兽用疫苗生产与检验技术

病毒细胞培养的营养需求 1）无机离子 维持渗透压、提供细胞酶与代谢活动所需 要的物质，促进细胞贴壁等。常用弱碳酸氢盐来调节培养 液的pH值，培养液的pH值一般维持在7.2-7.4。 2) 碳水化合物 常用的碳水化合物是葡萄糖。有些复杂 的培养基，还需添加其它糖类或简单的化合物如乳酸、丙 酮酸及醋酸，或代替葡萄糖。 3) 氨基酸 细胞培养所用的氨基酸为左旋异构体。维持 细胞生长的最低营养要求需要以下13种氨基酸。

2） 二倍体细胞株 原代细胞→次代细胞→多次连续传代 成为二倍体细胞。二倍体细胞的细胞形态学可能发生变化， 但细胞染色体数与原代细胞一样。不能在体外无限制传代， 从几代至几十代，兼有原代细胞和传代细胞的优点，病毒 对其易感，质量可控，适用于繁殖病毒。 3）传代细胞系 由肿瘤组织培养而成或由细胞株转化而 来。可在体外无限制的传代，其染色体数不正常，成为异 倍体。适宜于许多动物病毒的生长，易于培养，可以建立 种子库，质量易控制。但存在潜在的致瘤性，要求背景情 况应详细，并作系统鉴定合格后，方可用于繁殖病毒生产 灭活疫苗。

生产种子应作纯粹检查。病毒生产种子应作含量测定和纯净检查。

菌种的选育 分离病原→纯粹检验→致病性鉴定和 抗原性测定→设计制成灭活疫苗→接种实验室动物 →攻毒→用本动物进行保护率测定→以确定疫苗候 选株。
毒种的选育 弱毒毒种有天然弱毒株或人工致弱毒 株；强毒毒株分离→系统鉴定（无污染、毒力强而 稳定、免疫原性好、抗原谱广、与流行毒血清型相 符）→疫苗候选株。

病原保护性抗原基因序列→插入另一 种无毒或弱毒的微生物基因组→表达 →构建重组活载体疫苗株。可以同时 表达多种抗原，制成多价或多联疫苗， 毒力不返强。
病原保护性抗原基因→连接细菌
或病毒DNA
达抗原→诱导产生免疫保护。制造 简便、成本低、安全、免疫期长、热 稳定性好，但仍未商品化生产。
→直接导入动物体→表


3）悬浮培养 在悬浮培养罐中通过不断搅拌，并随时补 充营养液和校正pH值，使细胞在悬浮的条件下培养生长。 由于悬浮培养细胞能及时得到充足的营养和养气，细胞生 长速度快，产量高，可以得到大量的细胞。 4）微载体培养 通过搅拌使微载体悬浮在培养液中，细 胞通过贴附在微载体固体颗粒表面上生长形成细胞单层， 细胞的浓度较大、生长快。微载体培养可采用通气搅拌法， 也可采用转瓶培养法进行。
1)强毒(菌)或弱毒（菌）→培养→ 灭活或加热→纯化或浓缩→佐剂或防腐 剂。 2)灭活的毒素或提取的亚单位或 rDNA产生亚单位。 灭活疫苗稳定、安全，便于运输和 保存，易于提纯纯化和制备多价、多联 苗。但用量较大、接种次数多、免疫力 产生慢、注射困难、注射局部可能有反 应等。
1）致弱的弱毒（菌、虫）株 动物、 组织、细胞、鸡胚或培养基→培养→降 低毒力、保留免疫原性→筛选。 2）自然弱（无）毒（菌、虫）株。 3）异种毒（菌、虫）株。 4）基因工程改造弱毒株。 活疫苗对原宿主动物无致病性或引起 亚临床感染，能产生主动免疫力，用量少、 成本低、免疫力产生快、免疫期长。但可 能存在不安全风险。


冷冻真空干燥法 冻干的菌种一般在2—8C保存；冻 干的毒种一般在-20C以下保存，温度越低保存期越长。 结冻保存 有些病毒可用含毒组织在低温条件下（20C以下）。 液氮保存 有些细胞结合毒须在－196C的液氮中保存。 虫种一般通过动物继代保存。 动物继代保存



生产检验用菌（毒）种实行分级管理制度，种子分 三级（原种、基础种子和生产种子）。 原种和由国家兽医微生物菌种保藏中心或分中心负 责保管；基础种子由菌种中心或分中心负责制备、 鉴定、保管和供应；生产种子由生产企业自行制备、 鉴定和保管。

1、常规免疫—血清学诊断技术 （1）凝集试验抗原： 直接凝集试验（平板法、试管法）：抗原和 抗体混合后直接发生凝集反应。 间接凝集试验（间接血凝、胶乳凝集和反相 间接血凝试验）。

（2）免疫沉淀试验抗原：包括试管沉淀法、单相免疫扩 散试验和双相免疫扩散试验、免疫电泳、对流免疫电泳等。 （3）中和试验：将特异性血清与相应病原混合，用血 清—病毒混合物接种靶动物、鸡胚或细胞培养，观察感染 情况进行疾病诊断。 （4）补体结合试验抗原：抗原抗体复合物可以激活补体， 出现各种生物学反应。


有些细菌特别是初次分离培养，在含有5％－10％CO2环境下生 长良好，培养时，可直接利用二氧化碳培养箱培养，按照需要 调节培养箱内二氧化碳的浓度。 在没有条件的实验室，简便的做法是用有盖玻璃容器，放入接 种的培养物后，点燃蜡烛，加盖密闭容器，由于燃烧耗氧产生 二氧化碳，蜡烛即熄灭。此时容器内含有较高浓度的二氧化碳， 将容器放入适宜温度培养。






1、抗血清：用抗原多次免疫动物，提取血清制成，用于 治疗或预防动物疾病。 2、微生态制剂：含活菌的制剂，具有调节机体菌群、增 强免疫力、促生长等。 3、卵黄抗体：用抗原多次免疫禽类，提取卵黄抗体制成， 用于治疗或预防动物疾病。 4、干扰素：用病毒等诱导产生干扰素。 5、转移因子：用动物脏器或组织提取制成，作为非特异 性免疫调节剂，增强机体免疫力，提高生产性能。

（一）兽用灭活疫苗的制备技术 灭活疫苗是用菌（毒）种培养物或含毒组织 或细胞培养物，经化学灭活剂灭活或加热处理， 使微生物失去活性而保持免疫原性，再加入适当
的防腐剂或加入免疫佐剂制成。

1.1、菌（毒）种标准 历史清楚；


生物学性状明显；
遗传稳定； 优良的免疫原性与反应原性； 毒力在规定的范围内。



供应：菌种中心及分中心统一供应。 索取：须持有相应级别机构出具的正式公函，说明 菌种名称、型别、数量及用途。一、二类菌种时， 必须由省（市、自治区）兽医行政主管部门审核， 农业部批准后，方可供应。有产品批准文号者，可 由生产企业直接向菌种中心或分中心领取。 要求：其他任何单位不得转发生产用菌（毒）种。 烈性传染病或人畜共患传染病的强毒菌（毒）种， 必须有专职技术人员领取。

原种
细菌原种应规定其培养特性、生化特性、血清学特性、毒力和
免疫原性等，并作纯粹检查。病毒原种应规定其生物学特性、理化特 性、血清学特性、最小感染量、最小免疫量、安全性等，并纯粹。

基础种子 基础种子由原种制备而来，基础种子为企业生产兽用生物
制品提供种子来源，应作系统鉴定，并规定代次。 生产种子 生产种子由生产企业用基础种子进行复壮、繁殖。细菌等



4) 维生素 大部分维生素与细胞代谢有关。使用较多的 维生素主要是B族维生素，复杂的培养液中还含有还原剂、 谷胱甘肽、抗坏血酸及L－半胱氨酸。在不含血清的培养 液中，常含有脂溶性维生素。 5) 蛋白质 动物血清是蛋白质的主要来源，常用的有胎牛 血清或犊牛血清。血清起营养作用，保护细胞或去毒，抑 制蛋白溶解酶，促进细胞在玻璃上附着和铺开。 6）抗生素 控制细胞培养中细菌的污染，常用的抗生素 有青霉素、链霉素、制霉菌素或两性霉素B。



（5）酶联免疫吸附试验（ELISA）：包括直接法、间接法、 双抗体夹心、竞争ELISA等。 （6）荧光抗体染色技术：直接法、间接法、竞争法等。 （7）胶体金免疫检测技术。 （8）免疫组化诊断试剂。


（1）生物技术：单克隆抗体技术（荧光抗体染色技术或 酶联免疫染色技术）。 （2）分子生物学技术。 PCR（RT－PCR）扩增技术。 荧光定量PCR（RT－PCR）。 基于核酸序列扩增技术（NASBA）。 核酸探针。


1.2.1 细菌培养技术 细菌的繁殖是以二分裂法进行，分四个时期：迟 缓期（细菌处于静止适应状态）；对数增殖期 （以恒定的速度增殖）；稳定期（细菌增加数与 死亡数保存平衡）；衰退期（活菌数下降）。
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需氧菌的培养 平板培养法 有平板划线培养法和倾注培养法。 需氧芽孢菌的培养 将接种材料先接种于液体培养 基中，臵水浴加入至80C，维持15－20分钟，以杀 死非芽孢菌，然后在37C作增菌培养。 抑菌分离培养 利用某些化学药品对某类细菌的抑 制或杀灭作用，而对另一些细菌不生产明显的作用， 来分离培养某些细菌。 接种试验动物进行培养。


1）静止培养 静止培养是指将制备好的细胞悬液分装在 适宜的培养瓶中，密闭瓶口，臵恒温培养箱内静止培养或 以松口的容器通入二氧化碳或在含二氧化碳的培养箱中静 止培养，形成细胞单层后，接种病毒悬液，37－38C左右 继续培养。 2）转动培养 将制备好的细胞悬液分装在玻璃或塑料转 瓶中，密闭瓶口，臵转瓶机上，以每小时5－10转转动培 养，细胞在转动培养时，贴附于瓶壁四周，长成细胞单层 后，接种病毒悬液，37－38C左右继续转动培养。
兽用生物制品系指用天然或人工改造的微生物 （细菌、病毒、衣原体、钩端螺旋体等）及其代谢产 物、寄生虫、动物血液或组织等为原材料，采用生物 学、分子生物学或生物化学等相应技术制成的生物制 剂，用于预防、治疗或诊断畜禽疫病。 1、按照性质和制造方法 疫（菌）苗、类毒素、 抗血清、诊断制剂和微生态制剂等。 2、按照作用与用途 预防、诊断和治疗用生物制 品。
1）微生物→物理和化学方法→ 提取有效抗原成分。 2）病原→基因工程技术→保护 性抗原基因序列插入合适的表达质 粒→高效稳定表达→生产抗原→亚 单位疫苗。

用化学方法人工合成多肽作为抗原。 纯度高、稳定，但只能线性表达，不 能折叠，免疫原性较差。
病原体→基因工程方法→缺失致 病性基因或非必要糖蛋白→保持免疫 原性→降低致病性。疫苗毒力不易恢 复，稳定性好，可配合鉴别诊断方法， 区别免疫动物和自然感染动物。
将细菌、病毒、寄生虫等接种于特殊基质进行培 养，收获其抗原单位或亚单位，或用人工合成的抗原单位 或亚单位制备而成的活的或灭活的、具有特异性和免疫原 性的生物制品，用于预防靶动物的疾病。 预防用兽用生物制品包括：灭活疫苗、活疫苗、重 组亚单位疫苗、合成肽疫苗、基因缺失疫苗、重组活载体 疫苗和核酸（DNA）疫苗。


厌氧菌的培养 生物学方法 在培养基中加入植物或动物组 织（如马铃薯、发芽谷物、灭菌的新鲜动物 组织块），以消耗养气或使氧化还原电势下 降。用这些培养基培养厌氧菌时，先将培养 基煮沸15－30分钟，降温后在培养基表面加 一层灭菌的液体石蜡，然后接种培养。

化学方法 利用还原作用强的化学物质，吸收环境或 培养基内的养气或还原氧化型物质，降低氧化还原电 势。 物理学方法 利用加热、密封、抽气等物理学方法， 以驱除或隔绝培养环境或培养基中的养气，形成无氧 状态，以利于厌氧菌的生长。常用的有厌氧罐法。


病毒是严格的细胞内寄生物，由于病毒缺乏自主复制的酶 系统，不能独自进行物质代谢，必须依赖宿主细胞或细胞 的某些成分合成核酸和蛋白质，所以只能在易感的细胞内 以复制的方式进行增殖，而不能在任何无细胞的培养液内 生长。除少数病毒外，大多数动物病毒能在试验动物、受 精卵和细胞培养中增殖。



细胞培养类型 （1）原代细胞 原代细胞是用动物新鲜组织如胚胎或幼 畜的组织或受精卵，经胰蛋白酶消化分散后制备而成。病 毒对原代细胞易感，繁殖滴度高，且无致瘤性等。但原代 细胞不能在体外多次传代，组织原材料的来源不固定，易 混入外源病原，造成外源病毒污染，不易控制其质量，影 响产品的纯净和安全性。

主细胞库 检验项目 显微镜检查 细菌和霉菌 支原体 病毒 ＋ ＋ ＋ ＋
工作 细胞库 ＋ ＋ ＋ ＋
最高限制 代次细胞 ＋ ＋ ＋ ＋
高于最高代次 10代的细胞 － － － －
细胞鉴别
胞核学检查 致瘤和致癌性
＋
＋ ＋
－
－ －
＋
＋ ＋
＋
＋ ＋



1) 细胞保存 收集新鲜细胞，用细胞冷冻保护液(含20％犊牛血 清、5％～10％二甲基亚砜的营养液)调整细胞浓度达100万一200万 个细胞／m1，分装于安瓿中，封口， 4℃预冷30min，封口严密的 安瓿移至-50～－70C冰箱中预冷，然后移至液氮罐内贮存，可保 存数年。 2) 细胞复苏 将安瓶自液氮罐取出后立即放入37～40℃温水中， 在lmin之内使细胞融化，换液培养至形成细胞单层。 3) 细胞运输 单层细胞培养瓶装满生长液，以防液体振荡冲脱细 胞，或只留少量生长液能覆盖单层，以防细胞干燥。细胞悬液装于 冰盒保持温度在15～25℃左右。