免疫组化流程

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免疫组化的原理及流程介绍

免疫组化原理及流程介绍
(2)封闭内源性过氧化酶
其主要目的是降低内源性过氧化物酶的活性。在传统的ABC法和SP 法中，免疫组化反响结果简洁受到内源性过氧化物酶的干扰，必需用过氧化氢等进展灭活。
免疫组化原理及流程介绍
具体操作:
1)用封闭通透液浸润切片 30 min〔RT 避光〕。其配法是用预热 40 ml PBS 加120ul TritonX-100 加热几分钟，在临用前加 400 ul的30％H2O2。
80年月 Hsu 等建立了抗生物素—生素〔ABC〕法之后，免疫金—银染色法、半抗原标记法、免疫电镜技术相继问世。 90年月分子杂交技术、原位杂交技术、免疫细胞化学分类方法快速进展。 2023年各种免疫组化技术更加成熟，使免疫组化技术成为当今生物医学中形态、功能代谢综合争论的一项有力工具。其应用范围深达医学各个学科，是目前生命科学工作者应当把握的根本技术之一。
免疫组化原理及流程介绍
留意事项：
• 1.苏木素复染时间需要摸索，尤其要考虑阳性染色的位置。
• 2.切片脱蜡和水化要充分；加反响液时要掩盖组织充分；每次加液前甩干洗涤液，但又防止干片。
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• 3.以下缘由可能导致片子着色不均匀： • ① 脱蜡不充分。可以 60 ℃烤 20 min，马上放入新颖
具体操作：
1)将一抗倒掉并用 PBS 洗 5 min×5 次； 2)用滤纸将圆圈四周的水吸去，参加已稀释的二抗后放入 37℃恒温烤箱中 30 min。 3)用 PBS 洗 5 次×5 min
7.SP反响
SP染色法即链霉素抗生物素蛋白生物素过氧化酶连接法。
该法是ABC法根底上的进一步改进，使卵白素与链霉〔而非生物素〕结合，而后再结合PO基。

免疫组化实验步骤流程

免疫组化实验步骤流程1.样品制备：a.组织样品：从动物或人体获得的组织样品首先需要固定在福尔马林中，然后通过蜡包埋技术将组织固定在蜡块中。

之后，将蜡块切成薄片，然后将薄片分别放置于载玻片上。

b.细胞样品：将细胞悬浮液放置在载玻片上，并用福尔马林进行固定。

2.抗原恢复：固定的组织或细胞样品经过脱水和脱脂处理后，需要通过抗原恢复来揭示隐藏的抗原。

抗原恢复的方法可以是热处理、酶切或化学处理等。

3.形成蛋白结合位点：将载玻片上的样品用蛋白结合剂如牛血清白蛋白（BSA）、鱼胶或生物素素蛋白结合剂等进行封闭处理，以防止非特异性结合。

4.孵育抗体：a.主抗体：将特异性的首要抗体加入到样品中，与目标抗原结合形成抗原抗体复合物。

b.辅助抗体：添加荧光素或酶标记的次抗体，与主抗体结合，以扩大信号的产生。

5.洗涤：用缓冲液洗涤载玻片，以去除未结合的抗体和其他无关物质。

6.信号增强：a.酶标记的实验，为了增加信号强度，可以加入荧光素或发光底物。

b.荧光标记的实验，可以直接观察荧光。

7.显色：在酶标记的实验中，加入染色底物以产生可见的颜色，从而定位并显示目标抗原的存在。

8.盖玻片：在涂抹适当封片剂后，将载玻片盖上一片封片玻片，以保护样品并减少光的干扰。

9.显微镜观察：使用显微镜观察载玻片下的样品，并通过图像系统进行图像捕捉和分析。

10.结果评估：评估图像和数据以确定抗原的表达和分布情况。

根据实验目的，可以进行半定量或定量的数据分析。

需要注意的是，免疫组化实验中的条件、试剂和步骤会因实验目的不同而略有差异。

因此，在进行实验前需仔细阅读相关文献和制定适合的实验方案，以确保实验结果的准确性和可靠性。

免疫组化及PCR操作流程

细胞免疫组化步骤1. PBS冲洗两次2. 丙酮固定10min3. 浸入0.75%H2O2-PBS(30%H2O2 0.05 ml+PBS 2ml) 37℃30 min4. PBS振洗2次,每次3min5. 加封闭血清,湿盒内37℃30 min6. 弃去血清7. 加一抗, 37℃30~60min (1:200 1:150稀释)8. PBS振洗3次,每次3min9. 加二抗, 37℃30 min10. PBS振洗3次,每次3min11. 加ABC复合剂, 37℃30 min12. PBS振洗2次,THB(Tris-HCl缓冲液0.5mol/l,PH 7.6 )振洗1次,每次3min13. 浸入新鲜底物溶液（DAB50mg+100ml THB）,在室温下暗处10~20min14. 自来水洗5min15. 染核浸入苏木素染液2min,自来水洗，迅速过盐酸酒精，自来水洗，过氨水，自来水洗16. 逐级脱水，70％1次，95％2次，无水3次每次1min17. 透明，过二甲苯3次，每次1min18. 封片将有细胞的一面向下封片一、免疫组化操作规程（一）、仪器设备1）18cm不锈钢高压锅或电炉或医用微波炉；2）水浴锅（二）、试剂1）PBS缓冲液（pH7.2～7.4）：NaCl 137mmol/L，KCl 2.7mmol/L，Na2HPO4 4.3mmol/L，KH2PO4 1.4mmol/L。

2）0.01mol/L柠檬酸盐缓冲液（CB，pH6.0，1000ml）：柠檬酸三钠3g，柠檬酸0.4g。

3）0.5mol/L EDTA缓冲液（pH8.0）：700ml水中溶解186.1gEDTA·2H2O，用10 mmol/L NaOH调至pH8.0,加水至1000ml。

4）1mol/L的TBS缓冲液（pH8.0）：在800ml水中溶解121gTris碱，用1N的HCl调至pH8.0,加水至1000ml。

5）酶消化液：a、0.1%胰蛋白酶液：用0.1%CaCl2(pH7.8) 配制。

免疫组化手工流程介绍

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1. 组织制备。

采集新鲜组织或福尔马林固定组织，切成4-5μm厚度的石蜡包埋切片。

免疫组化实验步骤

免疫组化操作步骤一、实验原理与意义免疫组织化学又称免疫细胞化学，是指带显色剂标记的特异性抗体在组织细胞原位通过抗原抗体反应和组织化学的呈色反应，对相应抗原进行定性、定位、定量测定的一项新技术。

它把免疫反应的特异性、组织化学的可见性巧妙地结合起来，借助显微镜(包括荧光显微镜、电子显微镜)的显像和放大作用，在细胞、亚细胞水平检测各种抗原物质(如蛋白质、多肽、酶、激素、病原体以及受体等)。

（一）、仪器设备1. 18cm不锈钢高压锅或电炉或用微波炉.2. 水浴锅（二）、试剂1. PBS缓冲液（ph7.2―7.4）：NaC137mmol/L，KCl2.7mmol/L ,Na2HPO4 4.3mmol/L, KH2PO4 1.4mmol/L. 2．0.01mol/L柠檬酸钠缓冲液（CB,ph6.0,1000ml）：柠檬酸三钠3g,柠檬酸0.4g。

3．0.5mol/L EDTA缓冲液（ph8.0）：700ml水中溶解186.1g EDTA& 8226;2H2O,用10mmol/L NaOH调至ph8.0,加水至1000ml.4. 1mol/L的TBS缓冲液（ph8.0）：在800ml水中溶解121gTris碱，用1N的HCl调至pH8.0, 加水1000ml。

5. 酶消化液：a.0.1%胰蛋白酶:用0.1%CaCl 12(ph7.8)配制。

b.0.4%胃蛋白酶液：用0.1N的HCl配制。

6. 3%甲醇―H2O2溶液：用30%H2O2和80%甲醇溶液配制7. 风裱剂：a.甘油和0.5mmol/L碳酸盐缓冲液（pH9.0–9.5）等量混合 b 油和TBS(PBS)配制8．TBS/PBS PH9.0–9.5,适用于荧光纤维镜标本;ph7.0-7.4适合光学纤维标本（三）、操作流程1、脱蜡和水化：脱蜡前应将组织芯片在室温中放置60分钟或60℃恒温箱中烘烤20分钟。

a 组织芯片置于二甲苯中浸泡10分钟,更换二甲苯后在浸泡10分钟b 无水乙醇中浸泡五分钟c 95%乙醇中浸泡五分钟d 75%乙醇中浸泡五分钟2、抗原修复：用于福尔马林固定的石蜡包埋组织芯片：A 抗原热修复a 高压热修复在沸水中加入EDTA(ph8.0)或0.01m枸橼酸钠缓冲溶液（ph6.0）.盖上不锈钢锅盖，但不能锁定。

免疫组化操作流程

1.脱蜡复水：
（1）石蜡切片浸泡在二甲苯中2次（分别置入两个装有二甲苯的染缸），每次10min；
（2）无水乙醇、95%、85%、75%、50%乙醇、纯水中依次放置5min；
（3）PBS缓冲液中浸泡5min。

2.抗原修复：
（1）加入H2O2，湿盒中孵育10min，PBS浸泡冲洗3次，每次5min；
（2）放入0.01M枸橼酸缓冲液中，微波炉大火加热至沸腾（保持8min）；
（3）待修复液温度降至室温，PBS冲洗2次，每次5min。

3.免疫反应：
（1）滤纸擦去多余的PBS，低价PBS稀释的10%正常山羊血清，室温下湿盒封闭30-60min；
（2）孵育结束后去除封闭液，滴加一抗工作液，4度孵育过夜；
（3）移去一抗工作液后，用PBS冲洗2次，每次10min，擦去切片周围多余液体；
（4）滴加二抗工作液，室温湿盒孵育30min，弃去二抗后PBS洗2次，每次10min。

4.化学染色：
（1）擦去切片上多余PBS，滴加新鲜配置的DAB工作液，湿盒孵育，显微镜检测染色程度；
（2）染色结束后PBS洗去DAB染液3次，每次5min；
（3）去除残留液体，苏木素复染25min；
（4）复染结束后，清水洗去，1%盐酸酒精中风化数秒，再次水洗。

5.脱水封片：
（1）依次将切片放入50%、75%、85%、95%乙醇和无水乙醇中，各放置5min；
（2）二甲苯中透明化处理2次，每次10min；
（3）脱水处理后，擦去周围液体，滴加几滴中性树胶，盖上盖玻片，用镊子钝端轻敲盖玻片以除去气泡。

免疫组化步骤

免疫组化流程1、固定灌流后尽快取出肾脏（1-2分钟内完成），剥除筋膜和其他结缔组织，取皮质削成薄片，（易于固定液的浸透），臵于 Dwbosy Bra 液24小时，按照D程序转缸。

2、包埋蜡块皮质朝下，组织放平3、切片切2-3微米，用多聚赖氨酸处理的玻片捞组织，用吹风机吹熔组织。

如暂时不做，放-20°冻存，室温放臵过久，抗原会丢失4. 烤片：烤箱60°1小时后尽快放入二甲苯缸脱蜡5. 脱蜡及水化：二甲苯1----二甲苯2---二甲苯3---无水乙醇---90%乙醇---75%乙醇，每缸10分钟6. 抗原修复先用微波炉将缓冲液中火3分钟煮沸，再将片子臵入，低火10-20分钟修复抗原7.3﹪H2O2室温孵育10分钟，PBST3min洗三次8.羊血清室温孵育15分钟，不洗9. 一抗4°过夜， PBST3min洗三次10. 生物素化的二抗15分钟， PBST3min洗三次11.亲和素——链霉素——过氧化物酶复合物即“三抗”15分钟，PBST 3min洗三次12. DAB显色13.核复染苏木素5min——盐酸酒精1min——氨水5min，染完冲水，风干14.中性树胶封片，37°烘片2小时建议：1、全程尽可能减少干片的机会，以降低非特异性染色2、抗原修复应在H2O2之后，以便高温时进一步脱蜡重要步骤说明：1、标本固定固定的目的：1）保持组织细胞原有的形态结构2）使组织硬化固定的优、缺点：优点：使组织细胞的形态结构得到保持缺点：拟检物质反应性减弱，酶的活性易受损2、脱蜡及水化这是为了后面的抗体等试剂能够充分与组织中抗原等结合反应。

水化用梯度乙醇（由高到低即无水乙醇---90%---75%）。

若脱蜡和水化不全易出现局灶性反应和浸洗不全，而产生非特异性背景着色。

3、抗原修复抗原修复的原因：固定液中的醛基与抗原蛋白的氨基酸残基交联形成羧甲基, 使抗原决定簇的三维构象出现空间障碍, 再则由于分子间的交联形成的网格结构,可能部分或完全掩盖某些抗原决定簇, 使之不能充分暴露, 这些均可造成假阴性的染色结果。

免疫组化实验步骤

免疫组化实验步骤免疫组化操作步骤一、实验原理与意义免疫组织化学又称免疫细胞化学，是指带显色剂标记的特异性抗体在组织细胞原位通过抗原抗体反应和组织化学的呈色反应，对相应抗原进行定性、定位、定量测定的一项新技术。

（一）、仪器设备1. 18cm不锈钢高压锅或电炉或用微波炉.2.水浴锅（二）、试剂1. PBS缓冲液（ph7."2―7."4）：NaC137mmol/L，KCl2."7mmol/L ,Na2HPO44."3mmol/L, KH2PO41."4mmol/L.2．"0.01mol/L柠檬酸钠缓冲液（CB,ph6."0,1000ml）：柠檬酸三钠3g,柠檬酸0."4g。

3．0."5mol/L EDTA缓冲液（ph8."0）：700ml水中溶解186."1g EDTA& 8226;2H2O,用10mmol/L NaOH调至ph 8."0,加水至1000ml.4. 1mol/L的TBS缓冲液（ph8."0）：在800ml水中溶解121gTris碱，用1N的HCl调至pH 8."0,加水1000ml。

5.酶消化液：a.0."1%胰蛋白酶:用0."1%CaCl 12(ph7."8)配制。

b.0."4%胃蛋白酶液：用0."1N的HCl配制。

6. 3%甲醇―H2O2溶液：用30%H2O2和80%甲醇溶液配制7.风裱剂：a.甘油和0."5mmol/L碳酸盐缓冲液（pH9."0–9."5）等量混合b油和TBS(PBS)配制8．"TBS/PBS PH9."0–9."5,适用于荧光纤维镜标本;ph7."0-7."4适合光学纤维标本（三）、操作流程1、脱蜡和水化：脱蜡前应将组织芯片在室温中放置60分钟或60℃恒温箱中烘烤20分钟。

免疫组化流程步骤

免疫组化流程---袁燕平以下步骤为本人免疫组化常用步骤，流程与常见流程无异，流程如下；1 脱蜡---脱蜡前首先烤片10分钟，二甲苯1，2，3，各10分钟。

二甲苯应该经常更换！2 水化---梯度酒精至水，100％5分钟，100％5分钟，95％3分钟,85％3分钟,75％3分钟，自来水流水冲3分钟。

注意冲水时水量不宜过大，细流即可！3 抗原修复---采取微波加热修复，修复液为柠檬酸盐溶液（最常用），具体方法为：先将修复液加热至沸腾，然后放入玻片，先使用中火8分钟，然后低火8分钟。

一般要求热修复时间达到15分钟才能达到比较好的抗原修复作用。

请注意：在抗原修复完成之后要求玻片上组织一直保持湿润，千万不能出现组织风干的情况。

部分抗原分子可无需进行抗原修复。

4 冷却---一般采取流水降温冷却法，即将容器置于自来水流水中缓慢降温，降温不宜过快，30分钟为好。

部分实验室采取自然冷却法。

5 灭内源性过氧化物酶---注意此时开始一直将玻片置于湿盒中保湿！滴加液体前先用免疫组化专用笔绕组织涂画一圈，甩干组织上的水分，用力不要过猛，然后滴加3％的过氧化氢-甲醇溶液（或者医用3％的过氧化氢），室温15min。

（因为免疫组化中使用的显色液的主要成分为过氧化氢，灭酶可以避免假阳性的出现）。

随后PBS洗3次3分钟。

6 封闭---甩干组织上的液体，滴加与二抗来源相同的非免疫血清（兔血清常用），室温封闭20分钟。

提前配制一抗，使用抗体稀释液（或PBS）按1:100-400（酌情）比例稀释一抗。

每块组织滴加10-30ul体积抗体即可，每次使用前必须新鲜配制，抗体稀释后尽快使用。

7 孵一抗---不需PBS洗，可甩干组织上的液体并滴加合适稀释度的一抗， 4度过夜孵育。

8 复温---将湿盒从冰箱拿出置于室温中15分钟。

PBS洗3次3分钟。

9孵二抗---甩干组织上的液体，滴加二抗，每张切片约滴加10ul即可，注意液体面积要大于组织面积，否则显色时出现边缘效应（假阳性），37度孵育30-60分钟。

免疫组化实验流程审批

免疫组化实验流程审批免疫组化实验是一种常用的生物学和医学研究技术，它对于疾病的诊断、治疗和研究具有重要意义。

为了确保实验的准确性、可靠性和安全性，需要建立一套严格的实验流程审批制度。

一、免疫组化实验的基本原理和应用免疫组化实验基于抗原与抗体特异性结合的原理。

通过将特定的抗体与组织或细胞中的抗原结合，再利用显色反应或荧光标记等方法，使抗原所在的位置得以显示。

这一技术广泛应用于肿瘤诊断、病理学研究、神经科学、免疫学等领域。

在肿瘤诊断中，免疫组化可以帮助确定肿瘤的类型、来源、分化程度以及预测肿瘤的预后和对治疗的反应。

例如，乳腺癌中雌激素受体、孕激素受体和HER2 的检测，对于治疗方案的选择具有重要指导意义。

二、实验前的准备工作1、实验人员资质从事免疫组化实验的人员应具备相关的专业知识和技能，经过系统的培训，并熟悉实验室的安全操作规范。

实验人员需要了解免疫组化的基本原理、实验步骤、常见问题及解决方法。

2、实验材料和试剂选择合适的组织样本、抗体、显色剂等实验材料和试剂至关重要。

组织样本应保证新鲜、固定良好，并经过正确的处理和保存。

抗体的选择应根据实验目的和样本类型，确保其特异性和亲和力。

显色剂应具有良好的稳定性和显色效果。

3、实验设备和仪器准备齐全且性能良好的实验设备和仪器，如切片机、孵育箱、显微镜等。

设备应定期进行维护和校准，以保证实验结果的准确性和可靠性。

三、免疫组化实验流程1、组织样本处理（1）取材：从生物体中获取组织样本时，应遵循无菌操作原则，避免样本受到污染。

（2）固定：将组织样本迅速放入适当的固定液中，如福尔马林，以保持组织的形态和结构。

（3）脱水：通过梯度酒精脱水，去除组织中的水分。

（4）包埋：将脱水后的组织样本包埋在石蜡中，便于切片。

2、切片制作使用切片机将包埋好的组织切成薄切片，通常厚度为 4-6 微米。

切片应平整、完整，无褶皱和裂痕。

3、脱蜡和水化将切片放入二甲苯中脱蜡，然后依次经过梯度酒精进行水化。

免疫组化实验流程审批

免疫组化实验流程审批免疫组化实验是一种在生物学和医学研究中广泛应用的技术，它能够帮助我们深入了解细胞和组织中的蛋白质表达情况，对于疾病的诊断、治疗和研究具有重要意义。

为了确保实验的准确性、可靠性和安全性，需要对免疫组化实验流程进行严格的审批。

一、免疫组化实验的基本原理免疫组化实验的原理是基于抗原与抗体的特异性结合。

在实验中，我们首先将组织或细胞样本进行处理，使其暴露抗原位点。

然后，加入特定的抗体，这些抗体能够与我们感兴趣的抗原结合。

通过一系列的显色反应，我们可以观察到抗原在组织或细胞中的分布和表达情况。

二、免疫组化实验的流程1、样本采集与固定样本的采集必须遵循严格的操作规程，以确保样本的质量和完整性。

常见的样本包括组织切片、细胞涂片等。

采集后的样本需要立即进行固定，常用的固定剂有福尔马林等，固定的目的是保持细胞和组织的形态结构，防止抗原的降解和丢失。

2、脱水与包埋固定后的样本需要经过脱水处理，以去除组织中的水分。

然后，将样本包埋在石蜡或其他包埋剂中，以便后续进行切片。

3、切片与贴片使用切片机将包埋好的样本切成薄片，厚度一般在 4 6 微米。

切好的切片需要贴附在载玻片上，以便进行后续的实验操作。

4、脱蜡与水化贴片后的样本需要经过脱蜡处理，去除石蜡。

然后，进行水化，使样本恢复到正常的生理状态。

5、抗原修复由于在固定和处理过程中，抗原可能会发生部分变性或遮蔽，因此需要进行抗原修复，以暴露抗原位点。

常用的抗原修复方法有热修复、酶修复等。

6、封闭为了减少非特异性结合，需要在样本上加入封闭液，封闭非特异性结合位点。

7、一抗孵育加入特异性的一抗，使其与样本中的抗原结合。

一抗的选择和浓度需要根据实验的要求进行优化。

8、二抗孵育一抗孵育结束后，加入与一抗特异性结合的二抗。

二抗通常带有标记物，如荧光素、酶等，以便后续进行显色反应。

9、显色根据二抗所带的标记物，选择相应的显色方法。

常见的显色方法有DAB 显色、荧光显色等。

免疫组化实验设计

免疫组化实验设计主要包括以下几个步骤：
1. 实验目的：明确实验的目的和意义，确定要检测的蛋白类型、样本类型、实验参数等。

2. 样本准备：选取合适的样本类型，如组织切片、细胞涂片、细胞培养等，并进行预处理，包括固定、脱水、包埋等步骤。

3. 抗原修复：由于组织在固定过程中会发生蛋白之间交联及醛基的封闭作用，因此需要进行抗原修复，以便更好地暴露抗原。

4. 血清封闭：为了防止一抗与组织非特异性结合，需要进行血清封闭。

5. 一抗和二抗的选择：根据实验目的和样本类型，选择合适的一抗和二抗，并进行稀释比和孵育条件的优化。

6. 显色反应：通过化学反应使酶标记的抗体与显色剂进行显色反应，生成有色产物，以便后续观察和检测。

7. 观察和检测：采用显微镜观察样本，并记录实验结果。

根据需要，可以采用定量或半定量方法进行结果分析。

8. 实验结果的解释与结论：根据实验结果，解释实验结果的意义，并得出结论。

在免疫组化实验设计中，需要注意以下几点：
1. 保证实验的特异性：选择针对目标蛋白的一抗，并排除非特异性结合的干扰。

2. 控制实验条件的一致性：保证实验中各步骤的条件一致，以便准确比较不同样本的结果。

3. 注意实验的重复性：为了保证实验结果的可靠性和准确性，需要进行重复实验，并对结果进行统计分析和检验。

免疫组化实验流程

免疫组织化学对1月龄以上大鼠，以10%水合氯醛腹腔注射麻醉后，开胸，经主动脉灌流37℃生理盐水200ml，继以400ml 4%多聚甲醛固定液(用0.1mol/L磷酸缓冲液(PB, pH7.4))灌流固定，取脑、神经垂体入上述固定液中后固定约6h(4℃)后转入30%蔗糖（用0.1 mol/l PB配制，下同）4℃过夜。

对出生后1天(P1)、7天(P7)和14天(P14)的新生鼠或幼鼠，直接取脑入固定液固定24h(4℃)后转入30%蔗糖4℃过夜，第2天行恒冷箱冰冻切片(30 m)。

按下列步骤对切片进行免疫组织化学反应(ABC法)：⑴含1% Triton X-100和0.03 %H2O2的0.01 mol/L 磷酸盐缓冲液(PBS, pH7.4)室温30min；⑵含3%牛血清白蛋白(BSA, Sigma)和1%正常羊血清(NGS, V ector)的0.01 mol/L PBS室温30min；⑶兔抗HAP1－B多克隆抗体（1：50000，本实验室自制），或羊抗CHA T抗体(1:400,Temecula)，室温孵育过夜。

抗体用含3%牛血清白蛋白(BSA，Sigma)和1%NGS的0.01 mol/L PBS稀释(下同)；⑷0.01 mol/L PBS 漂洗3次，每次10min;⑸生物素化羊抗兔IgG(1:200, V ector)或生物素化兔抗羊IgG（1：200，中杉金桥）室温2h;⑹0.01 mol/L PBS 漂洗3次，每次10min;⑺ABC(1:100, V ector) 室温2h;⑻0.01 mol/L PBS 漂洗3次，每次10min;⑼含0.03%DAB和0.006% H2O2的Tris盐酸缓冲液(TB, pH7.6)室温10~15 min。

⑽常规脱水、透明、树脂封片免疫荧光双标灌流固定动物、取切片后，按下列步骤对切片进行双标反应：⑴含1 % Triton X-100和0.03 %H2O2的0.01 mol/LPBS室温30min；⑵含3% BSA和2%正常驴血清(NDS)的0.01 mol/L PBS室温30min；⑶羊抗CHAT(1:400)和兔抗HAP1抗体(1:50000) 室温过夜；⑷0.01 mol/L PBS 漂洗3次，每次10min;⑸Rodamine Red标记的豚鼠抗兔IgG（1：500）和FITC标记的抗羊IgG（1；200）室温3h(避光)；⑹0.01 mol/L PBS 漂洗3次，每次10min(避光);⑺含20%甘油的0.01 mol/L PBS封片。

vegf免疫组化流程

vegf免疫组化流程VEGF（vascular endothelial growth factor）是一种重要的血管内皮生长因子，能够促进血管生成和血管通透性增加。

VEGF免疫组化是一种常用的实验方法，用于检测组织或细胞中VEGF的表达水平。

下面是一般的VEGF免疫组化流程：1. 取得组织样本：首先需要获取需要检测的组织样本，可以是固定的组织切片或细胞。

2. 制备切片：如果使用组织切片，需要将组织样本进行固定、脱水、包埋等处理，然后用切片机将组织切成薄片。

3. 脱脂和去蜡：将切片放入去脂溶剂中脱脂，然后用去蜡剂去除蜡质。

4. 抗原修复：将切片放入抗原修复液中，通过高温或低温处理，使得细胞或组织中的VEGF蛋白变得更容易被抗体识别。

5. 阻断非特异性结合：将切片放入阻断液中，阻断非特异性结合位点，减少假阳性结果。

6. 抗体结合：将切片放入含有VEGF抗体的抗体溶液中，使抗体与样本中的VEGF蛋白结合。

7. 洗涤：将切片用缓冲液洗涤，去除未结合的抗体。

8. 反应物结合：将切片放入含有与VEGF抗体结合的酶标记二抗或荧光二抗的溶液中，使其与VEGF抗体结合。

9. 洗涤：将切片用缓冲液洗涤，去除未结合的二抗。

10. 显色或荧光染色：使用适当的显色剂或荧光染料，使结合了二抗的切片产生可见的颜色或荧光。

11. 脱水和封片：将切片依次放入乙醇溶液中脱水，然后用透明剂澄清，最后用封片剂封闭切片。

12. 显微镜观察：将封好的切片放入显微镜下观察，通过显色或荧光信号的强度和分布来判断样本中的VEGF表达水平。

需要注意的是，不同实验室可能会有一些细微的差异，具体的实验步骤和试剂使用可能会有所不同。

因此，在进行VEGF免疫组化实验时，最好参考特定实验室或研究文献中的具体流程。

免疫组化流程

1.常规石蜡切片厚度4微米，放入70℃烤箱烤片1小时。

2.切片脱蜡程序：1）二甲苯Ⅰ、Ⅱ脱蜡各15分钟；2）无水乙醇Ⅰ、Ⅱ各5分钟；3）95%乙醇5分钟；4）90%乙醇5分钟；5）80%乙醇5分钟；6）70%乙醇5分钟。

3.PBS缓冲液中洗涤5分钟×3次，确保洗涤充分。

4.3％过氧化氢水溶液10分钟，以去除内源性过氧化酶。

5.PBS缓冲液中洗涤5分钟×3次。

6.微波修复柠檬酸6.0修复液预热，放入切片加热2-3分钟至水温≥95℃，保持2-3分钟。

然后10秒加热一次，中高火，间隔50秒，反复循环5次。

放置至正常室温。

7.PBS缓冲液中5分钟×3次。

8.10%的牛血清封闭水浴盒37℃孵育8.取出切片，擦干组织周围液体后滴加一抗，注意保持组织湿润状态但表面不能有液体，要求抗体全部覆盖组织面且不能有气泡，以使抗体能全部与组织接触。

9.滴加一抗后放入专用孵育盒内4℃冰箱内过夜。

1:10010.甩掉一抗，切片放入PBS缓冲液中清洗5分钟×3次，充分洗涤，防止因一抗洗涤不净引起的非特异性染色。

11.PBS缓冲液中5分钟×3次。

12.滴加二抗，放入专用孵育盒内37℃孵育1小时。

13.切片入PBS缓冲液内洗涤5分钟×3次，充分洗涤，防止因洗涤不净引起的非特异性染色。

14. 进行DAB显色，显色时间显微镜下控制。

如显色时间太短，阳性强度不够，阳性部位不突出，如显色时间过长，背景着色较深，阳性部位对比差，均不利于诊断。

15.苏木素复染细胞核，一般时间为30秒（依苏木素新旧不同可适当增减时间）。

16.分化、返蓝。

此时可随机抽取几张切片镜下观察，并依据对比程度观察细胞核复染强度是否合适。

17.梯度酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。

1）脱水一定要彻底；2）透明时间可稍延长，使切片更加清晰；3）封片时不能有气泡，以免影响镜下观察。

免疫组化过程及原理

免疫组化过程及原理免疫组化，是一种通过特异性抗体和荧光素等探针对组织切片中的分子进行定位和鉴定的技术。

这种技术广泛应用于生物医学研究和医学诊断中。

本文将介绍免疫组化的过程和原理。

一、样品制备样品制备是免疫组化技术的第一步。

样品主要包括组织切片、胞液、细胞培养物等。

制备样本主要方法有固定、切片、脱水等步骤。

在进行免疫组化之前，必须使用固定剂对样本进行固定。

固定剂的选择应根据不同的样品以及需要检测的分子性质而定。

通常，使用含有甲醛或戊二醛的固定剂。

二、抗体选择和标记选择适当的抗体和相应的探针是免疫组化技术的关键。

抗体是能特异性与靶分子结合的蛋白质，可通过季节性生产、杂交瘤融合技术等方法制备。

标记技术有荧光标记、酶标记、金粒子标记等。

取决于使用的抗体和探针类型，所使用的技术将会是不同的。

三、特异性识别将标记好的抗体溶液滴到固定后的组织切片表面，然后进行特异性识别，即特异性抗体与分子特异性结合的过程。

在该步骤中，选定的抗体只与需要检测的分子特异性的表达区域结合。

四、荧光检测使用荧光显微镜检测标记分子特异性抗体对组织切片上分子特异性结合的情况。

在免疫组化的过程中，荧光探针的特异性荧光信号为明显的标记。

荧光显微镜能够捕捉到这些信号，并将它们转化成清晰可见的图像。

通过荧光检测可以确定细胞表达、蛋白质定位、蛋白质互作等。

五、数据记录和结果分析将荧光显微镜的图像记录下来，并通过图像分析软件进行数据处理和结果分析。

对比对照组、干预组与实验组数据，确定显著的差异。

进行加权平均、标准差、方差等数学方法，基于统计学得出可靠的结论。

六、检测标准化免疫组化技术在不同实验室或者不同操作者之间具有高度可变性。

为了在不同的实验室、不同的操作者不同的样品下得出相同的结果，需要标准化免疫组化的流程。

标准化流程包括选择合适的抗体、标准化抗体稀释度、制剂及品质检测，检测标准的制定等。

标准化流程的制定保证了实验之间的准确性和可重复性，提高了免疫组化技术的可靠性。

免疫组化操作流程

免疫组化操作流程（一）、仪器设备1. 18cm不锈钢高压锅或电炉或用微波炉.2. 水浴箱（二）、试剂1. PBS缓冲液（pH7.2―7.4）2．0.01mol/L柠檬酸钠缓冲液（CB,pH 6.0,1000ml 3．0.5mol/L EDTA缓冲液（pH 8.0）4. 1mol/L的TBS缓冲液（pH 8.0）5. 酶消化液：a. 0.1%胰蛋白酶 b.0.4%胃蛋白酶液6. 3%甲醇―H2O2溶液7. 风裱剂：a. 甘油和0.5mmol/L碳酸盐缓冲液（pH 9.0–9.5）等量混合 b 油和TBS(PBS)配制8．TBS/PBS pH 9.0–9.5,适用于荧光纤维镜标本; pH 7.0-7.4适合光学纤维标本（三）、操作流程1、脱蜡和水化脱蜡前应将组织芯片在室温中放置60分钟或60℃恒温箱中烘烤20分钟。

a 组织芯片置于二甲苯中浸泡10分钟,更换二甲苯后再浸泡10分钟b 无水乙醇中浸泡五分钟c 95%乙醇中浸泡五分钟d 75%乙醇中浸泡五分钟2、抗原修复用于福尔马林固定的石蜡包埋组织芯片：A 抗原热修复a 高压热修复在沸水中加入EDTA(pH 8.0)或0.01mmol/L枸橼酸钠缓冲溶液（pH 6.0）.盖上不锈钢锅盖，但不能锁定。

将玻片置于金属染色加上，缓慢加压，是玻片在缓冲液中浸泡五分钟，然后将盖子锁定，小阀门将会升起来。

10分钟后除去热源，置入凉水中，当小阀门沉下去后打开盖子。

此方法适用于较难检测或核抗原的抗原修复。

b 沸热修复电炉或水浴锅加热0.01枸橼酸钠缓冲液（pH 6.0）至95℃左右，放入组织芯片加热10-15分钟。

c 微波炉加热在微波炉里加热0.01枸橼酸钠缓冲液（pH 6.0）至沸腾后将组织芯片放入，断电，间隔5-10分钟，反复1-2次。

适用的抗原：Bcl-2.Bax.AR.PR.C-fos.x-jum.z-kit.c-myc.E-cadherin.ChromograninA.Cyclin.ER.Heatshock.Protein.HPV.Ki-67.MDMZ.P53.P34.P15.P-glycoprotein.PKC.PCNA.ras.Rb.等B 酶消化方法在抗原酶消化修复中，常用0.1%胰蛋白酶和0.4%胃蛋白酶液。

免疫组化步骤及原理

免疫组化步骤及原理引言免疫组化（Immunohistochemistry, IHC）是一种用于检测组织样本中特定蛋白质的方法，它结合了免疫学和组织学的原理和技术。

免疫组化在研究和临床诊断中广泛应用，帮助我们了解疾病的发生机制和诊断疾病的标志物。

本文将介绍免疫组化的步骤及其原理。

免疫组化的步骤免疫组化主要包括抗原修复、抗体染色和结果观察三个主要步骤。

下面我们将详细介绍每个步骤的原理和操作流程。

抗原修复抗原修复是免疫组化中的关键步骤之一。

它的主要目的是使组织样本中的抗原蛋白恢复成可检测的状态。

组织样本在经历固定处理后，抗原会发生变性和交联，导致其结构的改变，使其难以与抗体结合。

因此，需要对组织样本进行抗原修复，以使其恢复原有的抗原性。

抗原修复的方法有两种常用的方式：热原修复和酶解原修复。

热原修复使用高温和缓冲液对样本进行处理，恢复抗原的三维结构，使其可用于抗体的结合。

酶解原修复通过使用酶类，如胰蛋白酶、蛋白酶K等，降解组织样本中的蛋白质，使其中的抗原暴露于溶液中，便于抗体的结合。

具体的操作流程如下： 1. 取出已固定的组织样本，将其置于适当的缓冲液中。

2. 对于热原修复，将样本加热至适当的温度（通常为95-100摄氏度），保持一定的时间（通常为15-30分钟）。

3. 对于酶解原修复，将样本加入含有特定酶的缓冲液中，孵育一定的时间（通常为30分钟至1小时）。

4. 护理样本：对于热原修复，将样本冷却至室温；对于酶解原修复，用PBS（磷酸盐缓冲液）或纯净水洗涤样本。

抗体染色抗体染色是免疫组化的核心步骤，通过与特定抗原结合，可以检测出组织样本中的目标蛋白质。

该步骤涉及抗体的选择、检测系统的建立和染色方法的确定。

抗体选择抗体选择是免疫组化中的关键因素之一。

根据研究或临床需求，选择适当的一抗体和二抗体非常重要。

一抗体通常是针对目标抗原的特异性抗体，可以是单克隆抗体或多克隆抗体。

二抗体通常是对一抗体偶联的辅助抗体，可以是标记有多种标签的抗体，如辣根过氧化酶（HRP）或碱性磷酸酶（AP）。