分子生物学-6细胞凋亡

危难中的细胞啊， 你沉稳不乱， DNA片片切割， 化云梯直通天堂； 细胞体分团相聚， 把生命的凝重浓集在小体上； 分别了朝夕相处的伙伴， 再见了快乐美好的时光； 这一切的一切又融入临近的胞体， 腾出的空间再写生命的篇章。
2001，10，1 试作
一、概述





2．细胞凋亡的形态学及生物化学研究阶段：（19721987） 1977年:人们注意到在生理或病理性刺激条件下，淋巴 细胞发育过程中的凋亡现象。 1980年:Wyllie研究胸腺细胞在糖皮质激素作用下引致的 细胞凋亡变化，总结并建立了细胞凋亡的共同形态学特 征，包括核固缩和DNA降解成寡核苷酸片段等 3．细胞凋亡的分子生物学研究阶段，最近几年 1989年: 0wen及其研究小组在研究胸腺细胞阴性选择过 程中证明了信号传递物质对PCD的调控作用。 1991年:Ellis首先发现了线虫(C.elegans)体内Ced-3、4两 个基因与PCD的发生密切相关，随后逐渐发现了多种参 与PCD的正相调节基因和负相调节基因 4．细胞凋亡的临床应用基础研究阶段 细胞凋亡的研究，其生命力在于最终能够有利于疾病机 制的阐明，以及新疗法的探索及问世。
2002年10月7日英国人悉尼· 布雷诺尔、美国人罗伯特· 霍维 茨和英国人约翰· 苏尔斯顿，因在细胞程序性死亡方面的研
究获诺贝尔诺贝尔生理与医学奖。
他们不但发现在生物的器官发育过程中存在细胞程
序性死亡，而且阐明了细胞程序性死亡过程中的基因规律。
Sydney Brenner
H. Robert Horvitz John E. Sulston
3.
发挥积极的防御作用
病毒DNA
二、细胞凋亡的形态学 变化和生化改变
（一）细胞凋亡的形态学变化
微绒毛消失 脱水 空泡化(blebbing) 固缩(condensation) 出芽(budding) 染色质边集(margination) 凋亡小体(apoptosis body)





细胞首先变圆,随即与邻周细胞脱离, 失去微绒毛,胞浆浓缩,内质网扩张呈泡状并与 细胞膜融合, 核染色质密度增高呈半月形,并凝聚在核膜周 边,核仁裂解, 进而细胞膜内陷将细胞自行分割为多个外有膜 包裹、内涵物不外泄的细胞凋亡小体， 被吞噬细胞或邻周细胞所识别、吞噬,或自然 脱落而离开生物。 不引起炎症反应和次级损伤。
细胞凋亡 Apoptosis
主要内容
概述 细胞凋亡的形态学变化和生化改变
细胞凋亡的过程与调控
细胞凋亡的发生机制
细胞凋亡在疾病防治中的意义
细胞凋亡（科普诗）
似秋叶的凋零， 告别生命之辉煌； 那难以计数的攻击、诱导， 轻启着道道程序， 逼细胞步步走向生命的末端； 啊，活性氧处处肆虐， 钙波涛惊石裂岸， 线粒体把生命之光一点一点拧淡;
细胞凋亡与细胞坏死的比较(一)
坏 死
1.性 质
2.诱 因 3.基因调控
凋 亡
生理性/病理性，特异性
较弱刺激，非随机发生 有 主动过程 有新蛋白合成 耗能
病理性，非特异性
强烈刺激，随机发生 无 被动过程 无新蛋白合成 不耗能
4.生化特点
细胞凋亡与细胞坏死的比较(二)
坏
5.形态改变 6.凋亡小体 7.DNA变化 8.溶酶体改变 9.炎症反应
apoptosis 凋亡过程与调控
形态学特征：
空泡化
固缩
出芽 边集
凋亡时细胞的形态学改变
凋亡小体
染色质边集
正常
凋亡
胸腺细胞
A comparison of normal and apoptotic T-cells.
胸腺细胞
正常 凋亡
（二）细胞凋亡的生化改变
Ca 2+ /Mg 2+ ① 核酸内切酶激活 Zn 2+
（二）细胞死亡的方式

细胞坏死 细胞凋亡 细胞程序性死亡


1.细胞坏死(necrosis)


是细胞受到急性强力伤害时立即出现的反应 早期表现为细胞膜破坏，线粒体肿胀 溶酶体破裂,细胞内容物流出, 引起炎症
坏死
坏死炎细胞浸润
2.细胞凋亡(apoptosis)
•细胞凋亡的概念： 由体内外因素触发细胞内预存的死亡程序而导致 的细胞死亡过程 • 细胞凋亡的特点： ①细胞通过出芽的方式形成许多凋亡小体； ②凋亡小体内有结构完整的细胞器； ③溶酶体活性不增加 ④内切酶活化，DNA片断化，凝胶电泳图谱呈梯状
凋亡
3.细胞程序性死亡


细胞程序性死亡（programmed cell death，
PCD）是一种基因指导的细胞自我消亡方式。
PCD和细胞凋亡的区别在以下方面： PCD是功能性概念，凋亡是形态学概念。 大多数PCD的最终结果是细胞凋亡，但细胞凋亡 并非都是程序化的。 PCD存在于胚胎发育过程中。
（凋亡体）
caspases功能



①灭活细胞凋亡的抑制物: 正常活细胞因为核酸酶处于无活性状态，而不 出现DNA断裂。这是由于核酸酶和抑制物结合 在一起，如果抑制物被破坏，核酸酶被激活， DNA就会被降解，片段化。现知Caspase可以 裂解这种抑制物。 ②水解蛋白质结构，细胞解体，形成凋亡小体 如裂解核纤层，核纤层是由核纤层蛋白通过聚 合作用形成的头尾相接的多聚体，由此形成核 膜的骨架结构，是染色质得以形成并进行正常 的排列。 细胞凋亡时，核纤层蛋白被Caspase在一个近 中部的固定位置裂解，从而使Caspase蛋白崩 解，导致染色质的固缩。
②
DNA片断化
③
caspase激活
灭活凋亡抑制物 水解活性蛋白
水解结构蛋白


1． DNA的片段化：梯状条带形成
核小体连接区被切开：染色质
5min
300 kb
50kb
90min
180~200bp或其整倍数片段
2． 内源性核酸内切酶激活及其作用
由一系列胞内信号转导环节激活，
执行染色质DNHale Waihona Puke Baidu切割
3． 凋亡蛋白酶（caspases）的激活及 其作用


是一组对底物天冬氨酸部位有特异水解作用， 其活性中心富含半胱氨酸的蛋白酶（cysteinecontaining aspartate-spicific protease） 至少有13个成员

第一个被发现的caspase 是 caspase-1,即哺乳类 的ICE (1992,1993), 后来证明ICE与炎症有关而在细胞的死亡中没 有明显作用。 线虫的 CDE-3和ICE有一定的同源性。
cAMP Ca2+ 神经酰胺
Caspases活化 ∶ 巨噬细胞 ↓ 吞噬、分解 凋亡小体形成
apoptosis
凋亡诱导因素 +
受体 cAMP Ca2+ 神经酰胺 死亡信号 信 号 转 导 Dnase激活 Caspases激活
凋亡过程与调控
细胞膜
凋亡相关 基因激活 细胞核
凋亡过程Ⅰ
apoptosis 凋亡过程与调控
Caspases激活 DNase激活 凋亡执行 凋亡细胞的 清除
凋亡过程Ⅱ
（二） 细胞凋亡的调控
1.细胞凋亡相关因素
激素和生长 因子失衡 理化因素 免疫性因素 微生物学因素
大量糖皮质激素 ↓ 淋巴细胞凋亡
诱导性因素
射线/高温/强酸/强碱 /乙醇/抗癌药物 CTL分泌粒酶
HIV→CD4+细胞凋亡
细胞因子 (IL-2/NGF) 激素 (ACTH/睾丸酮/雌激素)

经典凋亡模型
Apoptosis is all around us
（四）生理性细胞凋亡的作用
1.
确保正常发育、生长 在器官、组织的形成、成熟中发挥作用
多余细胞的清除
(细胞团
具备复杂结构的组织器官)
生理性细胞凋亡的作用
2.
维持内环境的稳定
清除受损、衰老和突变的细胞
(针对自身抗原T细胞的清除、子宫内膜周期性剥脱)

③在凋亡级联反应中水解相关活性蛋白：使其 获得或丧失功能 如灭活或下调DNA修复有关的酶，mRNA剪切 蛋白等。
三、细胞凋亡过程与调控
（一）细胞凋亡的过程
凋 亡 诱 因 凋 亡 信 号 转 导
受体
死 亡 信 号
凋 亡 基 因 激 活
DNase活化 ↓ DNA片断
细 胞 凋 亡
凋 亡 细 胞 清 除
Ca2+↑
活化 转录因子
2．cAMP/PKA信号系统（cAMP为第二信使）

依据： ①双丁酰cAMP可引起培养的髓样白血病细胞 及胸腺细胞凋亡 ②糖皮质激素使cAMP上升 cAMP↑→激活PKA→使靶蛋白某些氨基酸 （苏、丝AA）残基磷酸化→改变蛋白质功能
3．Fas蛋白/Fas配体信号系统
（一）细胞凋亡研究简史
1． 凋亡概念的形成
• 细胞凋亡(apoptosis)，是1972年由Kerr等建议 用来描述伴随细胞死亡的一系列形态学上固定的 变化形式的。 • “凋亡”一词来自希腊语，apo意为“分离”， ptosis指花瓣或树叶的脱落， • “凋亡”是由这两个词组合而成，意指细胞凋亡 的形态类似秋天花瓣或树叶的凋落一样
死
凋 亡
细胞皱缩，核固缩 胞膜/细胞器相对完整 有 片段化（180-200bp） 电泳呈“梯”状条带 相对完整 局部无炎症反应
细胞肿胀 结构溶解，破坏 无 弥散性降解 电泳呈均一片状 破裂 局部炎症反应


细胞凋亡的特征是细胞由于降解酶，主要是水 解酶（蛋白酶与核酸酶）的作用，在近乎正常 的细胞质膜内趋向死亡。这与坏死时细胞质膜 早期破损不同。 在细胞凋亡过程中，质膜脂双层丧失二侧不对 称性，磷脂酰丝氨酸暴露于细胞表面，从而导 致被吞噬。
（三）线虫(C.elegant)中的细胞程序性死亡
隐杆秀丽线虫 （Caenorhabditis elegans, C elegans） 低等蠕虫，虫体透明， 易于观察体内细胞形态 的变化。
线虫: 成体959个细胞, 但在发育过程中有 131个细胞会注定发生PCD PCD发生时间:1h 左右 参与线虫PCD的基因，目前已知的有14个
③
① 腺苷酸环化酶←钙调素← Ca2+ ↓ ↓ ② cAMP↑ 谷氨酰胺转移酶 ↓ ↓ PKA↑ 转录因子
APOPTOSIS
caspase↑ ↓ H1组蛋白 神经酰胺 ④ ↓ SPP↑ ↓ AP-1↑ ↓ S期(抗凋)
×
MAPK ↑ MAPKK ↑ Raf-1 ↑ Ras ↑ PTK ↑ ⑥
↓ 分化
THE NOBEL DIPlOMA
2002年诺贝尔医学与生理学颁奖仪式，瑞典斯德哥尔 摩音乐厅。
Sydney Brenner receiving his Nobel Prize from His Majesty the King at the Stockholm Concert Hall. Photo: Hans Mehlin, Nobel e-Museum
Caspase 8的激活，需要FADD( Fas associated protein with death domain)
Caspase 9 激活，需要通过CARD（caspaserecruitment domain)、Apaf-1、细胞色素c、 ATP等多个因子的参与。
细胞色素C、 Apaf-1和procaspase 9 组成 了 “Apoptosome”
抑制性因素
金属阳离子 (Zn2+ ) 药物 (苯巴比妥/ 半胱氨酸酶抑制剂) 病毒 EB病毒/牛痘病毒
2.细胞凋亡信号的转导
凋亡信号转导系统特点



① ② ③ ④
多样性：不同种类的细胞系统不同 偶联性：与增殖分化的信号系统交叉偶联 同一性：多因素，共用同一系统触发 多途性：同一诱导因素启动多条信号转导途径




Fas又称CD95，APO-1，是由325个氨基 酸组成的受体分子 配体诱导受体三聚体化，然后在细胞膜 上形成凋亡诱导复合物， Fas分子胞内段带有特殊的死亡结构域 （DD, death domain）。死亡结构域相聚 成簇，吸引了胞浆中另一种带有相同死 亡结构域的蛋白FADD。 FADD是死亡信号转录中的一个连接蛋白， 它由两部分组成：C端（DD结构域）和N 端（DED）部分。
PKC ↑ ⑤ 二酰甘油
糖皮质激素
研究较多的系统：
1．胞内Ca2+信号系统（Ca2+为第二信使）


依据： ①细胞凋亡时胞内游离Ca2+浓度显著上升 ②用Ca2+载体A23187人为升高B淋巴细胞Ca2+ 水平，B淋巴细胞凋亡 ③用Ca2+络合剂降低胞内Ca2+水平，阻止细胞 凋亡
激活Ca2+依赖谷氨酰胺转移酶





Fas蛋白：细胞膜跨膜蛋白 Fas蛋白+Fas配体（抗Fas）→细胞凋亡 机制： ①Fas蛋白+Fas配体（抗Fas）→神经鞘磷脂酶活 性↑→产生神经酰胺→蛋白激酶激活→细胞凋亡 ②Fas蛋白+抗Fas、TNF →激活ICE样caspase → 降解H1组蛋白→染色体松驰→DNA暴露内切酶位 点 ③通过Ca2+信号系统传递死亡信息引起细胞凋亡