共聚焦激光扫描荧光显微镜课件
合集下载
共聚焦激光扫描PPT课件
.
4
共聚焦显微镜的优点
减少由于光散射产生的图像模糊 增加有效分辨率 提高信噪比 厚标本的清楚细查 Z轴扫描 可以实现数字放大倍率的调节
.
5
Wide-field microscopy
.
6
Fluorescent Microscope
Objective
Arc Lamp
Excitation Diaphragm Excitation Filter
12
基于共聚焦原理的皮肤在体三维成像技术
探测器 激光束
小孔
聚焦透镜 分光器
光学扫描 物镜
组织样品
Quarter Wave Plate 窗口
.
13
.
14
色素痣
A
明亮的黑素细胞巢围绕真 皮乳头呈圆形或椭圆形分布， 细胞形态规则，大小及明亮度 均一。细胞间有间隔。
B
.
15
对皮肤疾病的治疗与疗效评估需 要先进的皮肤诊断技术
Emission Filter
Emission Filter Emission Pinhole
.
10
原理示意图
光源（激光） 二色镜。 物镜 样品 针孔 检测仪 共焦显微镜的最大优点是可以只 从一个平面收集光。 针孔同焦平面成对（即共焦）， 使得来自焦平面以外的光远离检 测仪。 激光扫描显微镜按顺序一点一点 地、一行一行地扫描样品，将象 素资料合成一个图象。通过移动 焦平面，单个图象（光限幅）可 以放在一起，形成可以以后进行 数字处理的三维栈。
Ocular
Emission Filter
.
7
Confocal microscopy
.
8
Confocal Principle
激光扫描共聚焦显微镜(研究生)1ppt课件
Pathway415、 Pathway435 800系列
CARVⅡ C1 TCS-SP2 FV300
FV1000 尼Ul康tra（Vnieikwo™n）C1-plus
IN Cell Analyzer 3000
TauMap
LSM 510 SYSTEM LSM 510 PASCAL SYSTEM
精选课件PPT
精选课件PPT
35
荧光光谱
精选课件PPT
36
精选课件PPT
37
分隔发射的荧光
精选课件PPT
38
Separation of fluorescence emissions by means of dichroic filters
精选课件PPT
39
（四）计算机系统
控制硬件的软件功能：
①控制电动显微镜； ②选择激光波长，调节激光强度； ③拍摄2-5维图像； ④选择光谱拍摄范围，分辨率，激发光 挡片位置。
（10）、可即时或延时进行扫描
ROI(region of interesting，感兴趣区域） 实时（real time）显示
（11）、有线和帧方式的多重扫描功能
精选课件PPT
27
（12）、在改变扫描分辨率及扫描速度等后，无 须很复杂地对仪器参数重新设置
（13）、有记忆功能
（14）、有专用的图象数据库 （15）、系统采用模块化设计，便于整个系统 的扩展和升级换代
有多种方式选择，支持盲法拆分，方便用户使用；
⑾具有专业的FRAP（荧光漂白），FRET（荧光能
量共振转移）软件包。 精选课件PPT
41
精选课件PPT
42
三、激光扫描共聚焦显微镜的使用步骤
（一）样品制备
激光扫描共聚焦显微镜技术讲座 ppt课件
量、细胞膜流动性测量、膜电位测定) 细胞间隙连接的细胞间通讯
荧光探针的选择
合适的荧光探针是有效地进行实验并获取理想实 验结果的保障。
(1)现有仪器所采用的激光器 (2)荧光探针的光稳定性和光漂白性 (3)荧光的定性或定量
定性:单波长激发探针 定量:双波长激发比率探针 (4)荧光探针的特异性和毒性。 (5)荧光探针适用的pH
LSCM 的发展 1957年 提出了共聚焦显微镜技术的某些基本原理，并获
得了美国的专利。
1967年 成功的应用共聚焦显微镜产生了一个光学横面。 1970年 牛津和阿姆斯特丹同时向科学界推荐了一种新型
的扫描共聚焦显微镜。
1984年 Bio-Rad公司推出了世界第一台共聚焦显微镜品。 1987年 White和Amos在英国《自然》杂志发表了“共聚焦
2、球差：
由主轴上某一物点向光学系
统发出的单色圆锥形光束，经该 光学系列折射后， 不能聚焦成 一点,使成像模糊不清,形成一弥 散光斑(俗称模糊圈)，则此光学 系统的成像误差称为球差。
3、色差： 由白色物点向光学系统发出一束
白光，经该光学系列折射后，组成该 束白光的红、橙、黄、绿、青、蓝、 紫等各色光，不能会聚于同一点，即 白色物点不能结成白色像点，而结成 一彩色像斑的成像误差，称为色差。
*
不同的荧光探针在不同标本的效果常有差
异，故除综合考虑以上因素以外，有条件者应进
行染料的筛选，以找出最适的荧光探针。
*
许多荧光探针是疏水性的，很难或不能进
入细胞，需使荧光探针与AM（乙酰羟甲基酯）
结合后变成不带电荷的亲脂性化合物方易于通过
质膜进入细胞，在细胞内荧光探针上的AM被非
特异性酯酶水解，去掉AM后的荧光探针不仅可
荧光探针的选择
合适的荧光探针是有效地进行实验并获取理想实 验结果的保障。
(1)现有仪器所采用的激光器 (2)荧光探针的光稳定性和光漂白性 (3)荧光的定性或定量
定性:单波长激发探针 定量:双波长激发比率探针 (4)荧光探针的特异性和毒性。 (5)荧光探针适用的pH
LSCM 的发展 1957年 提出了共聚焦显微镜技术的某些基本原理，并获
得了美国的专利。
1967年 成功的应用共聚焦显微镜产生了一个光学横面。 1970年 牛津和阿姆斯特丹同时向科学界推荐了一种新型
的扫描共聚焦显微镜。
1984年 Bio-Rad公司推出了世界第一台共聚焦显微镜品。 1987年 White和Amos在英国《自然》杂志发表了“共聚焦
2、球差：
由主轴上某一物点向光学系
统发出的单色圆锥形光束，经该 光学系列折射后， 不能聚焦成 一点,使成像模糊不清,形成一弥 散光斑(俗称模糊圈)，则此光学 系统的成像误差称为球差。
3、色差： 由白色物点向光学系统发出一束
白光，经该光学系列折射后，组成该 束白光的红、橙、黄、绿、青、蓝、 紫等各色光，不能会聚于同一点，即 白色物点不能结成白色像点，而结成 一彩色像斑的成像误差，称为色差。
*
不同的荧光探针在不同标本的效果常有差
异，故除综合考虑以上因素以外，有条件者应进
行染料的筛选，以找出最适的荧光探针。
*
许多荧光探针是疏水性的，很难或不能进
入细胞，需使荧光探针与AM（乙酰羟甲基酯）
结合后变成不带电荷的亲脂性化合物方易于通过
质膜进入细胞，在细胞内荧光探针上的AM被非
特异性酯酶水解，去掉AM后的荧光探针不仅可
共聚焦显微镜简介及免疫荧光染色PPT课件
左右
➢标本不能太厚，如太厚激发光大部分消耗在标本
下部，而物镜直接观察到的上部不能充分激发
➢尽量去除非特异性荧光信号
➢封片剂多用甘油：PBS混合液（9：1)
第16页/共23页
激光共聚焦适用的器皿及要
求
第17页/共23页
一、活细胞直接免疫荧光染色（溶酶体或钙离子）
（1）将A549细胞细胞培养于35 mm 激光共聚焦
培养皿中间的圆形凹槽里；
（2）染色前吸除培养皿的培养液，用PBS洗2-3
次；
（3）向培养皿中轻轻滴入Lyso-Tracker Red或
Fluo-4/AM工作液200μL，使其覆盖凹槽里
全部细胞；
（4）37 ℃、5%CO2 培养箱中孵育30 min；
（5）吸除染液，用PBS洗2-3次；
（6）再用800μL的PBS覆盖凹槽里全部细胞，
德国Leica激光扫描共聚焦显微镜SP5 II简介
第1页/共23页
基本参数
➢型号：德国Leica SP5 II
➢激光器：4个 发射波长400nm-800nm
➢物镜：10倍
➢通道：多通道
20倍
63倍
多色
➢系统：windows 7＋LAS AF
➢活体细胞装置：配有
第2页/共23页
激光扫描共聚焦显微镜 的基本特点
37℃孵育60 min（避光）。
（5）染核并封片
用PBS（5min×3）冲洗后，滴加
DAPI染
核5min, PBS冲洗（5min×3），滴加
抗荧
光淬灭封片液。
（6）激光共聚焦显微镜拍照
第20页/共23页
Leica网上课程
Leica Science Lab网址：
➢标本不能太厚，如太厚激发光大部分消耗在标本
下部，而物镜直接观察到的上部不能充分激发
➢尽量去除非特异性荧光信号
➢封片剂多用甘油：PBS混合液（9：1)
第16页/共23页
激光共聚焦适用的器皿及要
求
第17页/共23页
一、活细胞直接免疫荧光染色（溶酶体或钙离子）
（1）将A549细胞细胞培养于35 mm 激光共聚焦
培养皿中间的圆形凹槽里；
（2）染色前吸除培养皿的培养液，用PBS洗2-3
次；
（3）向培养皿中轻轻滴入Lyso-Tracker Red或
Fluo-4/AM工作液200μL，使其覆盖凹槽里
全部细胞；
（4）37 ℃、5%CO2 培养箱中孵育30 min；
（5）吸除染液，用PBS洗2-3次；
（6）再用800μL的PBS覆盖凹槽里全部细胞，
德国Leica激光扫描共聚焦显微镜SP5 II简介
第1页/共23页
基本参数
➢型号：德国Leica SP5 II
➢激光器：4个 发射波长400nm-800nm
➢物镜：10倍
➢通道：多通道
20倍
63倍
多色
➢系统：windows 7＋LAS AF
➢活体细胞装置：配有
第2页/共23页
激光扫描共聚焦显微镜 的基本特点
37℃孵育60 min（避光）。
（5）染核并封片
用PBS（5min×3）冲洗后，滴加
DAPI染
核5min, PBS冲洗（5min×3），滴加
抗荧
光淬灭封片液。
（6）激光共聚焦显微镜拍照
第20页/共23页
Leica网上课程
Leica Science Lab网址：
荧光共聚焦 激光扫描共聚焦ppt课件
18Biblioteka THANK YOU19
7
只要载物台沿着Z轴上下移动，将样品新的一个层面移动 到共焦平面上，样品的新层面又成像在显色器上。
分辨率：0.18μm
点照明，具有照明点和探测点，具有扫描系统，逐点扫描 成像
具有四个荧光通道，可同时探测多个被标记物，一个透射 光道，同时采集透射光图像（非共焦图像）
8 8
弧灯 膜
目镜
孔
9
02 应用
10
11
12
Phe
红树植物秋茄
与GC-MS检测浓度相符
Pyr
12
13
黑麦草
洋葱
13
北京化工 大学
14
15
15
16
16
A surfactant template-assisted strategy for synthesis of ZIF-8 hollow nanospheres
17
(a) Preparation process for HCPT@ZIF-8 hollow nanospheres. (b,c) CLSM of HCPT@ZIF-8 hollow nanospheres (scale bar 1 μm). (d,e) SEM of HCPT@ZIF-8 hollow nanospheres (scale bar 1 μm; scale bar 100 nm).
4
荧光显微镜
• 利用一定波长的光使样品受到激发，产生不同颜色的荧光，以用来观察和 分辨样品中某些化学成分和细胞组分的一种显微镜。
• 自发荧光：组织，细胞不经荧光色素染色，在紫外光照射下，某些成分所 呈现的荧光。
• 继发性荧光：组织，细胞经荧光色素染色，由于荧光色素和组织细胞内的 某种成分结合后而呈现的荧光。
共聚焦激光扫描显微术ppt课件
放
四．细胞内PH值的测定，脑缺血，损伤时细 胞内PH变化
荧光漂白恢复技术(FRAP)与细胞间通讯研究
Gap junction的分布，密度，调控因素，网络阻断剂(Othanol , Dieldrin)
6. 激光手术切除神经细胞突起 光陷阱技术，套除细胞器，移动染色体
7. 神经细胞编程性死亡(programmed cell death,PCD) 与细胞内钙的关系
通过基团修饰以掩蔽生物活性分子，使其以惰性前体形式 存在。通常是可逆的。
原理：紫外线照射→共价键断裂→释放生物活性分子
PART ONE
锁化合物的两种光化学反应原理： 氮苯的光致同分异构作用和硝基甲苯的光 分解作用
#2022
偶氮苯衍生物：
邻硝基甲 苯衍生物：
01.
目前应用最广泛的笼锁化合物系利用硝基甲苯 的光敏性质合成。
髓，否则容易造成观者的阅读压 力，适得其反。正如我们都希望 改变世界，希望给别人带去光明，
但更多时候我们只需要播下一颗
种子，自然有微风吹拂，雨露滋
养。恰如其分地表达观点，往往
事半功倍。
二、基本原理
1.光学成像
激光器产生的激光经物镜聚焦到 样品上
反射光或荧光经目镜汇聚于探测 器
探检测器前有一小孔(Pinhole) 汇聚光束
五、在神经 生物学的应 用
1.神经细胞参数测定及三维重建
细胞外形 浦肯野氏细胞及其突起的投射 神经细胞轴突走向及神经支配的研究 神经骨架重组的研究
二．神经递质、调质及细胞内活性物质受体 的荧光定位
三．细胞内钙离子的测定
○ 细胞内信号传导的研究 ○ 钙内流与神经递质释放的关系 ○ 微环境变化，受体激活，电刺激与钙的释
0.00
四．细胞内PH值的测定，脑缺血，损伤时细 胞内PH变化
荧光漂白恢复技术(FRAP)与细胞间通讯研究
Gap junction的分布，密度，调控因素，网络阻断剂(Othanol , Dieldrin)
6. 激光手术切除神经细胞突起 光陷阱技术，套除细胞器，移动染色体
7. 神经细胞编程性死亡(programmed cell death,PCD) 与细胞内钙的关系
通过基团修饰以掩蔽生物活性分子，使其以惰性前体形式 存在。通常是可逆的。
原理：紫外线照射→共价键断裂→释放生物活性分子
PART ONE
锁化合物的两种光化学反应原理： 氮苯的光致同分异构作用和硝基甲苯的光 分解作用
#2022
偶氮苯衍生物：
邻硝基甲 苯衍生物：
01.
目前应用最广泛的笼锁化合物系利用硝基甲苯 的光敏性质合成。
髓，否则容易造成观者的阅读压 力，适得其反。正如我们都希望 改变世界，希望给别人带去光明，
但更多时候我们只需要播下一颗
种子，自然有微风吹拂，雨露滋
养。恰如其分地表达观点，往往
事半功倍。
二、基本原理
1.光学成像
激光器产生的激光经物镜聚焦到 样品上
反射光或荧光经目镜汇聚于探测 器
探检测器前有一小孔(Pinhole) 汇聚光束
五、在神经 生物学的应 用
1.神经细胞参数测定及三维重建
细胞外形 浦肯野氏细胞及其突起的投射 神经细胞轴突走向及神经支配的研究 神经骨架重组的研究
二．神经递质、调质及细胞内活性物质受体 的荧光定位
三．细胞内钙离子的测定
○ 细胞内信号传导的研究 ○ 钙内流与神经递质释放的关系 ○ 微环境变化，受体激活，电刺激与钙的释
0.00
激光扫描共聚焦显微镜教学课件
缺点
昂贵
激光扫描共聚焦显微镜的价格相对 较高，不是所有的实验室都能够负
担得起。
需要专业操作
使用该显微镜需要一定的专业知识 和技能，对操作者的要求较高。
样本制备要求高
由于该显微镜对样本的厚度和折射 率等参数敏感，因此需要精心制备 样本。
维护成本高
激光扫描共聚焦显微镜的维护成本 也相对较高，需要定期检查和保养 。
04
激光扫描共聚焦显微镜的 优缺点
优点
高分辨率
激光扫描共聚焦显微镜利用激光束进行 扫描，可以实现比传统显微镜更高的分 辨率。
灵敏度高
由于激光束的强度高，该显微镜对样本 的灵敏度也相应提高，可以检测到较弱 的荧光信号。
减少光损伤
共聚焦技术只对焦点处的样本进行照明 ，有效减少了光损伤。
三维成像
激光扫描共聚焦显微镜可以采集样本的 三维图像。
仪器清洁
清洁显微镜的透镜和其他部件，以确保观察的清晰度和准确 性。
图像获取
参数设置
在获取图像前，需要设置激光扫描共聚焦显微镜的参数，如扫描速度、扫描分辨 率、激光波长等。
图像获取
通过激光扫描共聚焦显微镜获取细胞样本的图像。
数据分析
对获取的图像进行处理，以提 高其清晰度和对比度。
02
数据测量
01
图像处理
显微镜控制和分析软件。
02
基于图形用户界面，方便用户进行样本观察、图像获
取和数据分析。
03
支持多种组织样本类型，包括免疫荧光、荧光原位杂
交等。
Definiens Developer
一种基于规则和智能图像分析软 件，用于构建细胞和组织图像分
析流程。
提供强大的图像处理和分析工具 ，包括图像预处理、特征提取、
激光扫描共聚焦显微课件
文档仅供参考，不能作为科学依据，请勿模仿；如有不当之处，请联系网站或本人删除。
采用激光作为光源，在传统光学显微镜 基础上，使用紫外或可见光激发荧光探针，采 用共轭聚焦原理和装置，从而得到细胞或组织 内部微细结构的荧光图像，在亚细胞水平上观 察生理信号及细胞形态的变化，并利用计算机 对所观察的对象进行数字图象处理的一套集观 察、分析和输出为一体系统。它把光学成像的 分辨率提高了30%~40%，成为形态学，分子生 物学，神经科学，药理学，遗传学等领域中新 一代的研究工具。
文档仅供参考，不能作为科学依据，请勿模仿；如有不当之处，请联系网站或本人删除。
激光器 显微镜：物镜 载物台 计算机系统：图像分析与控制系统
文档仅供参考，不能作为科学依据，请勿模仿；如有不当之处，请联系网站或本人删除。
激光扫描共聚焦显微镜 vs 荧光显微镜
激光扫描共聚焦显微镜
荧光显微镜
激光器 文档仅供参考，不能作为科学依据，请勿模仿；如有不当之处，请联系网站或本人删除。
文档仅供参考，不能作为科学依据，请勿模仿；如有不当之处，请联系网站或本人删除。
LSCM的重要组件
主要系统包括激光光源、自动显 微镜、扫描模块（包括共聚焦光路通 道和针孔、扫描镜、检测器）、数字 信号处理器、计算机以及图象输出设 备（显示器、彩色打印机）等。
文档仅供参考，不能作为科学依据，请勿模仿；如有不当之处，请联系网站或本人删除。
文档仅供参考，不能作为科学依据，请勿模仿；如有不当之处，请联系网站或本人删除。
文档仅供参考，不能作为科学依据，请勿模仿；如有不当之处，请联系网站或本人删除。
文档仅供参考，不能作为科学依据，请勿模仿；如有不当之处，请联系网站或本人删除。
LSCM与普通荧光显微镜的图像质量比较
采用激光作为光源，在传统光学显微镜 基础上，使用紫外或可见光激发荧光探针，采 用共轭聚焦原理和装置，从而得到细胞或组织 内部微细结构的荧光图像，在亚细胞水平上观 察生理信号及细胞形态的变化，并利用计算机 对所观察的对象进行数字图象处理的一套集观 察、分析和输出为一体系统。它把光学成像的 分辨率提高了30%~40%，成为形态学，分子生 物学，神经科学，药理学，遗传学等领域中新 一代的研究工具。
文档仅供参考，不能作为科学依据，请勿模仿；如有不当之处，请联系网站或本人删除。
激光器 显微镜：物镜 载物台 计算机系统：图像分析与控制系统
文档仅供参考，不能作为科学依据，请勿模仿；如有不当之处，请联系网站或本人删除。
激光扫描共聚焦显微镜 vs 荧光显微镜
激光扫描共聚焦显微镜
荧光显微镜
激光器 文档仅供参考，不能作为科学依据，请勿模仿；如有不当之处，请联系网站或本人删除。
文档仅供参考，不能作为科学依据，请勿模仿；如有不当之处，请联系网站或本人删除。
LSCM的重要组件
主要系统包括激光光源、自动显 微镜、扫描模块（包括共聚焦光路通 道和针孔、扫描镜、检测器）、数字 信号处理器、计算机以及图象输出设 备（显示器、彩色打印机）等。
文档仅供参考，不能作为科学依据，请勿模仿；如有不当之处，请联系网站或本人删除。
文档仅供参考，不能作为科学依据，请勿模仿；如有不当之处，请联系网站或本人删除。
文档仅供参考，不能作为科学依据，请勿模仿；如有不当之处，请联系网站或本人删除。
文档仅供参考，不能作为科学依据，请勿模仿；如有不当之处，请联系网站或本人删除。
LSCM与普通荧光显微镜的图像质量比较
激光扫描共聚焦显微镜教学课件
细胞膜流动性研究
总结词
详细描述
利用荧光染料标记细胞膜，在激光扫 描共聚焦显微镜下观察标记物的动态 变化，通过分析荧光强度和分布的变 化，可以了解细胞膜的流动性。
神经元突起研究
总结词 详细描述
细胞骨架结构研究
总结词
详细描述
CHAPTER
激光扫描共聚焦显微镜的未 来发展与挑战
技术创新与改进
分辨率提升 高速成像 多维成像
应用领域的拓展
临床诊断
将激光扫描共聚焦显微镜应用于 临床诊断，通过观察活体组织样 本，为疾病诊断和治疗提供更准
确的依据。
药物研发
利用激光扫描共聚焦显微镜观察 药物对细胞的作用和影响，为新
药研发提供实验支持。
生物科学研究
将激光扫描共聚焦显微镜应用于 生物科学研究，探索细胞和分子
层面的生命活动规律。
实验伦理与法规
动物实验伦理 数据处理与隐私保护 法规遵循
WATCHING
激光扫描共聚焦显微 镜教学课件
• 激光扫描共聚焦显微镜简介 • 激光扫描共聚焦显微镜操作流程 • 激光扫描共聚焦显微镜实验技术 • 激光扫描共聚焦显微镜实验案例 • 激光扫描共聚焦显微镜的未来发展与挑战
CHAPTER
激光扫描共聚焦显微镜简介
定义与特点
定义 特点
工作原理
01
激光束通过显微物镜照 射到样品上，形成光斑；
01
样品选择
02 样品预处理
03 载玻片准备
显微镜设置
光源选择
物镜选择
滤色片配置 扫描速度与分辨率设置
图像采集
校准
。
采集参数设置
多区域采集 实时预览
数据分析
图像处理
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
Fluorescence Microscope；LSFM）
以激光作为激发光源，采用光源针孔与检测针孔共轭
聚焦技术，对样本进行断层扫描，以获得高分辨率光学切片的 荧光显微镜系统
共聚焦系统 细胞CT
PPT学习交流
2
荧光和荧光显微镜
一、荧光的基础术语
荧光物质：
某些物质在特定波长范围内的光线照射下，可发 出波长比照射光长的光线 — 荧光。受激发后能 产生荧光的物质称荧光物质或荧光素 激发光(EXCITATION)：
白即绿色荧光蛋白（ green fluorescent protein GFP）。
Ca2+
Aequoren + 肠腔素
蓝色荧光
GFP
绿色荧光
GFP, CFP, BFP, YFP商品化质粒
1. 转基因动物: Green mouse
2. 外源基因的报告基因: 将外源基因与GFP DNA 相连, 可实时监 测外源基因的表达.
能特异性地激发某种荧光素的一定波长范围内的 光线称为该荧光素的激发光。激发/吸收光谱；吸 收波峰(最大吸收波长)
488nm 520nm
发射光(EMISSION): 发射光谱；发射波峰(最大发射波长)
异硫氰酸荧光素(FITC)
荧光探针：
能产生荧光的特异性生物染料（PI, Dapi)、标有荧光素的特异性蛋白结合物（荧光抗体）
8
三维胶原基 质培养的血 管平滑肌细 胞
PPT学习交流
9
共聚焦激光扫描荧光显微镜应用领域
只要目的结构是用荧光探针标记的，都可 用共聚焦激光扫描荧光显微镜观察。
形态学研究：细胞凋亡、中枢神经系的F联 系、肿瘤细胞分类……
分子生物学：原位杂交，DNA、RNA定量， DNA损伤修复、外源性基因在真核细胞的表达、 定位，荧光能量共振转移大分子构象的改变、 受体与配体相互作用……
6
光源针孔 光源
聚集平面
光电倍增管 检测针孔
分色镜
物镜 样本
共聚焦扫描显微镜光学原理
检测针孔和光源针孔始终聚焦于同一 点，使聚焦平面以外被激发的荧光不能进 入检测针孔 高分辨率的光学切片
激光穿透性强，可对样本进行一定深 度光学断层，获得高标准的连续光学切片
实现三维重建
PPT学习交流
7
PPT学习交流
活细胞动态荧光测量：细胞内Ca++、K+、H+ 等离子的动态分布及动态定量、荧光漂白恢复 细胞连接间的信息沟通……
直接对活组织或整体胚胎观察：单光子共 聚焦激光扫描系统的局限性：荧光漂白
PPT学习交流
10
1. 荧光漂白恢复 (Fluorescence Recover after photobleaching; FRAP) 检测细胞连接间的信息传递
Intensity
Before bleach
After bleach
90 min after bleach
PPT学习交流
11
2 . 荧 光 能 量 共 振 转 移 ( Fluorescence Resonance Energy Transfer)
I.荧光能量共振转移: 受激态荧光素将其能量向另一个荧光素传递，使
Centre for Structural Biology Wuhan University School of Medicine
共聚焦激光扫描荧光显微镜
— 基本原理、应用及样本制备原则
PPT学习交流
1
什么是共聚焦激光扫描荧光显微镜？
共聚焦激光扫描荧光显微镜（Confocal Laser Scanning
供体荧光素 受体荧光素
488nm 520nm
650nm
PPT学习交流供体荧光素 (Cy2)
受体荧光素 (Cy3)
12
III. 常用荧光共振转移探针对
FITC/TRITC, Cy3/Cy5, BFP/GFP
检测 以供体的激发波长的光照射样品,没有共
振转移时，只检测到供体的荧光，发生共振 转移时，供体的荧光减弱，受体被激发出现 荧光。 应用
Antivibration table 防震台
Leica TCS SP-2 MP AOBS Confocal System
PPT学习交流
5
共聚焦装置
X/Y扫描 装置
荧光显微镜 物镜
光电倍增管 检测 针孔 光源 针孔
步进聚焦电机
PPT学习交流
Bio-Rad LaserSharp
系统操作，图像处理 3-D重建
受体与配体的相互作用：亚基的结合 与分离
大分子构象的改变
PPT学习交流
Fluorescence Intensity
Ligand
Time
Cy5 Cy3
13
3. 绿色荧光蛋白（GFP）
GFP的发现：60年代，Shimomura等首先从水母中分离出一种水母发 光蛋白 (aequoren)，该蛋白与钙和肠腔素结合后可产生蓝色荧光。然而水 母整体提取的颗粒都呈绿色，后经证实在水母体内还存在另外一种发光蛋
后者被激发，这一过程称荧光能量共振转移。能量的提供者叫供体荧光素， 能量的接受者叫受体荧光素。
II.荧光能量共振转移的条件
488nm 520nm
540nm 650nm
1.供体与受体间的距离 <10nm或=1-7nm
2.供体的发射光谱与受体的吸收光谱 有实质性的重叠
供体荧光素 (Cy2)
受体荧光素 (Cy3)
蓝
色的生
绿
物样本
光学 成像
被标记 结构的 荧光光 学图像
激发滤镜：从光源中分滤出一定波长范围的激发光。
带通滤色镜(BP)：有宽、窄带之分。如：BP450-490 长、短通滤色镜组合（LP + KP）：LP450 + KP490
双色镜：双色分光镜；反射短波长，透过长波长。
488nm
520nm
阻断滤镜：多为长通滤色镜；LP490
自发荧光(AUTOFLUORESCENCE):
组织或细胞中的某些成份受激发时可发出荧光—自发荧光。 伊文斯蓝、硼化氢钠处理漂白(BLE NhomakorabeaCH)：
荧光物质受激发时，其发射荧光的能力逐渐下降并最终丧失 — 漂白。
PPT学习交流
3
荧光显微镜
二、荧光显微镜术的基本原理
高 压 汞 灯
滤镜 分光
被荧光
紫外 激发 探针染
450nm
490nm
PPT学习交流
FITC
4
共聚焦激光扫描荧光显微镜基本配置
Confocal scan and detector unit 共聚焦扫描及检测装置
Computer
计算机
Microscope 荧光显微镜
Laser and electronic Control Unit
激光光源及 控制装置
以激光作为激发光源，采用光源针孔与检测针孔共轭
聚焦技术，对样本进行断层扫描，以获得高分辨率光学切片的 荧光显微镜系统
共聚焦系统 细胞CT
PPT学习交流
2
荧光和荧光显微镜
一、荧光的基础术语
荧光物质：
某些物质在特定波长范围内的光线照射下，可发 出波长比照射光长的光线 — 荧光。受激发后能 产生荧光的物质称荧光物质或荧光素 激发光(EXCITATION)：
白即绿色荧光蛋白（ green fluorescent protein GFP）。
Ca2+
Aequoren + 肠腔素
蓝色荧光
GFP
绿色荧光
GFP, CFP, BFP, YFP商品化质粒
1. 转基因动物: Green mouse
2. 外源基因的报告基因: 将外源基因与GFP DNA 相连, 可实时监 测外源基因的表达.
能特异性地激发某种荧光素的一定波长范围内的 光线称为该荧光素的激发光。激发/吸收光谱；吸 收波峰(最大吸收波长)
488nm 520nm
发射光(EMISSION): 发射光谱；发射波峰(最大发射波长)
异硫氰酸荧光素(FITC)
荧光探针：
能产生荧光的特异性生物染料（PI, Dapi)、标有荧光素的特异性蛋白结合物（荧光抗体）
8
三维胶原基 质培养的血 管平滑肌细 胞
PPT学习交流
9
共聚焦激光扫描荧光显微镜应用领域
只要目的结构是用荧光探针标记的，都可 用共聚焦激光扫描荧光显微镜观察。
形态学研究：细胞凋亡、中枢神经系的F联 系、肿瘤细胞分类……
分子生物学：原位杂交，DNA、RNA定量， DNA损伤修复、外源性基因在真核细胞的表达、 定位，荧光能量共振转移大分子构象的改变、 受体与配体相互作用……
6
光源针孔 光源
聚集平面
光电倍增管 检测针孔
分色镜
物镜 样本
共聚焦扫描显微镜光学原理
检测针孔和光源针孔始终聚焦于同一 点，使聚焦平面以外被激发的荧光不能进 入检测针孔 高分辨率的光学切片
激光穿透性强，可对样本进行一定深 度光学断层，获得高标准的连续光学切片
实现三维重建
PPT学习交流
7
PPT学习交流
活细胞动态荧光测量：细胞内Ca++、K+、H+ 等离子的动态分布及动态定量、荧光漂白恢复 细胞连接间的信息沟通……
直接对活组织或整体胚胎观察：单光子共 聚焦激光扫描系统的局限性：荧光漂白
PPT学习交流
10
1. 荧光漂白恢复 (Fluorescence Recover after photobleaching; FRAP) 检测细胞连接间的信息传递
Intensity
Before bleach
After bleach
90 min after bleach
PPT学习交流
11
2 . 荧 光 能 量 共 振 转 移 ( Fluorescence Resonance Energy Transfer)
I.荧光能量共振转移: 受激态荧光素将其能量向另一个荧光素传递，使
Centre for Structural Biology Wuhan University School of Medicine
共聚焦激光扫描荧光显微镜
— 基本原理、应用及样本制备原则
PPT学习交流
1
什么是共聚焦激光扫描荧光显微镜？
共聚焦激光扫描荧光显微镜（Confocal Laser Scanning
供体荧光素 受体荧光素
488nm 520nm
650nm
PPT学习交流供体荧光素 (Cy2)
受体荧光素 (Cy3)
12
III. 常用荧光共振转移探针对
FITC/TRITC, Cy3/Cy5, BFP/GFP
检测 以供体的激发波长的光照射样品,没有共
振转移时，只检测到供体的荧光，发生共振 转移时，供体的荧光减弱，受体被激发出现 荧光。 应用
Antivibration table 防震台
Leica TCS SP-2 MP AOBS Confocal System
PPT学习交流
5
共聚焦装置
X/Y扫描 装置
荧光显微镜 物镜
光电倍增管 检测 针孔 光源 针孔
步进聚焦电机
PPT学习交流
Bio-Rad LaserSharp
系统操作，图像处理 3-D重建
受体与配体的相互作用：亚基的结合 与分离
大分子构象的改变
PPT学习交流
Fluorescence Intensity
Ligand
Time
Cy5 Cy3
13
3. 绿色荧光蛋白（GFP）
GFP的发现：60年代，Shimomura等首先从水母中分离出一种水母发 光蛋白 (aequoren)，该蛋白与钙和肠腔素结合后可产生蓝色荧光。然而水 母整体提取的颗粒都呈绿色，后经证实在水母体内还存在另外一种发光蛋
后者被激发，这一过程称荧光能量共振转移。能量的提供者叫供体荧光素， 能量的接受者叫受体荧光素。
II.荧光能量共振转移的条件
488nm 520nm
540nm 650nm
1.供体与受体间的距离 <10nm或=1-7nm
2.供体的发射光谱与受体的吸收光谱 有实质性的重叠
供体荧光素 (Cy2)
受体荧光素 (Cy3)
蓝
色的生
绿
物样本
光学 成像
被标记 结构的 荧光光 学图像
激发滤镜：从光源中分滤出一定波长范围的激发光。
带通滤色镜(BP)：有宽、窄带之分。如：BP450-490 长、短通滤色镜组合（LP + KP）：LP450 + KP490
双色镜：双色分光镜；反射短波长，透过长波长。
488nm
520nm
阻断滤镜：多为长通滤色镜；LP490
自发荧光(AUTOFLUORESCENCE):
组织或细胞中的某些成份受激发时可发出荧光—自发荧光。 伊文斯蓝、硼化氢钠处理漂白(BLE NhomakorabeaCH)：
荧光物质受激发时，其发射荧光的能力逐渐下降并最终丧失 — 漂白。
PPT学习交流
3
荧光显微镜
二、荧光显微镜术的基本原理
高 压 汞 灯
滤镜 分光
被荧光
紫外 激发 探针染
450nm
490nm
PPT学习交流
FITC
4
共聚焦激光扫描荧光显微镜基本配置
Confocal scan and detector unit 共聚焦扫描及检测装置
Computer
计算机
Microscope 荧光显微镜
Laser and electronic Control Unit
激光光源及 控制装置