western的操作步骤

Western Blot操作全过程
一，收蛋白
a（如果要收集死细胞）
1.取冰，将4°C离心机提前降温。

2.将死细胞收集到离心管：孔板内的细胞用PBS洗1-2遍，用适量
的胰酶消化，用离心管内的原培养液将孔板内细胞吹打下来，收集到离心管，室温离心1000rpm，5min。

3.弃上清，将离心管倒扣在滤纸上，尽量吸尽残留上清。

4.视细胞量的多少加入细胞裂解液。

（1×Cell Lysis Buffer：
PMSF=100：1，1×Cell Lysis Buffer，PMSF-20°C保存。

PMSF 常温易降解，拿出时间不得超过30min，必须放置冰上。

）
5.冰上裂解15min，将裂解液转移至EP管离心，4°C，12000rpm，
15min。

6.小心将上清转移至另一EP管，记下吸取的量。

如：100μL。

7.将收集好的蛋白保存与—20°C。

（可长期保存）
b （如果不收集死细胞）
1．弃上清，孔板PBS洗1-2遍，吸尽PBS。

在孔板中视细胞量的多少加入相应细胞裂解液。

（同上）
2．冰上裂解15min，用细胞刮在孔板里将细胞刮刮。

（不同的孔不能用同一个刮子，刮前用水冲洗，擦干。

）
3．将裂解液转移至EP管离心，4°C，12000rpm，15min。

4．小心将上清转移至另一EP管，记下吸取的量。

5．将收集好的蛋白保存与—20°C。

（可长期保存）
二，测蛋白浓度
BCA法（或者按照自己的试剂盒说明操作）
1.需96孔板，测蛋白浓度的A液，B液，标准蛋白，要测的样品蛋
白。

2.按要测的样品蛋白的数量来配AB液，每孔需AB混合液80μl（A：
B=50：1）。

例：有5个样品，加上5个标准蛋白和空白对照。

共有11个孔。

则A液取11×80=880μl，B液取880÷50=两液混匀，加入96孔板，每孔80μl。

然后加入标准蛋白及样品蛋白4μl。

（标准蛋白先配好浓度125，250，500，1000，2000）
3.将孔板放入37°C温箱孵育30min。

4.用酶标仪测蛋白浓度。

5.记下蛋白浓度，根据要上样的μg量算出μl量。

例：蛋白浓度为
1000，需上样15μg。

则需上样15÷1000=上样量不超过20μl。

三，配胶
1.将薄板和厚板用洁净的布擦干净，对齐，夹好。

（板必须擦干净，
下端对齐，否则容易漏胶。

）
2.配分离胶，根据要跑的蛋白分子量，配相应浓度的胶。

3.快速将分离胶加入薄厚板之间，不能太满，留出浓缩胶的部分。

(浓缩胶高度大约1CM)
4.在分离胶上灌水，要缓慢，为了让胶凝的更好。

5.30分钟左右，分离胶凝了，将水倒掉，滤纸吸干，找好梳子。

制
浓缩胶。

6.灌胶，快速插入相应的梳子。

7.约15min胶可以凝固。

四，煮蛋白
1.煮蛋白前将蛋白中加入6×SDS+DTT(即上样缓冲液)。

例样品蛋白
共有100μl，则需加100÷5=20μl 6×SDS+DTT。

混匀。

（加有DTT的SDS应-20°C保存。

DTT应-20°C保存。

SDS：DTT=9：1）。

2.将蛋白沸水煮10min。

煮过的蛋白在两周内有效。

五，上样，跑胶，转膜
1.电泳巢内加入电泳液，夹好胶板。

拔去梳子。

2.每孔上样量不超过20μl，每块胶应上有Maker。

剩余的孔里上1
×SDS。

3.蛋白上样前要震荡混匀。

4.浓缩胶80V，分离胶120V。

5.转膜
半干法转膜或者湿转自己的试验条件决定。

根据分子量的大小，按照Maker的位置裁胶，根据胶的大小，剪相应大小的NC膜。

（NC膜要先用甲醇活化）。

六，封闭
5%牛奶（TBST稀释的脱脂牛奶）室温封闭1-2h，
七，封一抗
摸清抗体要用的浓度。

用TBST或5%牛奶加抗体。

室温1-2h，或4°C过夜。

用过的抗体要回收，做记号，用的第几次。

放入-20°保存。

八，洗膜
用TBST摇床上洗3遍，每次10min。

（一抗不要摇的太剧烈）
九，封二抗
摸清二抗的浓度。

室温45min-2h。

抗体回收，做记号，用的第几次。

放入-20°保存。

十，洗膜
用TBST摇床上洗3遍，每次10min。

（二抗可以摇的稍快些）
十一，发光
1.在发光板内放入干净的可以夹住NC膜的薄膜，放好已经洗好
的膜。

用滤纸吸干膜上的水。

2.拿齐发光板，发光液，1ml的枪及枪头（至少两根），胶片，一
张滤纸，一个离心管。

3.进入暗室，反锁好门，开红灯，在离心管内配发光液，A液：B
液=1：1。

先A后B。

切记换枪头，打开薄膜，将AB液混匀，均匀的洒在NC膜上。

盖上薄膜，将多余的发光液推开，以防水多膜移动。

漏出薄膜外的可用滤纸吸干。

4.关灯，看见荧光，盖上胶片。

胶片盖上之前先在左上角（个人
习惯）折个角，好辨认方向。

5.根据荧光强度按压几秒或几分钟。

将胶片放入洗片机冲洗。

6.等片子完全洗好，可开灯。

或者DAB显色需要买试剂盒。

十二，扫描保留结果。