分子生物学实验简述

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繁殖迅速，培养对象易于控制，利用DNA重组技术构建大肠杆菌工程菌大规模生产真核生物基因尤其是人类基因的表达产物，具有重大的经济价值。目前已实现商品化的30多种基因工程产品中，大部分是由大肠杆菌生产的。 2.3.3 pBR322质粒载体的特点

（1）具有较小的分子量，避免在DNA的纯化过程中发生链的断裂,pBR322质粒这种小分子量的特点，不仅易于自身DNA的纯化，而且可容纳较大的外源DNA片段

（2）具有两种抗菌素抗性基因(四环素、氨苄青霉素抗性基因)可供作转化子的选择记号，能指示载体或重组DNA分子是否进入宿主细胞以及外源DNA分子是否插入载体分子形成了重组子,便于分子克隆的筛选。

（3）含有高效的自主复制成分，质粒的复制和宿主的繁殖不相关，在抑制细菌蛋白质合成时，细菌染色体DNA 停止复制，但质粒可以继续利用细菌原有的酶系统进行复制。（4）限制性内切酶单一切口，在质粒复制子以外的部位具有一种或多种限制性内切酶的单一切口，便于外源基因的插入。

2.4基因的导入

2.4.1基因导入的概述

把已知基因转移到真核细胞，并且整合到基因组中得到稳定表达的技术，称为基因导入。它是改变物种遗传性状的最根本途径。要把基因导入细胞，首先要把细胞克隆化。目前已经得到了若干真核细胞克隆化基因，如β-珠蛋白基因，TK基因等。利用显微镜操作把这些基因注入到小鼠受精卵的原核中，再把受精卵植入到生殖管道中，发育成的个体不仅能表达注入

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基因决定的性状，而且能把该基因传到第二代。 2.4.2基因导入的方法

基因导入的方法总体有物理方法，化学方法和生物学方法。其中物理方法主要有DNA直接注射法、颗粒轰击技术;化学方法主要有脂质体载体、受体介导法；生物学方法主要通过构建病毒载体来完成，常见的有逆转录病毒、腺病毒、单纯疱疹病毒等。

2.5基因的导入后的筛选与鉴定

2.5.1筛选与鉴定的原因

由于DNA分子的体外重组是分子群体间的反应，因此连接反应完成后的体系中不仅含有正确的重组子，还含有一些不正确的重组子及为重组的DNA，如载体自身环化形成的DNA 分子，外源DNA片段彼此相连形成的多聚物等。因此，连接物转化受体细胞后，我们需要采用适当的方法将所需要的目的基因转化重组子从非重组子中和细胞群体中筛选和鉴定出来。重组子的筛选与鉴定是基因克隆的重要步骤。 2.5.2筛选与鉴定的方法

筛选与鉴定的方法，在遗传选检测上有插入失活筛选、蓝白斑筛选；在物理检测上有酶切鉴定、PCR检测；此外还可利用核酸分子杂交检测，免疫学检测，核酸序列分析等方法。

2.6目的基因的表达与鉴定

2.6.1目的基因表达与鉴定的原因

克隆的基因只有通过表达才能探索和研究基因的功能以及基因表达调控的机理，克隆基因表达出所编码的蛋白质可供做结构与功能的研究。有些具有特定生物活性的蛋白质在医学上以至在工业上都是很有应用价值的，可以克隆其基因使之在宿主细胞中大量表达而获得。 2.6.2目的基因的表达系统与鉴定方法迄今为止，已建立的基因表达系统有多种，包括原核生物表达系统和真核生物表达系统。常用的原核生物表达系统有大肠杆菌表达系统，芽孢杆菌表达系统和链霉菌表达系统等；常用的真核生物表达系统是酵母表达系统、哺乳动物细胞表达系统和昆虫细胞表达系统等。而其中最具代表性的是大肠杆菌表达系统和酵母菌表达系统。

目的蛋白的鉴定方法包括生化反应检测法，免疫学检测法和生物学活性检测法等。常用的有SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳、Western杂交、等点聚焦电泳和双向电泳等。

3、基因工程生产干扰素

3.1、干扰素目的基因的分离与扩增

(1)破碎细胞，用Trizol法提取总的RNA

(2)将生产干扰素的人白细胞的mRNA分级分离然后进行凝胶电泳切取相对分子质量为256bp的部分

(3)mRNA反转录成cDNA

cDNA第一链的合成（Reverse Transcription）。

选用GIBICOL公司提供的SuperScriptTM Preamplification System for First Strand cDNA Synthesis 试剂盒使用Oligo(dT)引物（因为Oligo(dT)与mRNA的Poly(A)尾巴可以发生特异性结合，所以用Oligo(dT)特异结合到mRNA上Poly(A)尾端，以此可以特异地将mRNA从总RNA中分离出来。属于亲和层析技术。）

在0.5ml微量离心管中，加入总RNA 1-5μg，补充适量的DEPC H2O使总体积达11μl。在

管中加10μM Oligo（dT）12-18 1μl，轻轻混匀、离心; 70℃加热10min，立即将微

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量离心管插入冰浴中至少1min。然后加入下列试剂的混合物： 10×PCR buffer 2μl 25mm MgCl2 2μl 10mM dNTPmix 1μl 0.1M DTT 2μl 轻轻混匀，离心。42℃温育2-5min; 加入SuperscriptⅡ1μl ，在42℃水浴中温育50min; 于70℃加热15min以终止反应; 将管插入冰中，加入RNase H 1μl ，37℃温育20min，降解残留的RNA。-20℃保存备用. (4)PCR扩增目的基因

双链cDNA在94℃预变性5min，94℃变性30s，迅速冷却到50℃，引物退火并结合到靶序列上复性2min，然后快速升温至70～75℃，在Taq DNA 聚合酶的作用下，使引物链沿模板延伸

(5)从PCR中分离目的基因

• PCR扩增产物电泳

•将PCR扩增产物适当浓缩（开盖）后，全部上样与2.5%的琼脂糖（TEA）缓冲液，

电压60V，电泳时间2h。通过凝胶成像系统观察分析谱带的形状，切取512pb处的目标片段，双蒸水洗涤三次，离心得目的基因。•测序：Sanger双脱氧链终止法 (6)人工加尾形成“粘性末端”

3.2、目的基因与克隆载体进行体外重组

（1）将 cDNA 重组到载体上合成的 cDNA 与载体 DNA 进行连接一般有 3 种方法：①借助于末端转移酶的 3' -OH 端合成均聚物的能力，双链 cDNA 和线性化载体 DNA 的 3' -OH 端分别加上均聚核苷酸链；

②双链 cDNA 和线性化载体 DNA 分别用 Klenow 片段进行末端补平，然后用 T4 DNA 连接酶进行齐头连接，形成重组体；③通过粘性末端连接

(2) 提取载体（质粒、病毒等），双酶切，再把干扰素基因的PCR产物用相应的酶酶切，用连接酶连接。

3.3、重组质粒转入大肠杆菌宿主细胞

将cDNA克隆到含有四环素、氨苄青霉素抗性基因的质粒pBR322中，转化到大肠杆菌，重组的载体 DNA 分子在一定条件下转化入大肠杆菌，形成携带质粒的菌株。当不同重组的 DNA 含有不同的 cDNA 基因时，整个转化子含有来自 mRNA 群体的各种 cDNA 基因，这样的转化子群体构成该 mRNA 全部遗传信息的 cDNA 基因文库。

3.3、受体菌的筛选

步骤一：将细菌涂布到含氨苄青霉素的培养基上培养，就可得到质粒PBR322或重组质粒的细菌单菌落。

步骤二：步骤一获得的每一个细菌单菌落标记为a、b、c、d等，在每一个单菌落中挑取部分细菌转涂到含有四环素的培养基上，不能生长的是绝大部分含有重组质粒的细菌及少量可能发生突变的非重组质粒的细菌单菌落。原因：因为PBR322含有抗四环素基因，重组质粒中目的基因插在抗四环素基因中，使其结构破坏，失去抗四环素作用。

3.4、构建工程菌

（1）对上一步获得含目的基因的大肠杆菌在含有氯霉素的培养基中扩大培养（2）破碎大