 提高吸附剂的操作容量
第四节 应用实例
2016/2/17 4
第一节 基本原理
M L S
蛋白质2与配体无 生物学特异性
1
2
2016/2/17
5
亲和层析的概念
亲和力
根据生物体中高分子化合物能与之相对应的专一分子特异识 别和可逆结合的特征,将生物分子间的这种结合能力称为亲和力.
22
蛋白质亲和层析中的合适配体
配体
抗原
待纯化的蛋白质
特定单克隆抗体或多 克隆抗体 特定抗原 免疫球蛋白 蛋白酶 磷酸酶 脱氢酶、激酶、聚合 酶、限制酶、干扰素
配体
肝素
待纯化的蛋白质
凝聚因子、脂酶、结 缔组织蛋白酶、DNA聚 合酶 胆固醇受体、胆固醇 结合蛋白 脂肪酸结合蛋白、白 蛋白 核苷酸结合蛋白、需 核苷酸的酶 糖蛋白 糖蛋白
通用性配体亲和 层析法
2016/2/17
简单的小分子物质 成本低廉，具有较 （如金属、染料、 高的吸附容量，通 以及氨基酸等） 过改善吸附和脱附 条件可提高层析的 分辨率 10
亲和层析的特点：
条件温和:不影响样品的生 物活性,适合生物大分子的 操作。 纯化效率高:一步法分离和 纯化混合物中的样品,提纯 达几千倍,得到高纯度样品。 选择性强:依据生物学特异 性,而非物理化学性质分离 原理.故特异的层析图为2 个峰,第1个为杂峰,第2峰 2016/2/17 为纯品。
①用NaCl梯度洗脱特异的静电作用结合的蛋白质； ②疏水结合的复合物，加入乙二醇降低水溶液的极性；
第七章
亲和层析
Affinity chromatography
2016/2/17
1
技术背景
一般纯化蛋白质、核酸等大分子物质的方
法的主要依据是，各种大分子之间理化特 性的差异性。
如果这种差异性较小，要得到一种纯度稍
高的物质，常常需要进行多次繁琐的操作， 耗费较长的时间，但最终收得率却是很低。
2016/2/17 2
活化剂 溴化氰 温度/℃ 4 pH值 10 13 13 时间/min 10-30 120 120
环氧氯丙烷 45-56 1,4-丁二醚 50
2016/2/17
27
载体的偶联条件
pH：最佳pH在8-10之间 缓冲溶液：碳酸氢钠、硼酸盐，不能用Tris和其他
含氨基的缓冲液
温度和时间
偶联配体浓度：每毫升凝胶选用配体1-20umoL
2.配体的分类
单特异性配体：只结合一个或很小数量的蛋白质，识别 小分子的局限性强，甾体激素和酶抑制剂属于此类配体。 大分子单特异性配体：抗体－抗原结合是大分子单特异 性配体及其目的蛋白的最重要的例证。 组特异性配体（通用性配体）：是指一类像辅酶、维生 素/辅因子或它们的类似物，它们可以同几种不同蛋白 的共同位点相结合。是识别一类小分子物质的配体。 大分子组特异性配体:是识别一类大分子物质的配体。 凝集素和一些免疫球蛋白结合蛋白、伴刀豆球蛋白与糖 蛋白结合等。
物大分子之间的亲和力。
2016/2/17
19
配体的选择
固定在固相载体上的配体具有与目的蛋白能够选 择性地结合并形成稳定复合物的能力。 复合物的稳定性取决于配体与蛋白质结合位点之 间结合的紧密程度。 足够强的结合要求配体能够精确的嵌合在结合位 点内。 解离常数的范围在10-5～10-8/M时适合于亲和层析 过程。当解离常数﹥10-3 时，配体与蛋白质的 结合力较弱，在层析过程中拉不牢目的蛋白，选 择性过低;当解离常数 ＜10-15 时，亲和力太大， 洗脱时得用激烈的和苛刻的、甚至是变性的条件。 2016/2/17 20 这对分离生物活性样品是忌讳的。
高度亲水性，易与水溶液中的生物大分子结合；
抗微生物和酶的侵蚀。
15
2016/2/17
具有实用价值的基质
纤维素：用于抗体与酶的纯化，如分离酪氨酸酶，酪 氨酸酶的抑制剂连接到纤维素上，一步将酶纯化几百 倍。 但其纤维性及非均一性限制了大分子的渗入;有非 专一性吸附。 葡聚糖凝胶：良好的化学及物理稳定性，多孔性的结 构利于生物大分子的分离。但其膨胀度变化大，应用 受限制。 聚丙烯酰胺凝胶：物理化学性质稳定，抗微生物侵蚀 , 可提供很多供化学反应的酰胺基，提高配基的浓度。 适合于配基和亲和物之间亲和力较弱的系统。但不易 2016/2/17 16 引入间隔臂，受到限制。
单克隆抗体 蛋白质A/蛋白 质G 蛋白酶抑制剂 磷酸 三嗪染料
胆固醇 脂肪酸 核苷酸 苯基硼酸 盐 凝集素
抗生物素蛋白 2016/2/17
含生物素的酶
糖
凝集素、糖苷酶
23
2016/2/17
24
三、亲和吸附剂的制备
一般用CNBr衍生载体的功能基 团，产生的亲电基团可以同配 体的亲核基团（-NH2,-SH，－ OH）反应。或者相反。 用物理与化学的方法把配体偶 联到基质上。化学偶联法是通 过配体对活化的载体材料进行 亲核攻击实现的.
Elution volume
12
亲和层析的特点：
条件温和:不影响样品的生 物活性,适合生物大分子的 操作 纯化效率高:一步法分离和 纯化混合物中的样品,提纯 达几千倍,得到高纯度样品 选择性强:依据生物学特异 性,而非物理化学性质分离 原理.故特异的层析图为2 个峰,第1个为杂峰,第2峰 2016/2/17 为纯品
二、配基（配体）的选择
任何大分子或小分子蛋白、核酸（或其他分 子）有特异结合的都可以作为配体；配体是 有一定局限性，只能特异性地与某一种物质 结合，而这种结合是可逆的，利用此性质可 提取、纯化与配体特异结合的物质。
2016/2/17
18
1.配体的选择
优良的配体必须具备两个条件：
配体与生物大分子具有合适的亲和力; 配体具有与载体牢固地结合,又不影响与生
EDTA(10mmol/L)用以稳定蛋白质中能被重金属催 2016/2/17 化氧化的－SH基。
3.柱操作
选用柱的大小依据a.吸附剂的容量；b.需要纯化
的蛋白质的量。
由于亲和原理，可分离的容量大。样品量可达 总体积只需1～5ml。
1 2
柱体积。为提高分离效率，一般选用粗、短柱。
若靶蛋白是较低的结合常数﹥10-4/M可用较长的 柱，结合较牢、结合常数＜10-13 /M则选用短柱。
欲分离物质与亲和吸附剂结合，当结合量较强 时，配体与有效成分紧密结合，随着样品的加入， 亲和成分恒定增加并不断地吸附上柱，形成致密 的复合物带，使吸附容量增至最大，达到饱和。 影响吸附容量除亲和力外和还与pH、离子强度有 关。例：P120
复合物带
2016/2/17
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样品中有效成分 在亲和吸附剂上的 吸附量，除了与它
2016/2/17 14
第二节
一、理想基质的性质
1.
操作
结构是松散的多孔网络，利于大分子的流动与渗透；
2.
颗粒均匀的球形，刚性好,不易溶性，操作压的变化 不引起变形；
物理化学性质稳定； 化学性质是惰性，以降低非特异性的吸附； 带有丰富的化学基团易活化，以结合较多的配体；
3. 4. 5. 6. 7.
2016/2/17 37
4. 柱流速的控制
在概念上，亲和层析的流速比较快，要求不严格。
但为了使纯化的蛋白质能得到尖的洗脱峰和最小
的稀释度及最大的回收率。故上样品时使用低流
速。 A.太高的流速会降低分离效果和容量； B.用可溶性配体/类似物进行竞争性洗脱时，解离动 力学可能成为速率限制；
C.亲和柱的线性流速需进行优化达到最大的结合容
2016/2/17
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■ 亲和层析法的作用机理：
X
A (1) B A (2) (3) A
Washing
Elution
Sample
B 亲和基团 配体
固相载体 2016/2/17
X
B
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特异性配体亲和层析法和通用性配体亲和层 析法：
方法 特异性配体亲和 层析法 配体 性能
复杂的生命大分子 具有较强的吸附选 物质（如抗体、受 择性和较大的结合 体和酶的类似底物 力 等）
亲和层析法
利用生物大分子和固定相表面存在某种特异性吸附而进行选 择性分离的一种生物大分子分离的层析方法。
亲和层析法的实质
是在载体(无机或有机填料)的表面先键和一种具有一般反应 性能的间隔臂,随后再连接配体（酶、抗原、激素等）组成固定 相,而固载的配体高选择地吸附与其有生物特性的大分子而被保 留,非特异的分子不被保留先流出层析柱,保留在柱上的分子将以 2016/2/17 6 纯品形态洗脱下来。
柱层析柱小 Vt＝1～1.5ml。 上样量大,达 1/2Vt体积并 对样品的浓度与纯度要求 不高。
操作简单,时间快速。 柱子填充载体昂贵,配体的 特异性,有时找不到适宜的 配体,不适合所有生物大分 11 子样品。
■ 典型的亲和层析操作：
Protein
Activity
pH 2.05
*
2016/2/17
2016/2/17 21
专一性结合的生物体系
常用配体
酶蛋白 抗 体
分离对象
基质类似物、抑制剂、辅酶、底物、产物等 抗原、病毒、细胞
多糖、糖蛋白、细胞表面受体、结合蛋白 互补碱基序列、组蛋白、核酸聚合酶、结合 蛋白 受体、载体蛋白
外源凝集素 核 酸
激素及维生素
2016/2/17
细
胞
细胞表面特异性蛋白、外源凝集素
2016/2/17
28
不同活化剂活化载体的偶联条件
活化载体 溴化氰活化载体 温度/℃ pH值 4 9.5 9.5 9.5 时间/h 24 24 30
环氧氯丙烷活化载体 40 1,4-丁二醚活化载体 45
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用溴化氰活化载体
2016/2/17
30
2016/2/17
31
四、特异性吸附
柱层析柱小 Vt＝1～1.5ml。 上样量大,达 1/2Vt体积并 对样品的浓度与纯度要求 不高。
操作简单,时间快速。 柱子填充载体昂贵,配体的 特异性,有时找不到适宜的 配体,不适合所有生物大分 13 子样品。
内容提要
第一节 基本原理 第二节 操作
第三节 提高吸附剂的操作容量
第四节 应用实例
2016/2/17
35
2.结合吸附条件
目标蛋白质对配体的特异性结合需要最适合的 pH、 缓冲液盐浓度、离子强度、温度。pH起着调节目 标蛋白质分子以及配体分子的电荷基团性质的作 用。
中等盐浓度（0.1～0.15mol/L NaCl）可以稳定溶 液中的蛋白质并防止非特异性的作用。
高盐浓度（2mol/L(NH4)2SO4）能特异性地提高配 体和靶蛋白的疏水作用。
2016/2/17
量和最佳的分离。
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5.洗脱方法
2016/2/17
39
大体积的平衡缓冲液洗脱亲和力较小的分子； 亲和力稍大时，线性梯度、阶梯分步洗脱；
可改变pH、离子强度实现非特异性的竞争，解吸已结合 的分子；
对亲和力特别大的复合物，除用高浓度的可溶性配体洗 脱外，还需6mol/L盐酸胍、pH1.5，使复合物在合理的 时间内解离。并不破坏靶蛋白的天然构象及生物活性。 以及洗脱后的除盐。
载体的活化
配体的偶联
测定配体结合量，每mL或每g 载体束缚配体的量mg （mg/mL）。一般用直接法和 间接法测定。
2016/2/17
结合能力的测定
25
测定方法
活化剂种类
溴化氰（CNBr） 环氧氯丙烷 1,4-丁二醚 戊二醛 高碘酸盐
2016/2/17
26
常见几种活化剂的活化条件
其它实用性基质
多孔玻璃：不受微生物的侵蚀，对有机溶剂和缓冲液的 组成改变不敏感。保留表面含有羟基，在水溶液中显轻 微负性的表面电荷，对酸性蛋白，病毒，多糖或核酸没 有阻挡和吸附，而可以吸附所有的强碱性蛋白质和一些 中性蛋白质及病毒。
琼脂糖：商品为Sepharose 2B,4B,6B表示2，4和6％的 琼脂糖浓度的珠状凝胶。其化学性质的稳定性弱于葡聚 糖和聚丙烯酰胺，热稳定性差，在pH4－9的环境使用， 在一定浓度的酸碱不导致凝胶颗粒的变化，不被有机溶 剂（乙醇，丙酮）引起收缩，能经受高浓度变性剂而不 2016/2/17 17 改变其吸附性能，故实用性广。
们之间的亲和力有
密切关系外，还与 样品的pH值和离子 强度有关系。
2016/2/17
Baidu Nhomakorabea33
五、层析步骤
样品制备
选择配体
结合步骤
凝胶与配体偶联
装柱操作
流速控制
柱子平衡
洗脱方法
淋洗
洗脱目标样品
柱子再生
2016/2/17
34
1.样品制备
除去颗粒、细胞碎片、膜片段等； 样品的浓缩、除去蛋白酶及其抑制剂； 可以通过盐析方法沉淀杂蛋白或离子交换 层析法对样品进行预处理。
2016/2/17
3
内容提要
第一节 基本原理 第二节 操作
第三节 提高吸附剂的操作容量
第四节 应用实例
2016/2/17 4
第一节 基本原理
M L S
蛋白质2与配体无 生物学特异性
1
2
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5
亲和层析的概念
亲和力
根据生物体中高分子化合物能与之相对应的专一分子特异识 别和可逆结合的特征,将生物分子间的这种结合能力称为亲和力.
22
蛋白质亲和层析中的合适配体
配体
抗原
待纯化的蛋白质
特定单克隆抗体或多 克隆抗体 特定抗原 免疫球蛋白 蛋白酶 磷酸酶 脱氢酶、激酶、聚合 酶、限制酶、干扰素
配体
肝素
待纯化的蛋白质
凝聚因子、脂酶、结 缔组织蛋白酶、DNA聚 合酶 胆固醇受体、胆固醇 结合蛋白 脂肪酸结合蛋白、白 蛋白 核苷酸结合蛋白、需 核苷酸的酶 糖蛋白 糖蛋白
通用性配体亲和 层析法
2016/2/17
简单的小分子物质 成本低廉，具有较 （如金属、染料、 高的吸附容量，通 以及氨基酸等） 过改善吸附和脱附 条件可提高层析的 分辨率 10
亲和层析的特点：
条件温和:不影响样品的生 物活性,适合生物大分子的 操作。 纯化效率高:一步法分离和 纯化混合物中的样品,提纯 达几千倍,得到高纯度样品。 选择性强:依据生物学特异 性,而非物理化学性质分离 原理.故特异的层析图为2 个峰,第1个为杂峰,第2峰 2016/2/17 为纯品。
①用NaCl梯度洗脱特异的静电作用结合的蛋白质； ②疏水结合的复合物，加入乙二醇降低水溶液的极性；
第七章
亲和层析
Affinity chromatography
2016/2/17
1
技术背景
一般纯化蛋白质、核酸等大分子物质的方
法的主要依据是，各种大分子之间理化特 性的差异性。
如果这种差异性较小，要得到一种纯度稍
高的物质，常常需要进行多次繁琐的操作， 耗费较长的时间，但最终收得率却是很低。
2016/2/17 2
活化剂 溴化氰 温度/℃ 4 pH值 10 13 13 时间/min 10-30 120 120
环氧氯丙烷 45-56 1,4-丁二醚 50
2016/2/17
27
载体的偶联条件
pH：最佳pH在8-10之间 缓冲溶液：碳酸氢钠、硼酸盐，不能用Tris和其他
含氨基的缓冲液
温度和时间
偶联配体浓度：每毫升凝胶选用配体1-20umoL
2.配体的分类
单特异性配体：只结合一个或很小数量的蛋白质，识别 小分子的局限性强，甾体激素和酶抑制剂属于此类配体。 大分子单特异性配体：抗体－抗原结合是大分子单特异 性配体及其目的蛋白的最重要的例证。 组特异性配体（通用性配体）：是指一类像辅酶、维生 素/辅因子或它们的类似物，它们可以同几种不同蛋白 的共同位点相结合。是识别一类小分子物质的配体。 大分子组特异性配体:是识别一类大分子物质的配体。 凝集素和一些免疫球蛋白结合蛋白、伴刀豆球蛋白与糖 蛋白结合等。
物大分子之间的亲和力。
2016/2/17
19
配体的选择
固定在固相载体上的配体具有与目的蛋白能够选 择性地结合并形成稳定复合物的能力。 复合物的稳定性取决于配体与蛋白质结合位点之 间结合的紧密程度。 足够强的结合要求配体能够精确的嵌合在结合位 点内。 解离常数的范围在10-5～10-8/M时适合于亲和层析 过程。当解离常数﹥10-3 时，配体与蛋白质的 结合力较弱，在层析过程中拉不牢目的蛋白，选 择性过低;当解离常数 ＜10-15 时，亲和力太大， 洗脱时得用激烈的和苛刻的、甚至是变性的条件。 2016/2/17 20 这对分离生物活性样品是忌讳的。
高度亲水性，易与水溶液中的生物大分子结合；
抗微生物和酶的侵蚀。
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具有实用价值的基质
纤维素：用于抗体与酶的纯化，如分离酪氨酸酶，酪 氨酸酶的抑制剂连接到纤维素上，一步将酶纯化几百 倍。 但其纤维性及非均一性限制了大分子的渗入;有非 专一性吸附。 葡聚糖凝胶：良好的化学及物理稳定性，多孔性的结 构利于生物大分子的分离。但其膨胀度变化大，应用 受限制。 聚丙烯酰胺凝胶：物理化学性质稳定，抗微生物侵蚀 , 可提供很多供化学反应的酰胺基，提高配基的浓度。 适合于配基和亲和物之间亲和力较弱的系统。但不易 2016/2/17 16 引入间隔臂，受到限制。
单克隆抗体 蛋白质A/蛋白 质G 蛋白酶抑制剂 磷酸 三嗪染料
胆固醇 脂肪酸 核苷酸 苯基硼酸 盐 凝集素
抗生物素蛋白 2016/2/17
含生物素的酶
糖
凝集素、糖苷酶
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三、亲和吸附剂的制备
一般用CNBr衍生载体的功能基 团，产生的亲电基团可以同配 体的亲核基团（-NH2,-SH，－ OH）反应。或者相反。 用物理与化学的方法把配体偶 联到基质上。化学偶联法是通 过配体对活化的载体材料进行 亲核攻击实现的.
Elution volume
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亲和层析的特点：
条件温和:不影响样品的生 物活性,适合生物大分子的 操作 纯化效率高:一步法分离和 纯化混合物中的样品,提纯 达几千倍,得到高纯度样品 选择性强:依据生物学特异 性,而非物理化学性质分离 原理.故特异的层析图为2 个峰,第1个为杂峰,第2峰 2016/2/17 为纯品
二、配基（配体）的选择
任何大分子或小分子蛋白、核酸（或其他分 子）有特异结合的都可以作为配体；配体是 有一定局限性，只能特异性地与某一种物质 结合，而这种结合是可逆的，利用此性质可 提取、纯化与配体特异结合的物质。
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1.配体的选择
优良的配体必须具备两个条件：
配体与生物大分子具有合适的亲和力; 配体具有与载体牢固地结合,又不影响与生