MDA多重置换扩增技术

细胞分选
流式细胞仪的测量对象
• 大小
•
悬浮在溶液中的相互离散颗粒。
•
大小范围：0.2uM-300uM。
• 对象类型
• 细胞类型：
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（1） 高等真核细胞；
•
（2）酵母；
•
（3）细菌；
•
（4）多细胞的聚集体，如胰岛等。
• 非生命颗粒：
•
细胞核、染色体、和其它细胞器以及乳化微球等。
• 全基因组扩增(WGA)是一组对全部基因组序列进行非选择性扩增的技 术，其目的是在没有序列倾向性的前提下大幅度增加DNA 的总量。 该技术通过对微量组织样本，甚至单个细胞的整个基因组DNA扩增， 再将其扩增产物作为模板，进行后续分析，进而完成多位点、多基因 以及全基因组DNA 组成的研究。
• 基因测序需要一定量的DNA模板，所以测序前需对微生 物进行分离和培养，但是环境中大多数的微生物是不可 培养或对培养条件要求很高的，这无疑给测序增添了难 度。
• 单细胞全基因组测序技术：通过一种叫做全基因组扩增 技术，不需要进行微生物培养，可以直接扩增放大单个 细菌中的DNA获得作为模板所需的微克DNA 。
• 另外，对测序得到 的大量数据结果的专业分析也是一个重大的挑战。 单细胞全基因组测序正在从基础研究走向临床应用。
多重置换扩增技术（MDA）
• 多重置换扩增（multiple displacement amplification，MDA）的 技术： 不需要进行微生物培养，可以直接扩增放大单个细菌中的DNA 获得作为模板所需的微克DNA 。
胞的溶液中，可高效地捕获液体基质中1-10μm的微粒。
分离单细胞
• 根据所需要的生产量、环境以及靶生物体等情况，可以通过采 用稀释法、荧光活性细胞筛选（FACS）、显微操作和微流体分 离到单个细胞用于MDA，采用FACS可以在一分钟内分离到上 千个细胞。
• 单细胞分离结合荧光原位杂交（FISH）可以富集特异的菌属， 机械的显微操作（基于体外受精的装备）结合现代研究显微镜 方法可以高效地分离到单细胞，如跟FISH结合从环境样本中筛 选出特异的种类用于MDA扩增单细胞DNA实验。
• 单个细胞间基因序列的联系也是一个功能强大的工具，它可用 于对从环境DNA的提取物（宏基因组序列）得到的多重有机体 通过鸟枪法测序来指导构建基因芯片。
多重置换扩增（MDA）的示意图：
首先随机六碱基引物在多个位点与模板DNA退火，接
下来Phi 29 DNA 聚合酶在DNA的多个位点同时起始复制，
它沿着DNA模板合成DNA,同时取代模板的互补链。被置换
多重置换扩增（MDA）技术对单 细胞基因组测序技术研究进展
北大肿瘤医院病因学教研室 （山东省千佛山医院） 田源
基因测序技术
• 目前应用的快速序列测定技术可以总的概括为两 种：合成法和降解法。基于Sanger等（1977）提 出的酶法及Maxam和Gilbert(1977)提出的化学降解 法这两种基本思想。
的互补链又成为新的模板来进行扩增，因此最终我们可以
引
物 获得大量高分子量的DNA.
Baidu Nhomakorabea引 物
模板
多重置换扩增 (MDA)
• MDA是目前公认的最好的单细胞基因组扩增技术，它能对全基因组进 行高保真的均匀扩增，扩增出10~100kb大小的片段，能提供大量均一 完整的全基因组序列。
• 但是MDA也有一些缺点，特别是显著的非特异扩增，往往空白对照样 品也总是“无中生有”地产生大量的DNA，另外就是仍然存在序列偏 差。尽管各种改进的策略正在逐步减少这些缺陷，高覆盖率、高保真 性及高特异性的扩增仍然是亟待解决的问题。
单细胞全基因组测序
• 单细胞全基因组测序技术：是在单细胞水平对 全基因组进行扩增与测序的一项新技术。
• 其原理是将分离的单个细胞的微量全基因组 DNA进行扩增，获得高覆盖率的完整的基因组 之后通过外显子捕获进而高通量测序用于揭示 细胞群体差异和细胞进化关系。
全基因组扩增技术
• 全基因组扩增技术主要分为两种类型： • 一是基于热循环以PCR为基础的扩增技术，如简并
寡核苷酸引物PCR (DOP-PCR)、连接反应介导的PCR (LM-PCR)、扩增前引物延伸反应 (PEP)等； • 一是基于等温反应不以PCR为基础的扩增技术，如 多重置换扩增 (MDA) 和基于引物酶的全基因组扩增 (pWGA)。
通过MDA扩增DNA
• 多重置换扩增(Multiple dilacement amplification，MDA)是1998 年由耶鲁大学Lizardi博士首次提出。这种恒温扩增的方法依赖 于链置换扩增原理，利用噬菌体Φ29DNA聚合酶，高度扩增 DNA。该酶对于模板有很强的模板结合能力，能连续扩增 100Kb 的DNA模板而不从模板上解离。同时这种酶具有3’ -5’外 切酶活性，错误率仅为5 x 10-6，大约比Taq DNA聚合酶低100倍， 因此可以保证扩增的高保真性。
• 整个实验包括： 环境样品的准备、单细胞分离、MDA扩增DNA、DNA测序等。
环境样品的处理
• 富集环境样品中的微生物片段以利于分离单个细胞。 分离单细胞前土壤先经过密度梯度离心预处理。如果 是水样本，假如对生物体浓度有要求则要考虑附带过 滤。
• 离心、液体加压冲击法、过滤和静电沉积法 。 • 液压冲击型空气收集器可使细胞悬浮在用于分离单细
• Φ29DNA聚合酶强大的向前延伸活性和高保真度，使得通过 MDA可从极少量的DNA样本获取大量高质量的DNA，是到目 前为止对整个基因组覆盖最广、各位点扩增偏倚最小的WGA方 法。
• 目前单细胞微生物可以通过对多重置换扩增反应（ MDA）得到 的扩增DNA进行测序。
• 在细菌中几个飞克 (10-15g)的DNA能扩增得到微克(10-6g)的高分 子量DNA，扩增得到的DNA 适合DNA文库的构建和Sanger测序。 MDA生成的DNA也可直接作为模板供焦磷酸测序。
• 传统用于DNA测序的方法有毛细管微阵列电泳测 序和焦磷酸测序等，这些方法往往技术要求高、 成本贵，而且容易出错。
• 截至2007年，第二代基因测序方法已经普遍推广应用，极 大地降低了测序的成本和时间，实现了高通量测序。
• 2008年又提出了更快更好的第三代测序方法---单分子测序 （SMS）
基因测序技术