mTOR Signaling信号通路
外泌体携带HSP90α通过调控mTOR信号通路影响血管肉瘤细胞自噬的机制初探
外泌体携带HSP90α通过调控mTOR信号通路影响血管肉瘤细胞自噬的机制初探外泌体是一类由细胞释放的小囊泡，它们在细胞间传递信号和物质，并参与多种生理和病理过程。
最近的研究表明，外泌体中的HSP90α蛋白通过调控mTOR信号通路，影响血管肉瘤细胞的自噬。
自噬是一种细胞通过降解和回收细胞内垃圾和损伤的细胞器来维持细胞稳态的机制。
mTOR信号通路是细胞内最重要的自噬调控机制之一。
mTOR信号通路的激活可以抑制自噬的发生，而其抑制则会增强自噬。
在这项研究中，研究人员首先分离和鉴定了血管肉瘤细胞的外泌体。
通过电镜观察和Western blot分析，确定了这些外泌体中富集了HSP90α蛋白。
接下来，研究人员通过转染血管肉瘤细胞，使其过表达HSP90α蛋白。
结果显示，HSP90α过表达的细胞中mTOR信号通路被抑制，自噬的水平升高。
进一步的实验中，研究人员通过利用rapamycin，一种mTOR信号通路的抑制剂，研究了HSP90α蛋白对mTOR信号通路的影响。
结果显示，当细胞中存在外源性的HSP90α蛋白时，rapamycin对mTOR的抑制效果减弱，表明HSP90α蛋白可以调节mTOR信号通路的活性。
此外，研究人员还发现，HSP90α蛋白通过与mTOR蛋白直接相互作用，影响了mTOR的磷酸化水平，从而调节了mTOR信号通路的功能。
研究人员进一步探究了HSP90α蛋白外泌体激活自噬的分子机制。
他们发现，外泌体中富集的HSP90α蛋白可以被血管肉瘤细胞主要表面受体吸附，从而通过受体介导的信号传导途径激活mTOR信号通路，从而抑制自噬。
总体而言，这项研究初步揭示了外泌体携带的HSP90α蛋白通过调控mTOR信号通路影响血管肉瘤细胞自噬的机制。
这项研究不仅证明了外泌体在细胞间通讯中的重要作用，同时也揭示了HSP90α蛋白在肿瘤发生和发展中的潜在作用。
未来的研究将进一步探索外泌体与HSP90α蛋白之间的相互作用，以及其在其他疾病中的生物学功能综上所述，本研究发现外泌体中富集的HSP90α蛋白通过与肿瘤细胞表面受体相互作用，激活mTOR信号通路并抑制自噬。
mTOR信号通路与细胞生长调控
３３４生物物理学报２００７年的功能被发现。
ｍＴＯＲ信号通路与细胞的生长、分裂、存活、迁移、自我更新和细胞周期进程等生理过程密切相关。
它不仅调节细胞的生长，而且对小鼠的早期胚胎发育甚至出生后的生长都有影响。
虽然ｍＴＯＲ通路与哺乳动物寿命的关系还没有被揭示，但近年的研究成果已显示出ＴＯＲ通路在后生动物的发育和成体代谢中起着重要的作用，ＴＯＲ调节着与营养相关的生理过程。
１．２由ｍＴＯＲ信号通路介导的信号刺激因子在哺乳动物中ｍＴＯＲ与其它不同的蛋白结合，形成了两种复合体ｍＴｏＲＣｌ（ｎｌＴＯＲＣｏｍｐｌｅｘ１）和ｍＴＯＲＣ２（ｍＴＯＲＣｏｍｐｌｅｘ２）。
ｍＴＯＲＣｌ对ｍｐ加１），ｃｉｎ敏感，而ｍＴＯＲＣ２不敏感【４】。
过去十几年的研究主要集中于ｍＴＯＲＣｌ。
基于对ｍＴＯＲＣｌ的研究，目前认为ｍＴＯＲ信号通路的上游刺激因子主要有四类，即生长因子与胰岛素、营养因子、能量以及压力。
生长因子和胰岛素的刺激作用通过Ｐ１３Ｋ（ｐｈｏｓｐｈｏｉｎｏｓｉｔｉｄｅ．３一ｋｉｎａＳｅ）／ｍＴＯＲ通路调节细胞生长。
营养因子特别是氨基酸进入细胞后直接作用于ｍＴＯＲ通路中的效应分子，或通过间接途径对ｍＴＯＲ通路起作用，能量（低能）和压力（缺氧）是细胞内的刺激因子，可通过多种方式作用于ｍＴＯＲ通路，进而调节细胞生长。
近年对ＦＡＫ＠ｏｃａｌＡｄｈｅｓｉｏｎＫｉｎ邪ｅ）的研究表明，细胞黏附斑＠ｏｃａｌＡｄｌｌｅｓｉｏｎ）的形成可以通过ⅣⅨ作用于ｍＴＯＲ通路进而调节细胞生长旧，所以目前可以确定ｍＴＯＲ信号通路至少介导了五类刺激信号的转导过程。
随着近年对ｍＴＯＲＣ２的研究逐步深入，发现它参与了细胞骨架的形成，可能还有其它的刺激信号可以通过ｍＴＯＲ通路转导进而引起细胞的生理反应。
２ｍＴＯＲ信号通路的分子组成２．１ｍＴＯＲ蛋白及其复合体ｍＴｏＲＣｌ和ｍＴｏＲＣ２的特征在哺乳动物中只有一个ｍＴＯＲ基因，在人、大鼠和小鼠都编码了２５４９个氨基酸，蛋白分子量２８９ｋＤ。
细胞自噬的调控机制
细胞自噬的调控机制细胞自噬是一种重要的细胞代谢过程，通过同一细胞内的溶酶体降解有害的或异常的细胞器、蛋白质以及细胞内废弃物。
这种细胞自噬的调控机制对于维持细胞内稳态、细胞生长、发育和应对环境压力等起着重要作用。
本文将从相关信号通路、蛋白质修饰以及调控因子三个方面来探讨细胞自噬的调控机制。
一、相关信号通路细胞自噬过程的调控主要依赖于一些特定的信号通路，其中最为重要的是mTOR信号通路和AMPK信号通路。
1. mTOR信号通路mTOR（mammalian target of rapamycin）信号通路被认为是自噬过程的主要负调控因子。
当营养充足时，mTOR活化，抑制细胞自噬的进行；而当环境条件恶化，mTOR被抑制，从而促进细胞自噬的发生。
mTOR信号通路通过调控一系列下游蛋白质的磷酸化、翻译和合成来实现对细胞自噬的调控。
2. AMPK信号通路AMPK（adenosine monophosphate-activated protein kinase）信号通路是细胞能量代谢的重要调控因子，同时也与细胞自噬过程相关。
当细胞内能量耗竭、ATP水平下降，AMPK被活化，进而刺激细胞自噬的发生。
AMPK能通过直接磷酸化调节自噬相关蛋白，或者通过抑制mTOR信号通路来促进自噬的进行。
二、蛋白质修饰除了信号通路的调控外，细胞自噬还受到一系列蛋白质修饰的影响，包括磷酸化、乙酰化和泛素化等。
1. 磷酸化修饰细胞自噬相关的蛋白质如ATG（autophagy-related）家族成员和细胞自噬途径的关键蛋白LC3（microtubule-associated protein 1 light chain 3）等都可以受到磷酸化修饰。
磷酸化可以调控这些蛋白质的活性、稳定性和互作，从而影响细胞自噬的进程。
2. 乙酰化修饰乙酰化修饰是一种重要的蛋白质修饰方式，它可以调控细胞自噬相关的蛋白质如Atg5、Atg7等的功能和定位。
乙酰化修饰和蛋白质翻译后修饰酶如HDACs（histone deacetylases）之间的平衡是细胞自噬调控的重要因素之一。
(完整版)mTOR信号通路图
mTOR信号通路图mTOR可对细胞外包括生长因子、胰岛素、营养素、氨基酸、葡萄糖等多种刺激产生应答。
它主要通过PI3K/Akt/mTOR途径来实现对细胞生长、细胞周期等多种生理功能的调控作用。
正常情况下，结节性脑硬化复合物-1(TSC-1)和TSC-2形成二聚体复合物，是小GTP 酶Rheb(Ras-homolog enriched in brain)的抑制剂，而Rheb是mTOR活化所必需的刺激蛋白，因此TSC-1/TSC-2在正常情况下抑制mTOR的功能。
当Akt活化后，它可磷酸化TSC-2的Ser939和Thr1462，抑制了TSC-1/TSC-2复合物的形成，从而解除了对Rheb 的抑制作用，使得mTOR被激活。
活化的mTOR通过磷酸化蛋白翻译过程中的某些因子来参与多项细胞功能，其中最主要的是4EBP1和P70S6K。
在整个PI3K/Akt/mTOR信号通路中，有一条十分重要的负反馈调节剂就是10号染色体上缺失与张力蛋白同源的磷酸酶基因(phosphatase and tensin homology deleted on chromosome 10, PTEN)。
PTEN是一个肿瘤抑制基因，位于人染色体10q23。
它有一个蛋白酪氨酸磷酸酶结构域，在这条通路中可以将PI-3，4-P2与PI-3，4，5-P3去磷酸化，从而负调节PI3K下游AKt/mTOR信号通路的活性。
本信号转导涉及的信号分子主要包括IRS-1，PI3K，PIP2，PIP3，PDK1，PTEN，Akt，TSC1，TSC2，Rheb，mTOR，Raptor，DEPTOR，GβL，p70S6K，ATG13，4E-BP1，HIF-1，PGC-1α，PPARγ，Sin1，PRR5，Rictor，PKCα，SGK1，PRAS40，FKBP12，Wnt，LRP，Frizzled，Gαq/o，Dvl，Erk，RSK，GSK-3，REDD1，REDD2，AMPK，LKB1，RagA/B，RagC/D等。
mTOR信号通路在细胞自噬和凋亡调节中的作用
两者均为被基因编码的细胞程序性死亡过程。细胞 与细胞凋亡共同参与了生物体的生长发育及细胞死亡
凋亡是目前第一个被发现和认知的程序性细胞死亡 过程。哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target
(programmed cell death，PCD)。随着对细胞研究 of rapamycin, mTOR)信号传导通路进化保守，
综述
中国医学装备2021年1月第18卷第1期 China Medical Equipment 2021 January Vol.18 No.1
mTOR信号通路在细胞自噬和凋亡调节中的作用*
孙 阳① 孙 悦① 顾媛媛② 陶雪莲① 王远红③*
[文章编号] 1672-8270(2021)01-0162-05 [中图分类号] R394 [文献标识码] A
*基金项目: 国家自然科学基金青年基金(81704054)“基于JAK/STAT及PI3K/Akt/mTOR信号通路研究贞术消积汤对肝癌细胞的干预作用 及其机制”；国家自然科学基金面上项目(81873312)“基于皮肤微生物群与Th17/Treg失衡相关性探讨发汗祛风托毒方治疗白癜风机制及 病因学研究”；中国博士后科学基金资助项目(2014M551288)“鳖甲煎丸对肝癌细胞的抑制作用及其机制研究”；黑龙江省博士后资助项 目(LBH-Z13205)“鳖甲煎丸诱导肝癌细胞凋亡及对JAK-STAT信号通路的影响”；黑龙江省自然科学基金面上项目(H201462)“温阳发汗 法对白癜风T细胞免疫异常的作用机制研究”；黑龙江中医药大学研究生创新科研项目(2020yjscx013)“基于STAT3信号通路研究IL-12诱 导肝癌细胞自噬的分子机制” ①黑龙江中医药大学基础医学院 黑龙江 哈尔滨 150040 ②黑龙江中医药大学中医药研究院 黑龙江 哈尔滨 150040 ③黑龙江中医药大学附属第一医院皮肤科 黑龙江 哈尔滨 150040 *通信作者：wangyuanhong02@ 作者简介：孙阳，女，(1979- )，博士，副教授，研究方向：中医药抗肿瘤分子机制的基础研究。
中药活性成分调控mTOR信号通路干预糖尿病肾病的研究进展
中药活性成分调控mTOR信号通路干预糖尿病肾病的研究进展Δ贾慧雨1＊，冯志海2 #（1.河南中医药大学第一临床医学院，郑州 450046；2.河南中医药大学第一附属医院内分泌科，郑州 450003）中图分类号 R285文献标志码 A 文章编号 1001-0408（2023）13-1656-05DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2023.13.22摘要糖尿病肾病（DN）是引起终末期肾病的主要病因之一，发病机制尚不完全清楚，目前认为与高糖条件下自噬紊乱、氧化应激、炎症反应等多种因素介导的肾脏损伤关系密切。
哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）信号通路是参与蛋白质合成及调节自噬过程的核心通路，在DN的发生发展中起着重要作用。
近年来，中医药防治DN的研究取得了关键性进展。
大量证据表明，中药活性成分可通过调节mTOR信号通路提高自噬水平，改善氧化应激和炎症反应，抑制细胞的凋亡及异常增殖，从而缓解足细胞损伤、肾小球基底膜增厚、系膜组织异常及肾小管功能障碍等肾脏病理改变，减少蛋白尿并改善肾功能，对延缓DN进展具有重要意义。
本文系统总结了中药皂苷类、黄酮类、多酚类、生物碱类、萜类等活性成分通过mTOR信号通路干预DN的研究进展，可为进一步的基础研究和临床新药开发提供一定参考。
关键词糖尿病肾病；中药活性成分；哺乳动物雷帕霉素靶蛋白；信号通路Research progress of active ingredients of traditional Chinese medicine in the intervention of diabetic nephropathy by regulating mTOR signaling pathwayJIA Huiyu1，FENG Zhihai2（1. First College of Clinical Medicine，Henan University of Chinese Medicine，Zhengzhou 450046，China；2. Dept. of Endocrinology，the First Affiliated Hospital of Henan University of Chinese Medicine，Zhengzhou 450003，China）ABSTRACT Diabetic nephropathy （DN）has become one of the main causes of end-stage renal disease，and its pathogenesis is still unclear. Currently，it is believed to be closely related to kidney injury mediated by various factors such as autophagy disorder under the condition of high glucose，oxidative stress and inflammation. Mammalian target of rapamycin （mTOR）signaling pathway is crucial for protein synthesis and autophagy regulation，which plays an important role in the occurrence and development of DN. In recent years，the research on the prevention and treatment of DN with traditional Chinese medicine （TCM）has made important progress. Plenty of evidence has shown that the active ingredients of TCM can enhance autophagy，improve oxidative stress and inflammation，inhibit cell apoptosis and abnormal proliferation by regulating mTOR signaling pathway，so as to relieve pathological changes in the kidney such as podocyte injury，glomerular basement membrane thickening，mesangial tissue abnormalities and renal tubule dysfunction，thereby reducing proteinuria and improving renal function. All of the above are of great significance for delaying the progression of DN. This article systematically summarizes the research progress of saponins，flavonoids，polyphenols，alkaloids，terpenoids and other active ingredients of TCM intervening in DN through mTOR signaling pathway，in order to provide some reference for further basic research and the development of new drugs.KEYWORDS diabetic nephropathy；active ingredients of traditional Chinese medicine；mammalian target of rapamycin；signaling pathway糖尿病肾病（diabetic nephropathy，DN）是糖尿病最常见和最严重的微血管并发症之一，以持续性的蛋白尿排泄增加，伴或不伴有肾小球滤过率下降为主要临床特征。
信号通路合辑
信号通路合辑纵观现如今的科研发展趋势，⽆论哪⽅⾯的研究都脱离不了分⼦机制，其实归根结底就是搞明⽩信号通路中上下游的基因是如何调控的，受到了哪些因素的影响。
华美⽣物特别整理了各研究领域信号通路⽰意图，以便于我们获取最直接的科研思路。
AMPK signaling pathway腺苷酸激活蛋⽩激酶 (AMPK) 在细胞能量稳态调节中起到关键作⽤。
在低⾎糖、低氧、缺⾎和热休克等情况下，可激活AMPK。
AMPK可作为异源三聚体复合体出现，内含⼀个催化性α亚单位和调节性β和γ亚单位。
AMP结合到γ亚单位后，可变构激活复合体，使其苏氨酸172位点更易磷酸化的底物，在α亚单位的激活环中更易被主要的上游AMPK激酶LKB1 磷酸化。
AMPK还能被CAMKK2在苏氨酸172位点直接磷酸化，这是由代谢激素（如脂联素和瘦素）刺激后胞内钙离⼦⽔平变化引起的反应。
作为细胞能量感受器，AMPK 可对ATP低⽔平做出反应，被激活后，可对补充细胞 ATP 供应的信号转导通路做出正向调控，这些通路包括脂肪酸氧化和⾃噬。
Apoptosis细胞凋亡，为⼀种细胞程序性死亡。
相对于细胞坏死（necrosis），细胞凋亡是细胞主动实施的。
细胞凋亡⼀般由⽣理或病理性因素引起。
⽽细胞坏死则主要为缺氧造成，两者可以很容易通过观察区分开来。
Caspase家族属于半胱氨酸蛋⽩酶。
起始组Caspase包括caspase-2,-8,-9,-10,-11和-12,与促凋亡信号紧密相连，⼀旦激活，这些酶会切割并激活下游的效应组Caspase，包括Caspase-3,-6,-7。
效应 Caspase通过对细胞内蛋⽩特定的天冬氨酸残基位置处进⾏切割实现细胞的凋亡。
FasL和 TNF对Fas和 TNFR的结合能够激活caspase-8和-10。
DNA损伤诱导PIDD的表达，PIDD与RAIDD 和caspase-2结合并激活caspase-2。
受损线粒体中释放的细胞⾊素C与caspase-9的活化相关。
mTOR通路对猪肠上皮细胞精氨酸代谢及转运的影响
mTOR 通路对猪肠上皮细胞精氨酸代谢及转运的影响肖昊，温晓鹿，蒋宗勇，王丽*（广东省农业科学院动物科学研究所，农业农村部华南动物营养与饲料重点实验室，畜禽育种国家重点实验室，岭南现代农业科学与技术广东省实验室茂名分中心，广东省畜禽育种与营养研究重点实验室，广东广州510640）摘要：本试验旨在研究哺乳动物雷帕霉素靶标（mTOR ）通路对猪肠上皮细胞精氨酸（Arg ）代谢及转运通路的影响。
在含100或350μmol/L Arg 的培养基中添加（10nmol/L ）或不添加（0nmol/L ）雷帕霉素（Rapamycin,Rap ），培养猪肠上皮细胞（IPEC⁃J2细胞）2天后，对Arg 代谢通路、Arg⁃一氧化氮（NO ）、增殖转运通路蛋白表达进行检测。
结果表明：1）抑制mTOR 通路能够显著抑制精氨酸酶Ⅰ和精氨酸酶Ⅱ的蛋白表达量（P <0.05），显著抑制了精氨酸酶代谢途径；2）抑制mTOR 通路能显著抑制p⁃eNOS 的蛋白表达量（P <0.05），而增加Arg 浓度，与对照组相比显著提高p⁃eNOS 和eNOS 的蛋白表达量（P <0.05）；3）抑制mTOR 通路24小时后诱导性iNOS 的表达量上升；4）24小时下抑制mTOR 通路激活了磷酸化的cFos 表达量，抑制了PKCα、Erk 、Ric⁃tor 和CAT2的表达（P <0.05）。
综上所述，mTOR 被抑制后，猪肠上皮细胞中精氨酸的代谢和转运均被抑制，因而mTOR 信号通路在调控猪肠上皮细胞Arg 利用过程中发挥重要调控作用。
关键词：mTOR 信号通路；猪肠上皮细胞；精氨酸代谢；精氨酸转运中图分类号：S816.71文献标识码：A文章编码：1005⁃8567（2021）02⁃0001⁃05广东畜牧兽医科技2021年（第46卷）第2期科技前沿收稿日期：2021⁃03⁃30基金项目：国家生猪产业技术体系建设专项（CARS⁃35）；广东省现代农业产业技术体系生猪创新团队项目（2020KJ126）；科技创新战略专项资金（高水平农科院建设）——优秀博士（R2017YJ⁃YB1004）及青年副研究员（R2018PY⁃QF001）作者简介：肖昊(1988⁃），女，博士，副研究员，研究方向：猪营养与饲料科学。
经典信号通路之PI3K AKT mTOR信号通路
经典信号通路之PI3K-AKT-mTOR信号通路日期：2012-03-12 来源：未知标签：PTE AKT信号摘要: PI3K-AKT-mTOR is one of the three major signalling pathways that have been identified as important in cancer.天隆科技NP968自动核酸提取仪，产品试用进行中！佛山泰尔健生物细胞培养器材诚征代理磷脂酰肌醇3-激酶(PI3Ks)信号通路相关磷脂酰肌醇3-激酶(PI3Ks)蛋白家族参与细胞增殖、分化、凋亡和葡萄糖转运等多种细胞功能的调节。
PI3K活性的增加常与多种癌症相关。
PI3K磷酸化磷脂酰肌醇PI(一种膜磷脂)肌醇环的第3位碳原子。
PI在细胞膜组分中所占比例较小，比磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺和磷脂酰丝氨酸含量少。
但在脑细胞膜中，含量较为丰富，达磷脂总量的10%。
PI的肌醇环上有5个可被磷酸化的位点，多种激酶可磷酸化PI肌醇环上的4th 和5th位点，因而通常在这两位点之一或两位点发生磷酸化修饰，尤其发生在质膜内侧。
通常，PI-4,5-二磷酸(PIP2)在磷脂酶C的作用下，产生二酰甘油(DAG)和肌醇-1,4,5-三磷酸。
PI3K转移一个磷酸基团至位点3，形成的产物对细胞的功能具有重要的影响。
譬如，单磷酸化的PI-3-磷酸，能刺激细胞迁移(cell trafficking)，而未磷酸化的则不能。
PI-3,4-二磷酸则可促进细胞的增殖(生长)和增强对凋亡的抗性，而其前体分子PI-4-磷酸则不然。
PIP2转换为PI-3,4,5-三磷酸，可调节细胞的黏附、生长和存活。
PI3K的活化PI3K可分为3类，其结构与功能各异。
其中研究最广泛的为I类PI3K, 此类PI3K为异源二聚体，由一个调节亚基和一个催化亚基组成。
调节亚基含有SH2和SH3结构域，与含有相应结合位点的靶蛋白相作用。
该亚基通常称为p85, 参考于第一个被发现的亚型(isotype),然而目前已知的6种调节亚基，大小从50至110kDa 不等。
信号通路
PI3K/Akt/mTOR通路mTOR Akt GSK-3 DNA-PK ATM/ATR PDK-1 S6 Kinase AMPK PI3K一、PI3K简介二、PI3K是细胞内重要的信号转导分子，根据PI3K的P110亚基结构特点和底物分子不同可将其分为三大类，其中第Ⅰ类PI3K 功能最为重要，下面所述PI3K 指的都是第Ⅰ类PI3K。
PI3K主要由催化亚基P110 和调节亚基P85 组成。
PI3K 可被生长因子、细胞因子、激素等细胞外信号刺激激活。
PI3K激活可使膜磷酸肌醇磷酸化，催化肌醇环上3位羟基生成3,4 二磷酸磷脂酰肌醇(phosphatidylinositol-3,4-biphosphate，PI-3,4P2)及3,4,5 三磷酸磷脂酰肌醇(phosphatidylinositol 3,4,5-trisphosphate，PI-3,4,5P3)，它们均可作为第二信使在细胞中传递信号，介导PI3K 的多种细胞功能，如这些脂质产物可通过与Akt 的PH(pleckstrin homology)区结合来激活Akt。
肿瘤抑制基因pten(phosphatase and tensinhomologdelet-edonchromosometen)表达产物可诱导3磷酸肌醇去磷酸化，从而可对PI3K 途径进行负调节。
二、Akt简介Akt是一种Ser/Thr蛋白激酶。
在磷脂酰肌醇依赖的蛋白激酶(phosphoinositide-dependent protein kinase，PDK)的协同作用下，PI-3,4P2 和PI-3,4,5P3 可与Akt结合，导致Akt从胞浆转位到质膜，并促进Akt 的Ser473 和Thr308 位点磷酸化。
Ser473或/和Thr308 位点的磷酸化是Akt激活的必要条件，而Akt激活是其发挥促细胞生存功能的重要前提。
激活的Akt 主要通过促进Bad(Bcl-2 家族促凋亡成员之一)、mTOR、Caspase 3、糖原合酶激酶-3(glycogen synthase kinase-3, GSK-3)等下游底物磷酸化而发挥广泛的生物学效应，包括抗凋亡、促细胞生存等功能。
mTOR信号通路通过Notch信号调节细胞分化共3篇
mTOR信号通路通过Notch信号调节细胞分化共3篇mTOR信号通路通过Notch信号调节细胞分化1mTOR信号通路通过Notch信号调节细胞分化细胞分化是生命体系中不可或缺的过程之一。
在分化过程中，干细胞不断分化成为各种细胞类型，从而构建完整的组织和器官系统。
在多细胞生物中，细胞分化过程具有极其重要的意义。
然而，其背后的分子机制还有很多待探索的问题。
目前，研究人员已经发现，mTOR信号通路和Notch信号途径在调节细胞分化过程中起到关键作用。
mTOR信号通路是一种对营养、能量状态、生长因子等信号进行感知和调节的主要途径。
而Notch信号则是起源于果蝇和线虫的一种高度保守的信号系统，其在哺乳动物体内广泛存在。
Notch信号途径通过细胞间直接的相互作用来调节细胞命运的决定和细胞分化的进程。
这两个信号通路在多个进程中相互联系并作用，调节细胞分化的方式及机制也更加复杂。
研究发现，mTOR信号通路可影响Notch信号途径的激活程度，从而影响细胞分化的进程。
在哺乳动物中，mTOR抑制剂的使用会促进Notch信号途径的活化，即促进细胞分化。
而mTOR激活则会抑制Notch信号途径，即抑制细胞分化。
这样的相互作用说明了mTOR和Notch两个信号通路在细胞分化中的紧密联系。
具体来说，mTOR信号通过调节蛋白合成和细胞代谢等多个路径来影响Notch信号的激活。
当mTOR被抑制时，会抑制细胞自我更新能力，促进细胞分化进程。
此外，mTOR信号通路调控了细胞周期的进展，影响细胞准备进入分化程序的时间点。
这一发现为探索细胞分化的机理提供了新的思路，并为基于mTOR信号调控细胞分化的新策略提供了理论依据。
总体而言，mTOR信号通路和Notch信号途径在细胞分化中扮演着重要而独特的角色。
相互联系和作用的两个信号通路相互调节，调控着细胞命运的决定和细胞分化进程。
在今后的研究中，进一步探索这两个信号通路的相互作用，有望帮助我们更好地理解细胞分化的机理，并为治疗一系列疾病提供新的方向和策略细胞分化是复杂的生物学进程，需要多个信号通路的相互作用和调控。
mTOR相关信号通路在肾细胞癌中的研究进展
-综述与进展-J Med Res,December2020,V ol.49No.12mTOR相关信号通路在肾细胞癌中的研究进展刘晓琪张慧娟白红松邱田郑闪毕新刚摘要哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR)是一种非典型丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，已有研究表明mTOR相关信号通路与肾细胞癌(renal cell carcinoma,RCC)发展密切相关°本文就该信号通路在RCC细胞系和肿瘤组织中的表达及其临床意义进行系统回顾和梳理，发现mTOR、S6K/p70S6K和4E-BP1磷酸化活化可引起RCC细胞系的增殖和侵袭迁移能力增强,并增强上皮-间质转化过程，使得RCC细胞系转移能力增强°mTOR相关信号通路的基因突变引起的mTORC1活性增高的RCC有着特定的组织形态学及临床预后特征，并对mTOR抑制剂治疗有良好的治疗反应，有望成为独特的新的RCC病理亚型°通过检测mTOR和(或)磷酸化mTOR(p-mTOR)的表达水平，有可能用于预测预后及新的靶向治疗药物开发°mTOR通路多靶点抑制剂联合靶向治疗以及mTOR抑制剂联合免疫治疗值得进一步研究°关键词mTOR肾肿瘤细胞系预后靶向治疗中图分类号R73文献标识码A DOI哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR)是一种非典型丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶°mTOR相关信号通路在细胞的生长增殖过程中通过影响细胞分化和细胞周期，在细胞内起着生长和分化中心调控者的作用[1]°近年来研究表明，mTOR相关信号通路在肾细胞癌(renal cell carcinoma,RCC)发展中起到重要作用,且已成为进展期RCC的靶向治疗的可选方案°本文就mTOR相关信号通路在RCC中的研究及应用现状进行系统梳理，并展望其在RCC中的应用前景°mTOR相关信号转导通路包括上游信号分子、mTOR复合体(mTOR complex,mTORC)和下游信号蛋白3个组成部分°通路中最为重要的是mTOR复合体1(mTORC1),是目前研究关注的重点°上游的信号分子PI3K和Akt可以正向调节mTORC1的活性，而TSC1和TSC2则可以负向调节mTORC1的活性°mTORC1主要通过磷酸化核糖体蛋白S6激酶(ribosomal protein S6kinase,S6K/p70S6K)和真核细胞起始因子4E-结合蛋白1(eukaryotic initiation fac-基金项目：中国医学科学院医学与健康科技创新工程项目(2016 -I2M-1-001,2016-I2M-2-005)作者单位：100021国家癌症中心、国家肿瘤临床医学研究中心、中国医学科学院/北京协和医学院肿瘤医院病理科(刘晓琪、张慧娟、邱田、郑闪)，泌尿外科(白红松、毕新刚)；100122北京,桓兴肿瘤医院泌尿外科(白红松)通讯作者:邱田，电子信箱:qiutian1228@；郑闪,电子信箱：zhengshan@；毕新冈U,电子信箱：bixingang@cicams.ac.10.11969/j.issn.1673-548X.2020.12.032tor4E-binding protein1,4E-BP1)等发挥促进细胞生长和增殖等作用,近年来也有关于mTORC1通过HIF影响血管生长的报道°mTORC2可通过活化Akt 来增强mTORC1的活性,此外还可以通过SGK调节细胞代谢[2'3]°mTOR信号通路与RCC研究包括细胞系及肿瘤组织两部分，旨在探讨mTOR信号通路在RCC发生、发展中的作用机制及其临床意义°mTOR以及其下游S6K/p706S6和4EBP1是最为常见的研究对象°一.mTOR信号通路在RCC细胞系中的研究CC细胞系为对象的研究发现,PI3K/Akt/mTOR 通路的活化将引起RCC细胞系的增殖和侵袭迁移能力增强，并可以增强上皮-间质转化过程；而这一通路的抑制则可出现细胞增殖能力的减弱等°上述过程的发生、发展最为关键的蛋白是mTOR,其次是下游的S6K/p70S6K和4E-BP1,再次是上游的PI3K 和Akt，磷酸化是最主要的活化形式,也有蛋白表达水平的改变°而一些小分子、miR(miR-144、miR-182)以及蛋白主要通过影响这一通路中mTOR蛋白的活性来发挥作用,也有一些可作用于PI3K/Akt/ mTOR通路中的两个或以上相关蛋白，如Akt和mTOR,再如PI3K和mTOR等来发挥作用[4~8]°从上述研究结果来看，除了mTOR以外，Akt、S6K/p70S6K 及4E-BP1均有可能成为RCC潜在的新的靶向治疗靶点，同时双靶向联合治疗也有其存在的实验基础°另外PI3K/Akt/mTOR可能成为TFE3转位性肾细胞癌的治疗靶点°-132•医学研究杂志2020年12月第49卷第12期-综述与进展-二、mTOR信号通路在RCC肿瘤组织中的研究mTOR信号通路与细胞生长和分化相关,因此它是肿瘤发生、发展中最为常见的信号通路之一。
亮氨酸代谢
亮氨酸代谢引言亮氨酸（Leucine）是一种重要的氨基酸，是人体无法合成的必需氨基酸之一。
它在人体中具有多种重要的生理功能，包括蛋白质合成、肌肉生长、免疫调节等。
亮氨酸的代谢过程涉及多个关键酶和代谢产物的参与，对于维持人体正常的生理功能至关重要。
亮氨酸的来源亮氨酸是一种蛋白质中的氨基酸，可以通过食物摄入或者蛋白质降解来获得。
富含亮氨酸的食物包括肉类、鱼类、奶制品、豆类、坚果等。
人体每天需要摄入一定量的亮氨酸来满足生理需求。
亮氨酸的代谢途径亮氨酸的代谢途径主要包括以下几个方面：1. 亮氨酸的降解亮氨酸可以通过降解途径转化为丙酮酸和乙酰辅酶A，进而进入三羧酸循环（TCA 循环）参与能量产生。
亮氨酸降解的关键酶包括亮氨酸氨基转移酶（BCAT）、亮氨酸脱羧酶（BCOAT）等。
2. 亮氨酸的转化为脂肪酸亮氨酸还可以通过转化为乙酰辅酶A后进一步合成脂肪酸。
这个过程需要多个酶的参与，包括酮酸脱羧酶（Ketoacid Decarboxylase）、乙酰辅酶A羧化酶（Acetyl-CoA Carboxylase）等。
3. 亮氨酸的合成亮氨酸也可以通过合成途径来满足人体的需求。
亮氨酸合成的关键酶包括α-酮戊二酸脱氢酶（α-Ketoisocaproate Dehydrogenase）等。
亮氨酸在蛋白质合成中的作用亮氨酸在蛋白质合成中起着重要的作用。
作为一种必需氨基酸，亮氨酸是蛋白质合成的基础。
在蛋白质合成过程中，亮氨酸作为一个氨基酸单元被添加到多肽链中，从而构建蛋白质的结构。
此外，亮氨酸还可以通过激活mTOR信号通路来促进蛋白质合成。
mTOR是一种重要的细胞信号通路，在亮氨酸的存在下可以被激活，从而促进蛋白质合成的进行。
亮氨酸在肌肉生长中的作用亮氨酸对于肌肉生长也具有重要的作用。
亮氨酸可以通过激活mTOR信号通路来促进肌肉蛋白质的合成，从而促进肌肉的生长和修复。
此外，亮氨酸还可以通过调节肌肉蛋白分解的速率来影响肌肉的代谢状态。
滋膵通脉饮通过调节PI3KAktmTOR信号通路
－ｃａｓｐａｓｅ１蛋白表达显著升高(Ｐ<０.０５)ꎬ诱导了心肌细胞炎性损伤和细胞焦亡ꎮ与Ｍｏｄｅｌ组相比ꎬＣＹ－Ｈ组大鼠心肌组织中ＮＦ－κＢ㊁ＮＬＲＰ３㊁ＧＳＤＭＤ－Ｎ㊁ｃｌｅａｖｅｄ－ｃａｓｐａｓｅ１蛋白表达显著降低ꎬ且减轻了心肌组织炎性损伤和细胞焦亡ꎮ推测ＣＹ可能通过抑制ＮＦ－κＢ/ＮＬ￣ＲＰ３通路减轻ＭＩ导致的心肌细胞焦亡和炎性损伤ꎮ为了验证此猜想ꎬ本研究利用ＮＦ－κＢ的激活剂ＬＰＳ来干预高剂量ＣＹ处理的ＭＩ大鼠ꎮ结果显示ꎬＬＰＳ减弱了高剂量ＣＹ对ＭＩ大鼠心肌细胞焦亡和炎性损伤的抑制作用ꎮ证实了ＣＹ可能抑制ＮＦ－κＢ/ＮＬＲＰ３通路ꎬ抑制ＭＩ大鼠的心肌细胞焦亡ꎬ减轻炎性损伤ꎮ综上所述ꎬＣＹ可能通过抑制ＮＦ－κＢ/ＮＬＲＰ３通路ꎬ抑制ＭＩ大鼠的心肌细胞焦亡ꎬ减轻炎性损伤ꎮ该研究为开发用于ＭＩ临床治疗的新型药物提供了新的思路和方法ꎮ然而ꎬ该项研究还存在不足之处ꎬＮＬＲＰ３介导的细胞焦亡可能还涉及了其他通路ꎬ还需进一步设计实验进行研究ꎮʌ参考文献ɔ[１]㊀ＴｈｙｇｅｓｅｎＫꎬＡｌｐｅｒｔＪＳꎬＪａｆｆｅＡＳꎬｅｔａｌ.Ｆｏｕｒｔｈｕｎｉｖｅｒｓａｌｄｅｆｉｎｉ￣ｔｉｏｎｏｆｍｙｏｃａｒｄｉａｌｉｎｆａｒｃｔｉｏｎ(２０１８)[Ｊ].ＡｍＣｏｌｌＣａｒｄｉｏｌꎬ２０１８ꎬ７２(１８):２２３１－２２６４.[２]㊀张翅ꎬ赵炳祥ꎬ徐慧燕ꎬ等.红花黄色素纯化工艺研究及应用[Ｊ].中国食品添加剂ꎬ２０２２ꎬ３３(６):８７－９４.[３]㊀汪洁ꎬ陈纶华ꎬ李涵乔ꎬ等.羟基红花黄色素Ａ对缺血再灌注损伤保护机制的研究进展[Ｊ].医学综述ꎬ２０２２ꎬ１(１４):２７３９－２７４５.[４]㊀刘广雁ꎬ肖梦媛ꎬ陈建英.红花黄色素对心肌细胞Ｈ９Ｃ２的保护研究[Ｊ].中国循证心血管医学杂志ꎬ２０２１ꎬ１３(９):１０６３－１０６７.[５]㊀ＬｉＹꎬＸｉａＹꎬＹｉｎＳꎬｅｔａｌ.Ｔａｒｇｅｔｉｎｇｍｉｃｒｏｇｌｉａｌα－ｓｙｎｕｃｌｅｉｎ/ＴＬｒｓ/ＮＦ－ｋａｐｐａＢ/ＮＬＲＰ３ｉｎｆｌａｍｍａｓｏｍｅａｘｉｓｉｎｐａｒｋｉｎｓｏｎ'ｓｄｉｓｅａｓｅ[Ｊ].ＦｒｏｎｔＩｍｍｕｎｏｌꎬ２０２１ꎬ１２:７１９８０７.[６]㊀杨钤ꎬ张轶欧ꎬ贾力莉ꎬ等.心肌梗死大鼠模型的建立及疾病进程评价[Ｊ].中国组织工程研究ꎬ２０２２ꎬ２６(２３):３７３３－３７３７.[７]㊀白静纯ꎬ姚玉杰ꎬ刘涛ꎬ等.右美托咪定在ＬＰＳ致大鼠心脏损伤中的保护作用及其相关机制研究[Ｊ].畜牧兽医学报ꎬ２０１９ꎬ５０(９):１９２０－１９２５.[８]㊀ＪｅｎｃａＤꎬＭｅｌｅｎｏｖｓｋｙＶꎬＳｔｅｈｌｉｋＪꎬｅｔａｌ.Ｈｅａｒｔｆａｉｌｕｒｅａｆｔｅｒｍｙｏｃａｒｄｉａｌｉｎｆａｒｃｔｉｏｎ:ｉｎｃｉｄｅｎｃｅａｎｄｐｒｅｄｉｃｔｏｒｓ[Ｊ].ＥＳＣＨｅａｒｔＦａｉｌꎬ２０２１ꎬ８(１):２２２－２３７.[９]㊀ＦｒａｎｋＤꎬＶｉｎｃｅＪＥ.Ｐｙｒｏｐｔｏｓｉｓｖｅｒｓｕｓｎｅｃｒｏｐｔｏｓｉｓ:ｓｉｍｉｌａｒｉｔｉｅｓꎬｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｓａｎｄｃｒｏｓｓｔａｌｋ[Ｊ].ＣｅｌｌＤｅａｔｈＤｉｆｆｅｒꎬ２０１９ꎬ２６(１):９９－１１４.[１０]㊀ＪｅｙａｂａｌＰꎬＴｈａｎｄａｖａｒａｙａｎＲＡꎬＪｏｌａｄａｒａｓｈｉＤꎬｅｔａｌ.ＭｉｃｒｏＲ￣ＮＡ－９ｉｎｈｉｂｉｔｓｈｙｐｅｒｇｌｙｃｅｍｉａ－ｉｎｄｕｃｅｄｐｙｒｏｐｔｏｓｉｓｉｎｈｕｍａｎｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒｃａｒｄｉｏｍｙｏｃｙｔｅｓｂｙｔａｒｇｅｔｉｎｇＥＬＡＶＬ１[Ｊ].Ｂｉｏ￣ｃｈｅｍＢｉｏｐｈｙｓＲｅｓＣｏｍｍｕｎꎬ２０１６ꎬ４７１(４):４２３－９.[１１]㊀ＬｕＱＹꎬＭａＪＱꎬＤｕａｎＹＹꎬｅｔａｌ.Ｃａｒｔｈａｍｉｎｙｅｌｌｏｗｐｒｏｔｅｃｔｓｔｈｅｈｅａｒｔａｇａｉｎｓｔｉｓｃｈｅｍｉａ/ｒｅｐｅｒｆｕｓｉｏｎｉｎｊｕｒｙｗｉｔｈｒｅｄｕｃｅｄｒｅａｃｔｉｖｅｏｘｙｇｅｎｓｐｅｃｉｅｓｒｅｌｅａｓｅａｎｄｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙｒｅｓｐｏｎｓｅ[Ｊ].ＣａｒｄｉｏｖａｓｃＰｈａｒｍａｃｏｌꎬ２０１９ꎬ７４(３):２２８－２３４.[１２]㊀ＧｕｏＨꎬＺｈｕＬꎬＴａｎｇＰꎬｅｔａｌ.Ｃａｒｔｈａｍｉｎｙｅｌｌｏｗｉｍｐｒｏｖｅｓｃｅｒ￣ｅｂｒａｌｉｓｃｈｅｍｉａｒｅｐｅｒｆｕｓｉｏｎｉｎｊｕｒｙｂｙａｔｔｅｎｕａｔｉｎｇｉｎｆｌａｍｍａ￣ｔｉｏｎａｎｄｆｅｒｒｏｐｔｏｓｉｓｉｎｒａｔｓ[Ｊ].ＩｎｔＭｏｌＭｅｄꎬ２０２１ꎬ４７(４):５２.[１３]㊀ＫｅｌｌｅｙＮꎬＪｅｌｔｅｍａＤꎬＤｕａｎＹꎬｅｔａｌ.ＴｈｅＮＬＲＰ３ｉｎｆｌａｍｍａ￣ｓｏｍｅ:ａｎｏｖｅｒｖｉｅｗｏｆｍｅｃｈａｎｉｓｍｓｏｆａｃｔｉｖａｔｉｏｎａｎｄｒｅｇｕｌａ￣ｔｉｏｎ[Ｊ].ＩｎｔＭｏｌＳｃｉꎬ２０１９ꎬ２０(１３):３３２８.ʌ文章编号ɔ１００６－６２３３(２０２３)０１－００３１－０６滋膵通脉饮通过调节ＰＩ３Ｋ/Ａｋｔ/ｍＴＯＲ信号通路减轻高糖诱导的Ｈ９ｃ２心肌细胞损伤的实验研究吴刚强１ꎬ㊀袁春云１ꎬ㊀袁思斯１ꎬ㊀毛㊀叶１ꎬ㊀陈㊀琪１温小凤１ꎬ㊀谭㊀军１ꎬ㊀卜献春１ꎬ㊀李㊀非２ꎬ㊀李洁花３(１.湖南省中医药研究院附属医院老干科/全国名老中医药专家卜献春传承工作室ꎬ㊀湖南㊀长沙㊀４１０００６２.湖南省中医药研究院附属医院药剂科ꎬ㊀湖南㊀长沙㊀４１０００６３.湖南中医药大学第二附属医院心血管内科ꎬ㊀湖南㊀长沙㊀４１０００５)ʌ摘㊀要ɔ目的:通过对高糖诱导的Ｈ９ｃ２心肌细胞自噬和凋亡可能涉及的信号通路(ＰＩ３Ｋ－Ａｋｔ－ｍＴＯＲ)进行研究ꎬ探讨滋膵通脉饮抑制心肌细胞凋亡的作用机制ꎮ方法:ＳＤ大鼠随机分为空白血浆组㊁滋膵通脉饮组ꎬ每组１０只ꎮ连续灌胃７ｄꎬ制备相应的含药血浆ꎮ滋膵通脉饮组药物浓度为４.４ｇ/１３ ʌ基金项目ɔ湖南省中医药管理局一般项目ꎬ(编号:２０２１０７１)ꎻ湖南省长沙市自然科学基金项目ꎬ(编号:Ｋｑ２２０２４７６)ʌ通讯作者ɔ卜献春ｍＬꎬ灌胃量为１０ｍＬ ｋｇ－１ ｄ－１ꎻ空白血浆组采用等剂量的灭菌超纯水灌胃(给药体积为１０ｍＬ/ｋｇ)ꎮ把Ｈ９ｃ２心肌细胞分为正常组㊁空白血浆组和含药血浆组ꎬ分别加入胎牛血清ꎬ空白血浆和含药血浆ꎬ每组均设置５％㊁１０％㊁１５％的浓度梯度ꎮ通过ＣＣＫ－８法比较各组Ｈ９ｃ２心肌细胞增殖情况ꎬ计算细胞存活率ꎬ筛选含药血浆ꎮ将高糖诱导的Ｈ９ｃ２心肌细胞随机分成３组:模型组㊁滋膵通脉饮含药血浆组和恩格列净组ꎬ加上正常组ꎬ共４组ꎬ给药２４ｈ后ꎬＩＦ检测ＬＣ３Ｂ在Ｈ９ｃ２心肌细胞的表达ꎮＷｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ法检测ＰＩ３Ｋ－Ａｋｔ－ｍＴＯＲ信号通路蛋白和凋亡相关蛋白Ｃａｓｐａｓｅ－３的表达ꎮ结果:含药血浆及空白血浆在１０％的药物浓度水平对细胞增殖无明显影响ꎬ作为本次含药血浆实验干预的浓度ꎮ与正常组比较ꎬ模型组心肌细胞ＬＣ３ＢⅡ/ＬＣ３ＢⅠ表达明显降低ꎬＰＩ３Ｋ㊁Ｐ－Ａｋｔ㊁ｍＴＯＲ和Ｃａｓｐａｓｅ－３的蛋白表达明显升高(Ｐ<０.０５)ꎻ与模型组比较ꎬ滋膵通脉饮含药血浆组与恩格列净组ＬＣ３ＢⅡ/ＬＣ３ＢⅠ表达明显升高ꎬＰＩ３Ｋ㊁Ｐ－Ａｋｔ㊁ｍＴＯＲ和Ｃａｓｐａｓｅ的蛋白表达明显降低(Ｐ<０.０５)ꎻ滋膵通脉饮含药血浆组与恩格列净组ＬＣ３ＢⅡ/ＬＣ３ＢⅠ表达㊁ＰＩ３Ｋ㊁Ｐ－Ａｋｔ㊁ｍＴＯＲ和Ｃａｓｐａｓｅ－３的蛋白表达差异无统计学意义(Ｐ>０.０５)ꎮ结论:滋膵通脉饮可激活心肌细胞自噬而抑制心肌细胞凋亡ꎬ这可能与抑制ＰＩ３Ｋ/Ｐ－Ａｋｔ/ｍＴＯＲ信号通路有关ꎮʌ关键词ɔ㊀滋膵通脉饮ꎻ㊀Ｈ９ｃ２心肌细胞ꎻ㊀自㊀噬ꎻ㊀凋㊀亡ꎻ㊀ＰＩ３Ｋ－Ａｋｔ－ｍＴＯＲʌ文献标识码ɔ㊀Ａ㊀㊀㊀㊀㊀ʌｄｏｉɔ１０.３９６９/ｊ.ｉｓｓｎ.１００６－６２３３.２０２３.０１.００６ＥｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌＳｔｕｄｙｏｎＲｅｄｕｃｉｎｇＨｉｇｈＧｌｕｃｏｓｅ－ＩｎｄｕｃｅｄＩｎｊｕｒｙｉｎＨ９ｃ２ＣａｒｄｉｏｍｙｏｃｙｔｅｓｂｙＭｏｄｕｌａｔｉｎｇＰＩ３Ｋ/Ａｋｔ/ｍＴＯＲＳｉｇｎａｌｉｎｇＰａｔｈｗａｙｗｉｔｈＺｉｃｕｉＴｏｎｇｍａｉＤｅｃｏｃｔｉｏｎＷＵＧａｎｇｑｉａｎｇꎬＹＵＡＮＣｈｕｎｙｕｎꎬＹＵＡＮＳｉｓｉꎬｅｔａｌ(ＡｆｆｉｌｉａｔｅｄＨｏｓｐｉｔａｌｏｆＨｕｎａｎＰｒｏｖｉｎｃｉａｌＩｎｓｔｉｔｕｔｅｏｆＴｒａｄｉｔｉｏｎａｌＣｈｉｎｅｓｅＭｅｄｉｃｉｎｅ/ＮａｔｉｏｎａｌＦａｍｏｕｓＯｌｄＣｈｉｎｅｓｅＭｅｄｉｃｉｎｅＥｘｐｅｒｔｓＢｕＸｉａｎｃｈｕｎＩｎｈｅｒｉｔａｎｃｅＳｔｕｄｉｏꎬＨｕｎａｎＣｈａｎｇｓｈａ４１０００６ꎬＣｈｉｎａ)ʌＡｂｓｔｒａｃｔɔＯｂｊｅｃｔｉｖｅ:Ｔｏｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅｔｈｅｐｏｓｓｉｂｌｅｓｉｇｎａｌｉｎｇｐａｔｈｗａｙｓ(ＰＩ３Ｋ－Ａｋｔ－ｍＴＯＲ)ｉｎｖｏｌｖｅｄｉｎａｕｔｏｐｈａｇｙａｎｄａｐｏｐｔｏｓｉｓｏｆＨ９ｃ２ｃａｒｄｉｏｍｙｏｃｙｔｅｓｉｎｄｕｃｅｄｂｙｈｉｇｈｇｌｕｃｏｓｅꎬａｎｄｔｏｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅｔｈｅｍｅｃｈａｎｉｓｍｏｆａｃｔｉｏｎｏｆＺｉｃｕｉＴｏｎｇｍａｉＤｅｃｏｃｔｉｏｎｉｎｉｎｈｉｂｉｔｉｎｇｃａｒｄｉｏｍｙｏｃｙｔｅａｐｏｐｔｏｓｉｓ.Ｍｅｔｈｏｄｓ:ＳＤｒａｔｓｗｅｒｅｒａｎｄｏｍｌｙｄｉ￣ｖｉｄｅｄｉｎｔｏｂｌａｎｋｐｌａｓｍａｇｒｏｕｐａｎｄＺｉｃｕｉＴｏｎｇｍａｉＤｅｃｏｃｔｉｏｎｇｒｏｕｐꎬｗｉｔｈ１０ｒａｔｓｉｎｅａｃｈｇｒｏｕｐ.Ｔｈｅｃｏｒｒｅ￣ｓｐｏｎｄｉｎｇｍｅｄｉｃａｔｅｄｐｌａｓｍａｗａｓｐｒｅｐａｒｅｄｂｙｇａｖａｇｅｆｏｒ７ｄａｙｓꎬｔｈｅｄｒｕｇｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｏｆＺｉｃｕｉＴｏｎｇｍａｉＤｅｃｏｃ￣ｔｉｏｎｇｒｏｕｐｗａｓ４.４ｇ/ｍＬａｎｄｔｈｅｇａｖａｇｅｖｏｌｕｍｅｗａｓ１０ｍＬ ｋｇ－１ ｄ－１ꎬｔｈｅｂｌａｎｋｐｌａｓｍａｇｒｏｕｐｗａｓｇａｖａｇｅｄｗｉｔｈｔｈｅｓａｍｅｄｏｓｅｏｆｓｔｅｒｉｌｉｚｅｄｕｌｔｒａｐｕｒｅｗａｔｅｒ(ｔｈｅａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎｖｏｌｕｍｅｗａｓ１０ｍＬ/ｋｇ).Ｈ９ｃ２ｍｙｏｃａｒｄｉａｌｃｅｌｌｓｗｅｒｅｄｉｖｉｄｅｄｉｎｔｏｎｏｒｍａｌｇｒｏｕｐꎬｂｌａｎｋｐｌａｓｍａｇｒｏｕｐａｎｄｄｒｕｇｃｏｎｔａｉｎｉｎｇｐｌａｓｍａｇｒｏｕｐꎬｆｅｔａｌｂｏｖｉｎｅｓｅｒ￣ｕｍꎬｂｌａｎｋｐｌａｓｍａａｎｄｄｒｕｇｃｏｎｔａｉｎｉｎｇｐｌａｓｍａｗｅｒｅａｄｄｅｄｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ.Ａｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｇｒａｄｉｅｎｔｏｆ５％ꎬ１０％ａｎｄ１５％ｗａｓｓｅｔｆｏｒｅａｃｈｇｒｏｕｐ.ＴｈｅｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎｏｆＨ９ｃ２ｃａｒｄｉｏｍｙｏｃｙｔｅｓｉｎｅａｃｈｇｒｏｕｐｗａｓｃｏｍｐａｒｅｄｂｙＣＣＫ－８ｍｅｔｈｏｄꎬｔｈｅｃｅｌｌｓｕｒｖｉｖａｌｒａｔｅｗａｓｃａｌｃｕｌａｔｅｄꎬａｎｄｔｈｅｄｒｕｇｃｏｎｔａｉｎｉｎｇｐｌａｓｍａｗａｓｓｃｒｅｅｎｅｄ.Ｈ９ｃ２ｃａｒｄｉｏｍｙｏｃｙｔｅｓｉｎｄｕｃｅｄｂｙｈｉｇｈｇｌｕｃｏｓｅｗｅｒｅｒａｎｄｏｍｌｙｄｉｖｉｄｅｄｉｎｔｏｔｈｒｅｅｇｒｏｕｐｓ:ｍｏｄｅｌｇｒｏｕｐꎬＺｉｃｕｉＴｏｎｇｍａｉＤｅｃｏｃｔｉｏｎｍｅｄｉｃａｔｅｄｐｌａｓｍａｇｒｏｕｐａｎｄｅｎｇｌｉｅｊｉｎｇｇｒｏｕｐꎬａｎｄａｄｄｉｔｉｏｎａｌｌｙｔｈｅｒｅｗａｓｎｏｒｍａｌｇｒｏｕｐ.ＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆＬＣ３ＢｉｎＨ９ｃ２ｃａｒｄｉｏｍｙｏｃｙｔｅｓｗａｓｄｅｔｅｃｔｅｄ２４ｈａｆｔｅｒａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎｏｆＩＦꎬａｎｄｔｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆＰＩ３ＫＡｋｔｍＴＯＲｓｉｇｎａｌｐａｔｈｗａｙｐｒｏｔｅｉｎａｎｄａｐｏｐｔｏｓｉｓｒｅｌａｔｅｄｐｒｏｔｅｉｎｃａｓｐａｓｅ－３ｗａｓｄｅｔｅｃｔｅｄｂｙＷｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ.Ｒｅｓｕｌｔｓ:Ｄｒｕｇｃｏｎｔａｉｎｉｎｇｐｌａｓｍａａｎｄｂｌａｎｋｐｌａｓｍａｈａｖｅｎｏｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｅｆｆｅｃｔｏｎｃｅｌｌｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎａｔｔｈｅｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｌｅｖｅｌｏｆ１０％ꎬｗｈｉｃｈｉｓｕｓｅｄａｓｔｈｅｉｎｔｅｒｖｅｎｔｉｏｎｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｏｆｄｒｕｇｃｏｎｔａｉｎｉｎｇｐｌａｓｍａｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ.Ｔｈｅｅｘ￣ｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆＬＣ３ＢⅡ/ＬＣ３ＢⅠｄｅｃｒｅａｓｅｄｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙｃｏｍｐａｒｅｄｗｉｔｈｔｈｅｎｏｒｍａｌｇｒｏｕｐ(Ｐ<０.０５)ꎬｂｕｔｔｈｅｐｒｏ￣ｔｅｉｎｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆＰＩ３ＫꎬＰ－ＡｋｔꎬｍＴＯＲａｎｄＣａｓｐａｓｅ－３ｉｎｃｒｅａｓｅｄｃｏｍｐａｒｅｄｗｉｔｈｔｈｅｎｏｒｍａｌｇｒｏｕｐ(Ｐ<０.０５).ＴｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆＬＣ３ＢⅡ/ＬＣ３ＢⅠｉｎＺｉｃｕｉＴｏｎｇｍａｉＤｅｃｏｃｔｉｏｎｍｅｄｉｃａｔｅｄｐｌａｓｍａｇｒｏｕｐａｎｄｅｎｇｌｉｅｊｉｎｇｇｒｏｕｐｉｎｃｒｅａｓｅｄｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙｃｏｍｐａｒｅｄｗｉｔｈｔｈｅｍｏｄｅｌｇｒｏｕｐ(Ｐ<０.０５)ꎬｂｕｔｔｈｅｐｒｏｔｅｉｎｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆＰＩ３ＫꎬＰ－ＡｋｔꎬｍＴＯＲａｎｄＣａｓｐａｓｅ－３ｉｎＺｉｃｕｉＴｏｎｇｍａｉＤｅｃｏｃｔｉｏｎｍｅｄｉｃａｔｅｄｐｌａｓｍａｇｒｏｕｐａｎｄｅｎｇｌｉｅｊｉｎｇｇｒｏｕｐｄｅｃｒｅａｓｅｄ ２３ｃｏｍｐａｒｅｄｗｉｔｈｔｈｅｍｏｄｅｌｇｒｏｕｐ(Ｐ<０.０５).ＴｈｅｒｅｗａｓｎｏｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｉｎｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆＬＣ３ＢⅡ/ＬＣ３ＢⅠａｎｄｐｒｏｔｅｉｎｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆＰＩ３ＫꎬＰ－ＡｋｔꎬｍＴＯＲａｎｄＣａｓｐａｓｅ－３ｂｅｔｗｅｅｎＺｉｃｕｉＴｏｎｇｍａｉＤｅｃｏｃｔｉｏｎｍｅｄｉｃａｔｅｄｐｌａｓｍａｇｒｏｕｐａｎｄｅｎｇｌｉｅｊｉｎｇｇｒｏｕｐ(Ｐ>０.０５).Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ:ＺｉｃｕｉＴｏｎｇｍａｉＤｅｃｏｃｔｉｏｎｃａｎａｃｔｉｖａｔｅａｕｔｏｐｈａｇｙａｎｄｉｎｈｉｂｉｔａｐｏｐｔｏｓｉｓｏｆｃａｒｄｉｏｍｙｏｃｙｔｅｓꎬｗｈｉｃｈｍａｙｂｅｒｅｌａｔｅｄｔｏｔｈｅｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎｏｆＰＩ３Ｋ/ｐ－Ａｋｔ/ｍＴＯＲｓｉｇｎａ￣ｌｉｎｇｐａｔｈｗａｙ.ʌＫｅｙｗｏｒｄｓɔ㊀ＺｉｃｕｉＴｏｎｇｍａｉｄｅｃｏｃｔｉｏｎꎻ㊀Ｈ９ｃ２ｃａｒｄｉｏｍｙｏｃｙｔｅｓꎻ㊀Ａｕｔｏｐｈａｇｙꎻ㊀Ａｐｏｐｔｏｓｉｓꎻ㊀ＰＩ３Ｋ－Ａｋｔ－ｍＴＯＲ㊀㊀糖尿病是目前全人类需要共同面对的一个重大健康问题ꎮ糖尿病心肌病以糖尿病患者的心肌细胞坏死和凋亡为特征ꎮ研究显示ꎬ糖尿病会引起心脏自噬抑制ꎬ其在糖尿病心肌病的发病机制中占有一席之地ꎬ而增强自噬能在糖尿病心肌病中形成保护心脏的作用ꎬ减少心脏组织细胞凋亡ꎬ改善心脏损伤[１]ꎮ近年来ＰＩ３Ｋ－Ａｋｔ－ｍＴＯＲ信号通路被认为是自噬调节中唯一的抑制性通路ꎬ在自噬调控中发挥重要作用ꎮ研究显示ꎬ调节ＰＩ３Ｋ－Ａｋｔ－ｍＴＯＲ信号通路可激活自噬ꎬ减轻心肌损伤[２]ꎮ因此ꎬＰＩ３Ｋ/Ａｋｔ/ｍＴＯＲ－自噬作为一种关键性的自我调节机制对糖尿病心肌细胞凋亡起着极其重要的作用ꎮ虽然越来越多的药物被循证医学证明治疗糖尿病心肌病疗效显著ꎬ但糖尿病心肌病的高发病率和高死亡率仍然困扰着广大临床医务工作者ꎮ中医药治疗糖尿病疗效确切ꎬ具有毒副作用小ꎬ价格低廉ꎬ患者依从性好ꎮ课题组根据前期临床与实验研究表明ꎬ应用益气养阴㊁活血通络的滋膵通脉饮治疗糖尿病心肌病取得了令人满意的结果[３ꎬ４]ꎮ本研究结合课题组前期开展的研究ꎬ拟从ＰＩ３Ｋ－Ａｋｔ－ｍＴＯＲ信号通路的角度ꎬ探究滋膵通脉饮含药血浆对高糖诱导下的心肌细胞自噬和凋亡的影响ꎮ１㊀材料与方法１.１㊀药物㊁试剂与主要仪器:ＬＣ３－Ⅱ抗体(货号:１８７２５－１－ＡＰꎬ美国ｐｒｏｔｅｉｎｔｅｃｈ)ꎬＰＩ３Ｋ抗体(货号:ｂｓ－０１２８Ｒꎬ博奥森)ꎬＰ－Ａｋｔ抗体(货号:６６４４４－１－Ｉｇꎬ美国ｐｒｏｔｅｉｎｔｅｃｈ)ꎬｍＴＯＲ(货号:ｂｓ－１９９２Ｒꎬ博奥森)ꎬｃａｓｐａｓｅ－３抗体(货号:ａｂ１８４７８７ꎬ英国ａｂｃａｍ)ꎬＧＡＰＤＨ抗体(货号:１０４９４－１－ＡＰꎬ美国ｐｒｏｔｅｉｎｔｅｃｈ)ꎬＨＲＰｇｏａｔａｎｔｉ－ｍｏｕｓｅＩｇＧ抗体(货号:ＳＡ００００１－１ꎬ美国ｐｒｏｔｅｉｎｔｅｃｈ)ꎬＨＲＰｇｏａｔａｎｔｉ－ｒａｂｂｉｔＩｇＧ抗体(货号:ＳＡ００００１－２ꎬ美国ｐｒｏｔｅｉｎｔｅｃｈ)ꎬ１.０ｍｏＬ/ＬＴｒｉｓ ＨＣｌ(ｐＨ６.８)(货号:ＡＷＢ００７４ꎬ中国ａｂｉｏｗｅｌｌ)ꎬ１０％ＡＰＳ(货号:ＡＷＢ００９３ꎬ中国ａｂｉｏｗｅｌｌ)ꎬ１０％ＳＤＳ(货号:ＡＷＴ００４７ꎬ中国ａｂｉｏ￣ｗｅｌｌ)ꎬＴＥＭＥＤ(货号:ＡＷＢ００６８ꎬ中国ａｂｉｏｗｅｌｌ)ꎬＰＢＳＴ缓冲液(货号:ＡＷＩ０１３０ꎬ中国ａｂｉｏｗｅｌｌ)ꎬ３０％Ａｃｒ/Ｂｉｃ(货号:ＡＷＢ００２０ꎬ中国ａｂｉｏｗｅｌｌ)ꎬ电泳液缓冲液(货号:ＡＷＢ００８３ꎬ中国ａｂｉｏｗｅｌｌ)ꎬＲＩＰＡ裂解液(货号:ＡＷＢ０１３６ꎬ中国ａｂｉｏｗｅｌｌ)ꎬ蛋白酶抑制剂(货号:５８３７９４ꎬ中国北京金泰宏达)ꎬ蛋白磷酸酶抑制剂(货号:ＡＷＨ０６５０ꎬ中国ａｂｉｏｗｅｌｌ)ꎬ胰酶消化液(货号:ＡＷＣ０２３２ꎬａｂｉｏｗｅｌｌ)ꎬ胎牛血清(ＦＢＳ)(货号:１００９９１４１ꎬＧｉｂｃｏ)ꎬ细胞冻存液(货号:ＡＷＣ０２２９ꎬａｂｉｏ￣ｗｅｌｌ)ꎬ凋亡试剂盒(ＡＰＣ)(货号:ＫＧＡ１０３０ꎬ凯基生物)ꎬＲａｐａｍｙｃｉｎ(货号:Ａ８１６７ꎬＡｐｅｘＢｉｏ)ꎬ摇床(货号:ＴＳ－９２ꎬ其林贝尔)ꎬ显微镜(货号:ＢＡ２１０ＴꎬＭｏｔｉｃ)ꎮ１.２㊀制备含药血浆:２０只ＳＤ大鼠ꎬ随机分为两组ꎬ空白血浆组㊁滋膵通脉饮组ꎬ每组１０只ꎮ按临床上５倍成人(７０ｋｇ)剂量给药ꎮ滋膵通脉饮主要由黄芪㊁生地黄㊁山茱萸㊁玄参㊁天花粉㊁麦冬㊁生蒲黄㊁全蝎㊁水蛭㊁地龙㊁僵蚕㊁丹参㊁山楂㊁川芎㊁鬼箭羽等药物组成ꎬ以上药材均从湖南省中医药研究院附属医院门诊中药房购得ꎮ药物浓度为４.４ｇ/ｍＬꎬ灌胃量为１０ｍＬ ｋｇ－１ ｄ－１ꎻ空白血浆组采用等剂量的灭菌超纯水灌胃(给药体积为１０ｍＬ/ｋｇ)ꎮ连续灌胃７ｄꎬ所有大鼠采血前１２ｈ禁食不禁水ꎬ最后一次灌胃１ｈ后麻醉ꎬ进行腹主动脉采血ꎬ用１.５％的ＥＤＴＡ－Ｎａ２对采得的血液进行抗凝处理后ꎬ离心取血浆ꎬ首先使用０.２２μｍ滤膜过滤血浆ꎬ然后在５６ħ恒温水浴锅中对其灭活３０ｍｉｎꎬ最后分装至无菌ＥＰ管中ꎬ放置在－８０ħ冰箱里保存备用ꎮ１.３㊀ＣＣＫ－８法筛选含药血浆浓度:把接种在细胞培养板(９６孔)上的生长状态良好的Ｈ９ｃ２心肌细胞分为正常组㊁空白血浆组和含药血浆组ꎮ正常组用完全培养液ꎬ各组分别设１０个复孔ꎬ加入细胞悬液(１００μＬ/孔)ꎮ把以上各组放入恒温培养箱(３７ħ㊁５％ＣＯ２)中过夜进行预培养处理后ꎬ分别加入胎牛血清ꎬ空白血浆和含药血浆ꎬ每组均设置５％㊁１０％㊁１５％的浓度梯度ꎮ均置于恒温培养箱(３７ħ㊁５％ＣＯ２)中培养２４ｈꎮ经培养后ꎬ各孔中滴加１０μＬ的ＣＣＫ－８ꎬ继续培养２ｈꎬ检测各孔在４５０ｎｍ处的ＯＤ值ꎮ１.４㊀细胞培养和处理:Ｈ９ｃ２细胞培养于含１０％ＦＢＳ＋１％双抗的ＤＭＥＭ中ꎬ３７ħꎬ５％ＣＯ２ꎬ饱和湿度培养箱中培养ꎮ取对数生长的细胞铺板在９６孔板里面ꎬ待细３３胞贴壁后分为Ａ(正常组)㊁Ｂ(模型组)㊁Ｃ(模型＋中药含药血浆组)㊁Ｅ(模型＋恩格列净组)ꎮ正常组:细胞正常培养ꎻ模型组:细胞加３３.３ｍｍｏＬ/Ｌ的Ｄ－葡萄糖＋１５％的空白血浆ꎻ模型＋滋膵通脉饮含药血浆组:细胞加３３.３ｍｍｏＬ/Ｌ的Ｄ－葡萄糖＋１０％含中药含药血浆ꎻ模型＋恩格列净组:细胞加３３.３ｍｍｏＬ/Ｌ的Ｄ－葡萄糖＋０.０１ｕｍｏＬ/Ｌ恩格列净ꎬ培养２４ｈ后收集细胞ꎮ１.５㊀免疫荧光染色(ＩＦ)检测ＬＣ３Ｂ在Ｈ９Ｃ２心肌细胞的表达:取出细胞爬片ꎬＰＢＳ清洗３次ꎬ用４％多聚甲醛固定３０ｍｉｎꎬＰＢＳ漂洗３次ꎻ加入０.３％曲拉通ꎬ３７ħ㊁３０ｍｉｎ进行细胞膜通透ꎬＰＢＳ漂洗３次ꎻ用５％ＢＳＡ㊁３７ħ封闭６０ｍｉｎꎬＰＢＳ冲洗３次ꎻ滴加经过适当稀释的一抗(ＬＣ３Ｂ)４ħ过夜进行一抗的孵育ꎬＰＢＳ冲洗３次ꎻ再滴加５０~１００μＬ抗－Ｒａｂｂｉｔ－ＩｇＧ标记荧光抗体ꎬ３７ħ孵育９０ｍｉｎ完成二抗的孵育ꎬＰＢＳ漂洗３次ꎻ使用ＤＡ￣ＰＩ工作液３７ħ㊁１０ｍｉｎ进行复染核ꎬＰＢＳ冲洗３次ꎻ缓冲甘油封片(注意避光保存)ꎮ利用荧光显微镜实施观察分析及采集图像ꎮ１.６㊀免疫印迹(ＷｅｓｔｅｒｎＢｌｏｔ)法检测Ｈ９ｃ２心肌细胞中ＰＩ３Ｋ㊁Ｐ－Ａｋｔ㊁ｍＴＯＲ㊁ｃａｓｐａｓｅ－３的蛋白表达:蛋白提取:①用冰预冷ＰＢＳ洗涤细胞一次ꎬ加入２００μＬＲＩＰＡ裂解液ꎬ用细胞刮刀刮下细胞ꎬ收集悬液ꎬ超声破碎１.５ｍｉｎꎻ②冰上ꎬ裂解１０ｍｉｎꎻ③４ħꎬ１２０００ｒｐｍ离心１５ｍｉｎꎻ④将离心后的上清转移倒１.５ｍＬ的离心管中ꎮ蛋白浓度检测:①根据样品数量ꎬ按５０体积ＢＣＡ试剂Ａ加１体积ＢＣＡ试剂Ｂ(５０:１)配制适量ＢＣＡ工作液ꎬ充分混匀ꎮＢＣＡ工作液室温２４ｈ内稳定ꎮ②完全溶解蛋白标准品ꎬ浓度为２ｍｇ/ｍＬꎮ标准品用ＲＩＰＡ裂解液按照５０％梯度稀释ꎮ③将各梯度稀释标准品和空白样每样２５μＬ加到９６孔板的标准品孔中ꎮ④将２５μＬ的样品加入到９６孔板的样品孔中ꎮ⑤将２００μＬＢＣＡ工作液加入到各孔中ꎬ３７ħ温度下放置３０ｍｉｎꎮ在５５０ｎｍ波长出测定吸光值ꎮ根据标准曲线水平计算蛋白的浓度ꎮＷｅｓｔｅｒｎＢｌｏｔ:①制胶:ａ制备１０％的分离胶ꎬ加入ＴＥＭＥＤ后摇匀ꎬ后即可灌胶ꎮ灌胶后ꎬ再用异丙醇封胶ꎻｂ当微微倾斜制胶器分界线不再变化时ꎬ说明胶已凝了ꎮ再等３ｍｉｎ左右ꎬ当胶充分凝固后ꎬ去除胶上层异丙醇ꎬ并用滤纸充分吸干ꎮＣ制备４.８％的浓缩胶ꎬ加入ＴＥＭＥＤ后充分摇匀ꎬ后即可进行灌胶ꎮ将梳子插入到玻璃板中ꎬ剩余的空间即可灌满浓缩胶ꎬ待胶凝固后即可ꎮ②样品准备:取１００μＬ蛋白上清ꎬ加入２５μＬ５∗ｌｏａｄｉｎｇｂｕｆｆｅｒ混匀ꎬ沸水煮５ｍｉｎꎬ放入冰盒中速冷备用ꎮ③电泳:ａ根据蛋白定量的结果ꎬ再第一个孔点加入ｍａｒｋｅｒ２μＬꎬ其余每孔加入１０~２０μＬ已变性的蛋白ꎮｂ开始电泳ꎬ电泳恒定电压７５Ｖꎬ时间为１３０ｍｉｎꎮ待溴酚蓝电泳至胶底部时即可终止电泳ꎮ④转膜:ａ按照切全膜ꎮｂ准备６张大小与胶相同的滤纸和１张ＮＣ膜ꎬＮＣ膜与滤纸一同放入到转膜缓冲液中ꎬ使其完全浸透ꎮｃ按照滤纸ꎬＮＣ膜ꎬ胶ꎬ滤纸的顺序依次放好ꎬ中间排除气泡ꎮｄ盖上仪器ꎬ接通电源ꎬ３００ｍＡ恒定电流转膜ꎬ各指标转膜时间见抗体信息ꎮｄ转膜完毕后ꎬ将膜取出放入ＰＢＳＴ中清洗１次ꎮ⑤封闭:用１∗ＰＢＳＴ配制５％脱脂奶粉ꎬ将膜浸入后ꎬ室温放置９０ｍｉｎꎻ⑥一抗孵育:ａ用ＰＢＳＴ将一抗按照一定比例稀释ꎬ将膜与一抗一起孵育ꎬ４ħ过夜ꎬ次日室温放置３０ｍｉｎꎻｂ孵育结束ꎬ１∗ＰＢＳＴ洗３次ꎬ每次１０ｍｉｎꎮ⑦二抗孵育:ａ用１∗ＰＢＳＴ稀释ＨＲＰ标记的二抗(具体比列见下表)ꎬ将稀释后的二抗与膜共同室温孵育９０ｍｉｎꎻｂ孵育结束ꎬ１∗ＰＢＳＴ清洗３次ꎬ每次大约１５ｍｉｎꎮ⑧显色/曝光:ＥＣＬ显色曝光:使用ＥＣＬ化学发光液与膜孵育１ｍｉｎꎬ用滤纸吸尽液体ꎬ用塑封膜将膜包裹杂交膜ꎬ凝胶系统成像ꎮ１.７㊀统计学处理:利用ＳＰＳＳ２１.０统计学软件处理相关的数据ꎮ多组比较用ｏｎｅ－ｗａｙＡＮＯＶＡ分析ꎬ显著性水平α＝０.０５ꎬ以Ｐ<０.０５为差异有统计学意义ꎮ２㊀结㊀果２.１㊀不同浓度的滋膵通脉饮含药血浆对Ｈ９ｃ２心肌细胞的影响:运用ＣＣＫ－８法检测滋膵通脉饮含药血浆对Ｈ９ｃ２心肌细胞增殖的影响ꎬ结果显示:同正常组比较ꎬ浓度为１０％的滋膵通脉饮含药血浆及空白血浆组ＯＤ值差异无统计学意义(ｔ＝０.１９１０ꎬＰ＝０.８５１３ꎬｔ＝０.３９０７ꎬＰ＝０.７０１９)ꎬ其对细胞增殖抑制的影响最小ꎮ当采用５％㊁１５％浓度的滋膵通脉饮含药血浆进行干预时ꎬ细胞增殖受抑制ꎬ各组ＯＤ值较正常组比较差异具有统计学意义(ｔ＝２.２６０５ꎬＰ＝０.０４０２ꎬｔ＝２.６２４７ꎬＰ＝０.０１９９)ꎬ故选用１０％作为最佳含药血浆的干预浓度ꎮ见表１ꎮ２.２㊀滋膵通脉饮含药血浆对Ｈ９ｃ２心肌细胞自噬标志物ＬＣ３ＢⅡ/ＬＣ３ＢⅠ表达的影响:与正常组比较ꎬ模型组ＬＣ３ＢⅡ/ＬＣ３ＢⅠ表达明显降低ꎻ与模型组比较ꎬ滋膵通脉饮组与恩格列净组ＬＣ３ＢⅡ/ＬＣ３ＢⅠ的表达明显升高(Ｐ<０.０５)ꎻ滋膵通脉饮组与恩格列净组ＬＣ３ＢⅡ/ＬＣ３ＢⅠ的表达差异无统计学意义(Ｐ>０.０５)ꎮ见图１ꎮ２.３㊀滋膵通脉饮含药血浆对ＰＩ３Ｋ－Ａｋｔ－ｍＴＯＲ信号通路和凋亡蛋白的影响与正常组比较ꎬ模型组ＰＩ３Ｋ㊁Ｐ－Ａｋｔ㊁ｍＴＯＲ和Ｃａｓｐａｓｅ－３的蛋白表达明显升高ꎻ与模型组比较ꎬ滋膵通脉饮含药血浆组与恩格列净组４３ＰＩ３Ｋ㊁Ｐ－Ａｋｔ㊁ｍＴＯＲ和Ｃａｓｐａｓｅ－３的蛋白表达明显降低(Ｐ<０.０５)ꎻ滋膵通脉饮含药血浆组与恩格列净组ＰＩ３Ｋ㊁Ｐ－Ａｋｔ㊁ｍＴＯＲ和Ｃａｓｐａｓｅ－３的蛋白表达差异无统计学意义(Ｐ>０.０５)ꎮ见图２ꎮ表１㊀不同浓度的滋膵通脉饮含药血浆对Ｈ９ｃ２心肌细胞增殖的影响分组５％１０％１５％正常组１.８１ʃ０.５５１.９２ʃ０.６１１.７３ʃ０.５３空白血浆组１.７４ʃ０.３２２.０２ʃ０.３９１.６９ʃ０.３４滋膵通脉饮含药血浆组１.２６ʃ０.４０∗１.９７ʃ０.４２１.１４ʃ０.３５∗㊀㊀注:与正常组比较ꎬ∗Ｐ﹤０.０５图１㊀各组Ｈ９ｃ２心肌细胞自噬标志物ＬＣ３ＢⅡ/ＬＣ３ＢⅠ表达的比较图２㊀滋膵通脉饮含药血浆对ＰＩ３Ｋ－Ａｋｔ－ｍＴＯＲ信号通路和凋亡蛋白的影响３㊀讨㊀论糖尿病属于以慢性高血糖为特点的代谢紊乱疾病之一ꎬ近年来其发病率激增ꎮ糖尿病心肌病是糖尿病常见的并发症ꎬ氧化应激㊁内质网应激㊁细胞外基质蛋白和晚期糖基化产物的堆积是糖尿病心肌病的早期特征ꎮ随着病情的进一步发展ꎬ逐步出现左心室肥厚和收缩功能不全ꎬ最后导致心衰的发生ꎮ糖尿病心肌病的病理特征表现为心肌细胞的变性坏死㊁细胞凋亡ꎮ自噬在维持心脏功能和结构ꎬ以及维护心肌细胞的完整性有不可估量的作用ꎮ适度的自噬对心脏的健康尤其重要ꎮ研究显示[５]ꎬ自噬紊乱与糖尿病心肌病的发生发展密切相关ꎬ恢复正常的自噬水平对糖尿病心肌病有明显的保护作用ꎮＰＩ３Ｋ/Ａｋｔ/ｍＴＯＲ信号通路在多类细胞中广泛存在ꎬ经调理细胞能量代谢和周期等多种渠道施展非常重要的生理功能ꎮＰＩ３Ｋ是存在于体内的一种重要蛋白ꎬ许多生命活动的发生与发展都需要其介入ꎮ当细胞膜接受信号因子的指令后可激活ＰＩ３Ｋꎬ被激活的ＰＩ３Ｋ诱导质膜上的第二信使ＰＩＰ３活化ꎬＡｋｔ蛋白的Ｔｈｒ３０８位点可被ＰＩＰ３磷酸化ꎬ进而激活ＡｋｔꎮＡｋｔ是一种丝/苏氨酸蛋白激酶ꎬ参与细胞的生长㊁增殖和存活ꎮＡｋｔ从细胞浆转移到质膜ꎬ同时产生磷酸化ꎬＡｋｔ活化后可通过激活下游蛋白－ｍＴＯＲ来调控胞内的凋亡及自噬ꎮ近年来ＰＩ３Ｋ－Ａｋｔ－ｍＴＯＲ信号通路被认为是自噬调节中唯一的抑制性通路ꎬ在心肌细胞自噬调控中起着非常重要的作用[６]ꎮ激活ＰＩ３Ｋ/Ａｋｔ/ｍＴＯＲ信号通路可抑制自噬的产生[７]ꎮ研究显示ꎬ芪苈强心胶囊可以通过调节ＡＫＴ/ｍＴＯＲ通路ꎬ激活自噬ꎬ抑制细胞凋亡ꎬ减轻心肌损伤[８]ꎮ麦冬皂苷可以促进２型糖尿病大鼠心肌细胞自噬ꎬ使其心脏功能得到改善ꎬ其机制或许和抑制Ａｋｔ/ｍＴＯＲ通路相关[９]ꎮ本研究显示ꎬ高糖刺激下的Ｈ９ｃ２心肌细胞ＰＩ３Ｋ㊁Ｐ－Ａｋｔ㊁ｍＴＯＲ和Ｃａｓｐａｓｅ－３的蛋白表达明显升高ꎬ而药物干预后恩格列净组和滋膵通脉饮含药血浆组ＰＩ３Ｋ㊁Ｐ－Ａｋｔ㊁ｍＴＯＲ和Ｃａｓｐａｓｅ－３的蛋白表达明显下降ꎬ说明高糖刺激后Ｈ９ｃ２心肌细胞ＰＩ３Ｋ/Ａｋｔ/ｍＴＯＲ信号通路被激活ꎬ从而抑制了自噬ꎬ出现了自噬障碍ꎮ而药物干预后ＰＩ３Ｋ/Ａｋｔ/ｍＴＯＲ信号通路被抑制ꎬ自噬被激活ꎬ自噬小体也随之减少ꎬ减轻了心肌细胞损伤ꎮＬＣ３蛋白作为一种自噬标志物ꎬ是自噬小体的标志蛋白ꎬ可分为ＬＣ３－Ｉ和ＬＣ３－Ⅱ２种形式ꎬ一般用ＬＣ３－Ⅱ/ＬＣ３－Ｉ的比值和ｐ６２的表达水平来评价细胞自噬ꎮＬＣ３－Ⅱ/ＬＣ３－Ｉ比值越高ꎬ说明自噬活性越强[１０]ꎮＣａｓｐａｓｅ－３是细胞凋亡相关的关键蛋白[１１]ꎬ当５３发生细胞凋亡时ꎬ促凋亡基因释放增多ꎬ导致细胞色素Ｃ进入细胞线粒体中ꎬ从而活化Ｃａｓｐａｓｅ－３ꎬ被激活的Ｃａｓｐａｓｅ－３可通过激活核因子㊁ＤＮＡ裂解酶等一系列的途径破坏细胞内多种蛋白酶复合体ꎬ从而导致细胞凋亡的发生[１２]ꎮ本研究显示ꎬ高糖刺激下的Ｈ９ｃ２心肌细胞ＬＣ３ＢⅡ/ＬＣ３ＢⅠ明显下降ꎬ凋亡相关蛋Ｃａｓｐａｓｅ－３表达明显升高ꎬ说明自噬障碍加重了心肌细胞损伤ꎬ加快了心肌细胞凋亡ꎬ而药物干预后恩格列净组和滋膵通脉饮含药血浆组ＬＣ３ＢⅡ/ＬＣ３ＢⅠ明显上升ꎬ凋亡相关蛋白Ｃａｓｐａｓｅ－３表达明显下降ꎬ说明激活自噬可减轻心肌细胞凋亡ꎮ这也许同抑制ＰＩ３Ｋ/Ｐ－Ａｋｔ/ｍＴＯＲ信号通路ꎬ激活心肌细胞的自噬相关ꎮ本研究采用湖南省名中医卜献春教授的中药复方滋膵通脉饮对高糖诱导的心肌细胞进行干预ꎬ旨在模拟糖尿病心肌病的模型ꎬ结果显示ꎬ滋膵通脉饮可通过抑制ＰＩ３Ｋ/Ｐ－Ａｋｔ/ｍＴＯＲ信号通路ꎬ激活心肌细胞自噬而减少心肌细胞凋亡蛋白的表达而抑制心肌细胞凋亡ꎮ滋膵饮出自于«医学衷中参西录»ꎬ原方由黄芪㊁生地㊁山药㊁生猪胰等组成ꎬ主要用于治疗消渴ꎮ卜献春教授之滋膵通脉饮系在原方基础上加减而成ꎬ方中丹参㊁川芎㊁生蒲黄㊁地龙㊁水蛭㊁鬼箭羽活血化瘀ꎬ辅以黄芪益气升阳ꎬ助主药活血通络ꎻ生地㊁麦冬㊁玄参㊁山茱萸㊁天花粉滋养五脏之阴ꎬ生津润燥ꎬ佐以僵蚕㊁全蝎熄风通络ꎬ山楂消食活血ꎬ同时防止滋阴活血药物碍胃ꎮ全方具有益气养阴㊁活血通络之效ꎮ本方加用了增液汤(生地㊁麦冬㊁玄参)ꎬ研究显示[１３]ꎬ增液汤可以通过激活Ａｋｔ１ꎬ调节ＰＩ３Ｋ－Ａｋｔ信号通路ꎬ促进胰岛素的分泌㊁改善胰岛功能ꎮ研究显示[１４]ꎬ黄芪的主要作用成分黄芪甲苷可以抑制糖尿病心肌病小鼠心肌氧化应激和炎症反应ꎬ减轻心肌细胞凋亡ꎮ地龙提取物在降低糖尿病心肌病大鼠血糖的同时ꎬ还能减轻心肌纤维化ꎬ改善心功能[１５]ꎮ该研究从体外实验再次证明ꎬ滋膵通脉饮可激活心肌细胞自噬而抑制心肌细胞凋亡ꎬ这可能与抑制ＰＩ３Ｋ/Ｐ－Ａｋｔ/ｍＴＯＲ信号通路有关ꎮʌ参考文献ɔ[１]㊀尧青ꎬ李勇ꎬ陈晓ꎬ等.姜黄素对糖尿病大鼠心肌自噬㊁凋亡及ＡＭＰＫ－ｍＴＯＲ信号通路的影响[Ｊ].中国医院药学杂志ꎬ２０２２ꎬ４２(１０):１００４－１００８.[２]㊀杜琎ꎬ石开虎ꎬ赵扬ꎬ等.丹参酚酸Ｂ通过抑制ＰＩ３Ｋ/Ａｋｔ/ｍＴＯＲ通路促进自噬减轻大鼠心肌纤维化的研究.[Ｊ].现代生物医学进展ꎬ２０１９ꎬ１９(２０):３８１２－３８１７.[３]㊀吴刚强ꎬ熊春红ꎬ毛叶ꎬ等.滋膵通脉饮对糖尿病心肌病大鼠心肌纤维化和转化生长因子β１/Ｓｍａｄｓ３信号通路的影响[Ｊ].中药新药与临床药理ꎬ２０２１ꎬ３２(１):２９－３５. [４]㊀吴刚强ꎬ毛叶ꎬ温小凤ꎬ等.滋膵通脉饮对糖尿病心肌病大鼠心肌重构的影响[Ｊ].中西医结合心脑血管病杂志ꎬ２０２１ꎬ１９(２):２４０－２４３.[５]㊀ＷａｎｇＹꎬＬｉａｎｇＢꎬＬａｕＷＢꎬｅｔａｌ.Ｒｅｓｔｏｒｉｎｇｄｉａｂｅｔｅｓ－ｉｎｄｕｃｅｄａｕｔｏｐｈａｇｉｃｆｌｕｘａｒｒｅｓｔｉｎｉｓｃｈｅｍｉｃ/ｒｅｐｅｒｆｕｓｅｄｈｅａｒｔｂｙＡＤＩ￣ＰＯＲ(ａｄｉｐｏｎｅｃｔｉｎｒｅｃｅｐｔｏｒ)ａｃｔｉｖａｔｉｏｎｉｎｖｏｌｖｅｓｂｏｔｈＡＭＰＫ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔａｎｄＡＭＰＫ－ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔｓｉｇｎａｌｉｎｇ[Ｊ].Ａｕｔｏｐｈａｇｙꎬ２０１７ꎬ１３(１１):１８５５－１８６９.[６]㊀ＬｉＸｕｅｆｅｉꎬＨｕＸｉａｏｒｏｎｇꎬＷａｎｇＪｉｃｈｕｎꎬｅｔａｌ.Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎｏｆａｕ￣ｔｏｐｈａｇｙｖｉａａｃｔｉｖａｔｉｏｎｏｆＰＩ３Ｋ/Ａｋｔ/ｍＴＯＲｐａｔｈｗａｙｃｏｎｔｒｉｂ￣ｕｔｅｓｔｏｔｈｅｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎｏｆｈｅｓｐｅｒｉｄｉｎａｇａｉｎｓｔｍｙｏｃａｒｄｉａｌｉｓｃｈｅ￣ｍｉａ/ｒｅｐｅｒｆｕｓｉｏｉｎｊｕｒｙ[Ｊ].ＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌＪｏｕｒｎａｌｏｆＭｏｌｅｃｕｌａｒＭｅｄｉｃｉｎｅꎬ２０１８ꎬ４２(４):１９１７－１９２４.[７]㊀王晓平ꎬ张雪峰ꎬ邵明燕ꎬ等.自噬信号通路在心力衰竭中的作用以及中药干预的研究进展[Ｊ].中华中医药杂志ꎬ２０１９ꎬ３４(９):４２２０－４２２３.[８]㊀ＦａｎＣꎬＴａｎｇＸꎬＹｅＭꎬｅｔａｌ.Ｑｉ－Ｌｉ－Ｑｉａｎｇ－Ｘｉｎａｌｅｖｉａｔｅｓｉｓｏ￣ｐｒｏｔｅｒｅｎｏｌ－ｉｎｄｕｃｅｄｍｙｏｃａｒｄｉａｌｉｎｊｕｒｙｂｙｉｎｈｉｂｉｔｉｎｇｅｘｃｅｓｓｉｖｅａｕｔｏｐｈａｇｙａｃｔｉｖａｔｉｎｇＡＫＴ/ｍＴＯＲｐａｔｈｗａｙ[Ｊ].ＦｒｏｎｔＰｈａｒｍａ￣ｃｏｌꎬ２０１９ꎬ１０:１－４.[９]㊀饶小娟ꎬ吴毓敏ꎬ王彦.麦冬皂苷介导ＡＭＰＫ/Ａｋｔ/ｍＴＯＲ通路对糖尿病大鼠心肌细胞自噬的影响[Ｊ].中国循证心血管医学杂志ꎬ２０１８ꎬ１０(１１):１３６２－１３６７.[１０]㊀诺明ꎬ陶慧ꎬ哈森塔娜ꎬ等.舒芬太尼对心肌缺血/再灌注大鼠心肌细胞凋亡及Ｂｃｌ－２㊁ＬＣ３Ⅱ㊁Ｂｅｃｌｉｎ－１表达的影响[Ｊ].中西医结合心脑血管病杂志ꎬ２０２０ꎬ１８(１):５０－５４.[１１]㊀殿臣ꎬ宫丽鸿ꎬ肖福龙.稳斑汤含药血清对巨噬细胞泡沫化凋亡相关蛋白Ｂａｘ㊁Ｂｃｌ２和ｃａｓｐａｓｅ３表达的影响[Ｊ].辽宁中医杂志ꎬ２０１８ꎬ４５(６):１３０９－１３１２.[１２]㊀ＬｉｕＸꎬＴａｎＷꎬＹａｎｇＦꎬｅｔａｌ.Ｓｈｅｎｇｍａｉｉｎｊｅｃｔｉｏｎｒｅｄｕｃｅｓａｐ￣ｏｐｔｏｓｉｓａｎｄｅｎｈａｎｃｅｓａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓａｆｔｅｒｍｙｏｃａｒｄｉａｌｉｓｃｈａｅ￣ｍｉａａｎｄｒｅｐｅｒｆｕｓｉｏｎｉｎｊｕｒｙｉｎｒａｔｓ[Ｊ].ＢｉｏｍｅｄＰｈａｒｍａｃｏｔｈ￣ｅｒꎬ２０１８ꎬ１０４(８):６２９－６３６.[１３]㊀田瑛ꎬ邓小敏ꎬ苏冬ꎬ等.基于网络药理学探讨增液汤治疗糖尿病的作用机制[Ｊ].广西医学ꎬ２０２１ꎬ４３(１５):１８６８－１８７２.[１４]㊀杨嫒萍ꎬ张磊ꎬ李炜ꎬ等.黄芪甲苷对糖尿病心肌病小鼠的治疗作用及其机制[Ｊ].山东医药ꎬ２０２２ꎬ６２(２３):１９－２４.[１５]㊀陈梓健ꎬ蒋正午ꎬ高乐ꎬ等.地龙提取物对２型糖尿病心肌病的治疗作用与机制探讨[Ｊ].局解手术学杂志ꎬ２０２０ꎬ２９(８):６１６－６１９.６３。
细胞信号通路详解之mTOR信号通路
细胞信号通路详解之mTOR信号通路mTOR ( 哺乳动物雷帕霉素靶标) 是一种分子量为289 kDa 的丝氨酸/ 苏氨酸蛋白激酶，属于磷脂酰肌醇3- 激酶相关激酶(PIKK)家族。
该蛋白由一个催化激酶结构域、一个FRB(FKBP12-雷帕霉素结合)结构域、C- 末端附近的一个预测的自抑制结构域(抑制子结构域)、氨基末端多达20 个重复的HEAT 基序以及FAT (FRAP-ATM-TRRAP)和FATC (FAT C-末端)结构域组成。
TOR 的C 末端与磷脂酰肌醇3- 激酶(PI3K)的催化结构域高度同源。
TOR 蛋白在进化上从酵母到人类都是保守的，人、小鼠和大鼠的mTOR 蛋白在氨基酸水平上有95% 的同源性。
人mTOR 基因编码2549 个氨基酸的蛋白质，与酵母TOR1 和TOR2 的序列同源性分别为42% 和45% 。
mTOR 在参与控制细胞生长和增殖的信号通路中起中心作用(参考文献1)。
mTOR 通路受多种细胞信号的调控，包括有丝分裂生长因子、胰岛素等激素、营养素(氨基酸、葡萄糖)、细胞能量水平和应激条件。
PI3K/Akt(v-Akt小鼠胸腺瘤病毒癌基因同源1)信号转导通路是通过mTOR 传递信号的主要通路，在介导细胞存活和增殖中起重要作用。
通过 PI3K/Akt 通路的信号是由与细胞膜上的受体结合的生长因子的有丝分裂刺激启动的。
这些受体包括IGFR (胰岛素样生长因子受体)、PDGFR (血小板衍生生长因子受体)、EGFR (表皮生长因子受体)和HER 家族。
来自激活的受体的信号直接传递到PI3K/Akt 通路，或者，也可以通过由致癌蛋白RAS 激活的生长因子受体激活。
RAS 是另一个信号转导的中枢开关，而且已证实是MAPK (丝裂原活化蛋白激酶)信号转导通路的关键激活子。
胰岛素也可通过IRS1/2 (胰岛素受体底物-1/2)激活PI3K/Akt 通路。
胰岛素结合激活IR (胰岛素受体)酪氨酸激酶，使IRS1 或IRS2 磷酸化。
低蛋白饲料添加亮氨酸、精氨酸对大菱鲆幼鱼生长、消化、免疫及mTOR信号通路的影响
第54卷 第5期 2024年5月中国海洋大学学报P E R I O D I C A L O F O C E A N U N I V E R S I T Y O F C H I N A54(5):033~043M a y,2024低蛋白饲料添加亮氨酸㊁精氨酸对大菱鲆幼鱼生长㊁消化㊁免疫及m T O R 信号通路的影响❋田 原,刘成栋,王 旋,周慧慧,麦康森,何 艮❋❋(海水养殖教育部重点实验室(中国海洋大学),山东青岛266003)摘 要: 为探究亮氨酸和精氨酸作为信号分子参与调控m T O R 信号通路对大菱鲆(S c o ph t h a l m u s m a x i m u s )生长的作用,本研究以大菱鲆幼鱼(初始体质量(13.50ʃ0.19)g)为实验对象,设置50%蛋白水平饲料作为阳性对照组,45%蛋白水平饲料作为阴性对照组,设置两个实验组,分别为在阴性对照组中添加1%亮氨酸的实验组和添加1%精氨酸的实验组,饲养周期为56d,测量大菱鲆的生长性能和饲料利用水平㊂研究表明,添加亮氨酸㊁精氨酸均能一定程度提高因饲料蛋白水平不足导致的大菱鲆的特定生长率㊁蛋白质效率和增重率下降㊂添加1%亮氨酸和1%精氨酸均能在摄食后有效增强大菱鲆肌肉与肝脏m T O R 信号通路中的雷帕霉素靶蛋白(m T O R )㊁核糖体蛋白S 6和真核起始因子4E 结合蛋白1(4E -B P 1)的磷酸化㊂添加1%精氨酸还能够提高大菱鲆肠道淀粉酶和脂肪酶活性,显著提高血清过氧化氢酶和溶菌酶水平并增加血清总抗氧化能力㊂研究结果表明,在低蛋白饲料中添加1%亮氨酸㊁1%精氨酸能够激活大菱鲆m T O R 信号通路,有效提高其生长性能和蛋白质效率;此外,添加1%精氨酸还能够提高大菱鲆的消化酶活性㊁增强非特异性免疫反应㊂关键词: 大菱鲆;亮氨酸;精氨酸;m T O R 信号通路;低蛋白饲料中图法分类号: S 963.32 文献标志码: A 文章编号: 1672-5174(2024)05-033-11D O I : 10.16441/j .c n k i .h d x b .20220157引用格式: 田原,刘成栋,王旋,等.低蛋白饲料添加亮氨酸㊁精氨酸对大菱鲆幼鱼生长㊁消化㊁免疫及m T O R 信号通路的影响[J ].中国海洋大学学报(自然科学版),2024,54(5):33-43.T i a n Y u a n ,L i u C h e n g d o n g ,W a n g X u a n ,e t a l .E f f e c t s o f l e u c i n e a n d a r g i n i n e s u p p l e m e n t s o f l o w -pr o t e i n d i e t s o n g r o w t h ,d i g e s t i o n ,i m m u n i t y a n d t a r g e t o f r a p a m y c i n s i g n a l i n g p a t h w a y o f j u v e n i l e t u r b o t [J ].P e r i o d i c a l o f O c e a n U n i v e r s i t y o f C h i -n a ,2024,54(5):33-43.❋ 基金项目:国家重点研究发展计划项目(2018Y F D 0900400);国家自然科学基金项目(31772860)资助S u p p o r t e d b y t h e N a t i o n a l K e y R e s e a r c h a n d D e v e l o p m e n t P r o gr a m o f C h i n a (2018Y F D 0900400);t h e N a t i o n a l N a t u r a l S c i e n c e F o u n -d a t i o n o f C h i n a (31772860)收稿日期:2022-03-15;修订日期:2024-01-24作者简介:田 原(1997 ),女,硕士生㊂E -m a i l :t i a n yu a n o u c @126.c o m ❋❋ 通信作者:何 艮(1975 ),男,教授,主要研究方向为水产动物营养与饲料㊂E -m a i l :h e ge n @o u c .e d u .c n 蛋白质含量和饲料氨基酸水平是影响鱼类生长㊁繁殖㊁健康和饲料成本的主要因素㊂饲料中蛋白质不足时,鱼类势必会消耗非必要组织中的蛋白质,用以维持更重要组织的正常功能,从而导致生长受阻和体质量降低[1]㊂氨基酸不仅是组成蛋白质的基本构件,还能够作为信号分子,发挥调节关键代谢途径的具体作用[2-3]㊂在多种鱼类中已经证实,一些功能性氨基酸在促进生长和增强新陈代谢功能方面发挥关键作用[4-7]㊂亮氨酸作为一种支链氨基酸,它既能作为蛋白质合成的底物,也是激活蛋白质合成的 触发按钮 ,在促进蛋白质合成和抑制蛋白质降解方面发挥着重要作用[8]㊂同时亮氨酸缺乏将导致一系列不良生长效应,例如能量代谢失衡㊁淋巴组织受损㊁动物胸腺和脾萎缩[9-10],因此在饲料中适量添加亮氨酸能够有效调节动物机体免疫能力㊂更重要的是,亮氨酸能够通过特殊的信号网络,尤其是磷脂酰肌醇3-激酶-蛋白激酶B -哺乳动物雷帕霉素靶标(P I 3K -A K T -m T O R )信号通路,调节葡萄糖㊁脂肪和蛋白质的代谢,调节肠道健康和免疫,从而促进氮储留和蛋白质合成[11-12]㊂本实验在低蛋白饲料中添加1%饲料干物质的晶体亮氨酸,添加量参考已报道的大菱鲆研究[13]㊂精氨酸是大菱鲆的必需氨基酸,除了作为蛋白质的重要组分外,它还是一种功能性氨基酸,可以通过多条途径调节动物体内的营养代谢:包括激活m T O R C 1促进蛋白质和脂质合成[14-15];结合N O 通过N O -c -G M P 通路促进脂质氧化和糖酵解作用[16];以不依赖于血糖的方式促进胰岛素的释放,从而促进葡萄糖的利用[17]㊂大菱鲆(S c o ph t h a l m u s m a x i m u s )的精氨酸需求量为饲料干物质的3.17%[18],因此本实验中低蛋白饲料中添加1%饲料干物质的晶体精氨酸,以求达到大中国海洋大学学报2024年菱鲆精氨酸需求量㊂大菱鲆(S c o p h t h a l m u s m a x i m u s)俗称 多宝鱼 ,是一种经济养殖鱼类,具有生长速度快㊁营养丰富和味道鲜美等特点㊂为了降低饲料蛋白含量,我们将目光聚焦到氨基酸上,氨基酸除了做为蛋白合成的底物,氨基酸还拥有许多功能,其中晶体氨基酸作为信号分子的功能最受到关注㊂精氨酸和亮氨酸作为能激活内源性信号通路的经典氨基酸,本课题探究其是否可以作为一种刺激蛋白合成的添加剂而非蛋白合成底物对大菱鲆的生长产生积极影响㊂进一步探究影响鱼体蛋白质沉积的内在因素,为提高饲料蛋白质利用率提供新思路㊂1材料与方法1.1实验饲料以白鱼粉为主要蛋白质来源,以鱼油和大豆卵磷脂为主要脂肪来源,制作两种脂肪相同(125g/k g)㊁蛋白含量分别为45%和50%的饲料㊂以50%蛋白日粮为阳性对照组(H i g h p r o t e i n,H P),以45%蛋白日粮为阴性对照组(L o w p r o t e i n,L P),在45%蛋白日粮中分别添加1%(10g/k g饲料)的晶体L-亮氨酸(S i g m a-A l d r i c h,美国)为亮氨酸实验组(L o w p r o t e i n+L e u, L P+L),添加1%的晶体L-精氨酸(S i g m a-A l d r i c h,美国)为精氨酸实验组(L o w p r o t e i n+A r g,L P+R)(见表1)㊂L-丙氨酸(S i g m a-A l d r i c h,美国)作为非必需氨基酸适量添加至45%蛋白日粮中,以保持这3组低蛋表1实验饲料配方及成分分析(干物质)T a b l e1F o r m u l a t i o n a n d a n a l y t i c a l c o m p o s i t i o n o f d i e t s(d r y m a t t e r)%项目I t e m s组别G r o u pL P H P L P+L L P+R原料I n g r e d i e n t鱼粉F i s h m e a l150.4460.8850.4450.44小麦粉W h o l e w h e a t m e a l36.6228.0536.6236.62鱼油F i s h o i l4.954.104.954.95大豆卵磷脂S o y a b e a n l e c i t h i n2.502.502.502.50精氨酸A r g i n i n e0001.00亮氨酸L e u c i n e001.000丙氨酸A l a n i n e1.00000多维V i t a m i n p r e m i x21.001.001.001.00多矿M i n e r a l p r e m i x30.500.500.500.50诱食剂A t t r a c t a n t s41.001.001.001.00黏合剂(海藻酸钠)B i n d e r(N a a l g i n a t e)0.500.500.500.50氯化胆碱C h o l i n e c h l o r i d e0.300.300.300.30磷酸二氢钙C o n o c a l c i u m p h o s p h a t e1.001.001.001.00三氧化二钇Y t t r i u m o x i d e0.100.100.100.10丙酸钙C a l c i u m p r o p i o n a t e0.050.050.050.05乙氧基喹啉E t h o x y q u i n o l i n e0.050.050.050.05总计T o t a l100.00100.00100.00100.00成分分析(干物质基础)A n a l y t i c a l c o m p o s i t i o n(d r y m a t t e r b a s i s)粗蛋白C r u d e p r o t e i n45.8751.6245.9645.74粗脂肪C r u d e f a t11.5611.8712.0911.95灰分A s h12.8413.8511.7012.20注:1.鱼粉:蒸干鱼粉,粗蛋白质:70.10%,粗脂肪:7.58%,由秘鲁利马C O P E N C A公司提供㊂2.多维(m g/k g):维生素A,32;维生素D,5;维生素E,240;维生素K,10;维生素C,2000;维生素B12,10;生物素,60;叶酸,20;肌醇,800;烟酸,200;D泛酸钙,60;盐酸吡哆醇,20;维生素B2,45;维生素B1,25;微晶纤维素,16473㊂3.多矿(m g/k g):硫酸镁,1200;硫酸铜,10;硫酸铁,80;硫酸锌,50;硫酸锰,45;氯化钴,5;亚硒酸钠,20;碘化钙,60;沸石粉,8485㊂4.诱食剂(g/k g):甜菜碱,4;二甲基-丙酸噻亭,2;甘氨酸,2;丙氨酸,1;5-磷酸肌苷,1㊂L P:阴性对照组;H P:阳性对照组;L P+L:亮氨酸实验组;L P+R:精氨酸实验组;下表同㊂1.F i s h m e a l:s t e a m d r i e d f i s h m e a l,w i t h c r u d e p r o t e i n:70.10%,c r u d e l i p i d:7.58%,s u p p l i e d b y C O P E N C A G r o u p(L i m a,P e r u).2.V a t a m i n p r e m i x(m g/k g):r e t i n y l a c e t a t e,32;c h o l e c a l c i f e r o l,5;a l l-r a c-a-t o c o p h e r y l a c e t a t e,240;m e n a d i o n e s o d i u m b i s u l-p h i t e,10;a s c o r b i c a c i d,2000;c y a n o c o b a l a m i n,10;b i o t i n,60;f o l i c a c i d,20;i n o s i t o l,800;n i a c i n,200;D-C a-p a n t o t h e n a t e,60;p y r i d o x i n e H C l,20;r i b o f l a v i n,45;t h i a m i n H C l,25,m i c r o c r y s t a l l i n e c e l l u l o s e,16473.3.M i n e r a l p r e m i x(m g/k g):M g S O4㊃7H2O,1200;C u S O4㊃7H2O,10;F e S O4㊃7H2O,80;Z n S O4㊃H2O,50;M n S O4㊃H2O,45;C o C l2,5;N a2S e O3,20;c a l c i u m i o d a t e,60;z e o l i t e p o w d e r,8485.4.A t t r a c t a n t s(g/k g):b e t a i n e,4;D M P T,2;g l y c i n e,2;a l a n i n e,1;i n o s i n e-5'-d i p h o s p h a t e t r i s o d i u m s a l t,1.L P:L o w p r o t e i n;H P: H i g h p r o t e i n;L P+L:L o w p r o t e i n+L e u;L P+R:L o w p r o t e i n+A r g;t h e f o l l o w i n g t a b l e i s t h e s a m e.435期田原,等:低蛋白饲料添加亮氨酸㊁精氨酸对大菱鲆幼鱼生长㊁消化㊁免疫及m T O R信号通路的影响白日粮的氮含量相等(见表1)㊂将所有原料研磨成细粉,与鱼油和大豆卵磷脂充分混匀,用饲料制粒机挤压成粒(直径5.0m m)㊂饲料在45ħ烘箱中干燥18h,保存于-20ħ㊂不同的日粮在物理性质和下沉速度方面没有发现差异㊂1.2养殖实验养殖实验在青岛市胶南大场镇营南头村养殖区的室内常流水养殖系统中进行,实验大菱鲆购自威海大菱鲆育苗场㊂在实验正式开始前,暂养2周,所有大菱鲆用所制4种饲料混合暂养使其适应养殖系统和制备饲料的粒径㊂暂养结束后禁食24h,挑选出规格一致㊁体格健壮的大菱鲆(初始体质量(13.50ʃ0.19)g)随机分配于养殖桶中(300L),本实验有4个处理组,每个处理组3个重复,每个养殖桶内30尾鱼㊂养殖周期为56d,每天7:00和19:00手动投喂饲料2次,确认大菱鲆达到饱食状态㊂餐后收集残饵,在42ħ下烘干至恒重并称重,从摄食量计算中减去残饵质量㊂为保持水清洁,每餐后换水㊂实验期间每隔3d测量一次水质参数值,用温度计和盐度计测量水温和盐度㊂试验期间,水温保持在13.6~15.8ħ,盐度为29~32,氨氮小于0.1m g㊃L-1,亚硝酸盐小于0.1m g㊃L-1,溶解氧含量大于7m g㊃L-1㊂1.3样品采集在饲养试验结束时,将鱼禁食48h,使鱼体达到机体代谢基础水平㊂①禁食24h后,每桶鱼称量总质量并计算总数,每桶随机抽取4条鱼储存在-20ħ用于全鱼体成分分析㊂②在48h禁食周期结束时从每个处理组随机抽取6条鱼(每桶2条鱼),此时取样的鱼被指定为0h样品(禁食鱼)㊂随后将其余大菱鲆喂至饱食,每隔2㊁8和24h采集样本㊂在每个间隔中,从各处理组随机抽取6条鱼(每桶2条鱼)㊂③将大菱鲆用丁香酚(1ʒ10000,纯度99%,上海试剂,中国)麻醉后检查每条鱼的胃和肠道内是否有内容物,确保其有效地摄入了食物,随后立即解剖肝㊁肠和背外侧白肌,冷冻于液氮中,保存在-80ħ㊂④从鱼尾静脉采血到肝素抗凝管中,全血在4ħ条件下3000g离心15m i n,用以收集血清,随后储存于-80ħ用于后续分析㊂1.4饲料和鱼体组成分析将样品置于105ħ烘干至质量恒定并采用差量法测得水分含量;运用凯氏定氮法测定样品粗蛋白含量,干燥后的样品在催化剂的作用下用浓硫酸高温消化,然后采用全自动凯氏定氮仪(K j e l t e c T M8400, F O S S,瑞士)进行测定;采用索氏抽提法测定样品粗脂肪含量,干燥后的样品运用全自动索氏抽提仪(B u c h i 36680,瑞士)抽掉脂肪并采用差量法测得粗脂肪含量㊂将样品置于电炉烧至无烟,然后转移至马弗炉550ħ烧至质量恒定并采用差量法测得灰分含量㊂总能量采用全自动氧弹仪(P a r r,M o l i n e,I L,美国)测定㊂按国家标准(G B/T5009.124 2003)对样品进行氨基酸分析㊂将样品冷冻干燥(A L P H A1-2L D p l u s,C h r i s t c o,L t d,德国) 48h至质量恒定,称取30m g,加入6m o l㊃L-1盐酸15m L,充入氮气并在110ħ烘箱内水解22h,最后用全自动氨基酸分析仪(L-8900,H I T A C H I,日本)进行分析得到饲料氨基酸组成(见表2)㊂1.5肠道消化酶活性检测称取1g左右肠道样品,按质量(g)ʒ体积(m L)= 1ʒ9的比例加入9倍体积的生理盐水,冰水浴条件下充分匀浆,将匀浆液2500g4ħ离心10m i n,将上清液分装于离心管中,迅速进行后续检测㊂样品T P(货号: A045-2)㊁α-淀粉酶(货号:C016-1-1)㊁脂肪酶(货号: A054-2-1)㊁胰蛋白酶(货号:A080-2-2)㊁测定所使用的试剂盒均购自南京建成生物工程研究所㊂所有指标均严格按照说明书规定的方法操作㊁计算㊂1.6血清抗氧化能力与非特异性免疫指标检测大菱鲆血浆总抗氧化力(T-A O C)(货号:A015-1-2)㊁超氧化物歧化酶(S O D)(货号:A001-3-2)㊁过氧化氢酶(C A T)(货号:A007-1-1)及溶菌酶(L S Z)(货号: A050-1-1)活性均采用南京建成生物工程研究所的试剂盒,严格按照说明书上的步骤进行检测㊂1.7蛋白质提取及W e s t e r n b l o t分析称取50m g肝脏或肌肉样品(保持冰冻状态),加入含有蛋白酶和磷酸酶抑制剂(R o c h e,德国)的R I P A 裂解液(50m m o l/L T r i s㊃H C l,150m m o l/L N a C l, 0.5%N P-40,0.1%S D S,1m m o l/L E D T A,p H= 7.5)匀浆旋转裂解30m i n,之后12000g离心15m i n 取上清液㊂使用B C A蛋白浓度测定试剂盒(B e y o t i m e B i o t e c h n o l o g y,中国)测定上清液蛋白质含量㊂将组织蛋白提取液用聚丙烯酰胺凝胶电泳分离,通过转膜移至0.45μm P V D F膜上(M i l l i p o r e,美国)㊂转膜结束后将膜浸泡于5%脱脂奶粉T B S T缓冲液(20m m o l/L T r i s㊃H C l,500m m o l/L N a C l,0.1%T w e e n-20)中室温封闭1h,然后于4ħ下一抗孵育过夜㊂二抗为辣根过氧化物酶(H R P)标记山羊抗兔I g G(H+L)(B e y o-t i m e B i o t e c h n o l o g y,中国),室温孵育1h,用E C L试剂(B e y o t i m e B i o t e c h n o l o g y,中国)进行显影得到相应条带㊂本实验所使用的抗体如下:m T O R(货号2972), p-m T O R S e r2448(货号2971),S6(货号2217),p-S6 S e r235/236(货号4856),4E-B P1(货号9644),p-4E-B P1T h r37/46(货号2855),β-T u b u l i n(货号5568);以上抗体均购买于C e l l S i g n a l i n g T e c h n o l o g y I n c;所有抗体均已在大菱鲆上得到验证并已发表相关论文[19]㊂53中 国 海 洋 大 学 学 报2024年表2 日粮氨基酸组成(干物质)T a b l e 2 A m i n o a c i d s c o m p o s i t i o n o f t h e d i e t s (d r y ma t t e r )%必需氨基酸E A A 组别G r o u pL PH PL P +L L P +R 亮氨酸L e u c i n e 2.983.393.752.89精氨酸A r g i n i n e 2.302.642.323.12赖氨酸L ys i n e 2.823.302.812.78甲硫氨酸M e t h i o n i n e 0.901.080.900.9苏氨酸T h r e o n i n e1.731.981.691.71组氨酸H i s t i d i n e1.251.431.211.25苯丙氨酸P h e n y l a l a n i n e 1.701.911.811.71异亮氨酸I s o l e u c i n e 1.641.631.631.53缬氨酸V a l i n e1.942.191.831.93甘氨酸G l y c i n e 2.482.862.492.46天冬氨酸A s pa r t i c a c i d 3.464.013.473.5丝氨酸S e r i n e1.741.941.701.73脯氨酸P r o l i n e2.222.312.292.25半胱氨酸C y s t e i n e 0.790.850.790.81酪氨酸T y r o s i n e 1.281.451.271.24丙氨酸A l a n i n e3.332.942.532.53谷氨酸G l u t a m i c a c i d6.677.006.726.741.8数据分析计算公式如下:增重率(W e i g h t ga i n r a t e ,W G R ,%)=100ˑ(终末体质量-初始体质量)/初始体质量;特定生长率(S pe c if i cg r o w th r a t e ,S G R ,%/d )=100ˑ(l n 终末体质量-l n 初始体质量)/养殖天数;日摄食率(D a yf e e d i n t a k e r a t e ,D F I ,%)=100ˑ总摄食量/(养殖天数ˑ(终末体质量+初始体质量)/2);饲料效率(F e e d e f f i c i e n c y,F E ,%)=100ˑ鱼体湿增质量/总摄食量;蛋白质效率(P r o t e i n e f f i c i e n c y ra t i o ,P E R )=鱼体湿增质量/蛋白质摄入量;存活率(S u r v i v a l r a t e ,S R ,%)=100ˑ(终末尾数/初始尾数);肥满度(C o n d i t i o n f a c t o r ,C F ,g/c m 3)=100ˑ体质量/体长3;肝体比(H e p a t o s o m a t i c i n d e x ,H I S ,%)=100ˑ肝质量/体质量;脏体比(V i s c e r o s o m a t i c i n d e x ,V S I ,%)=100ˑ内脏质量/体质量㊂实验数据用平均值ʃ标准误(M e a n ʃS E )表示,采用S P S S 19.0版软件对所得数据进行数据分析和统计,先对数据作单因子方差分析(A N O V A ),若处理间有显著差异,再作T u k e y's 检验进行多重比较,P <0.05表示差异性显著㊂2 实验结果2.1生长性能和饲料利用率实验表明,低蛋白日粮饲喂下L P 组大菱鲆的特定生长率(S G R )和增重率(W G R )显著低于H P 组,当饲料分别添加1%的亮氨酸和精氨酸后能够有效缓解这种不良生长状态(P <0.05)㊂与L P 组日粮相比,分别添加亮氨酸和精氨酸的L P +L 组㊁L P +R 组日粮显著提高了大菱鲆的饲料效率(F E R )与蛋白质效率(P E R )(P <0.05),不过仍与H P 组日粮存在差距㊂此外,大菱鲆日采食量(D F I )受到日粮蛋白质含量的影响,H P组显著低于其他3个低蛋白实验组(P <0.05)㊂C F ㊁H S I 和V S I 在不同饮食处理之间无显著差异(P >0.05)(见表3)㊂635期田 原,等:低蛋白饲料添加亮氨酸㊁精氨酸对大菱鲆幼鱼生长㊁消化㊁免疫及m T O R 信号通路的影响表3 饲料添加亮氨酸㊁精氨酸对大菱鲆生长和饲料利用的影响T a b l e 3 G r o w t h p e r f o r m a n c e a n d f e e d u t i l i z a t i o n o f S .m a x i m u s f e d d i e t s w i t h L e u c i n e a n d A r gi n i n e 指标I n d e x e s组别G r o u pL PH PL P +LL P +RP *初始体质量I n i t i a l b o d y w e i g h t /g13.50ʃ0.1913.50ʃ0.1913.50ʃ0.1913.50ʃ0.19终末体质量F i n a l b o d y w e i g h t /g39.81ʃ0.33a 45.30ʃ0.88b 43.96ʃ0.91b 43.74ʃ0.31b 0.02增重率W e i g h t ga i n r a t e /%194.90ʃ2.42a 235.56ʃ6.54b 225.60ʃ6.74b 224.03ʃ2.32b 0.02特定生长率S pe c if i cg r o w th r a t e /(%㊃d -1)2.04ʃ0.02a2.28ʃ0.04b 2.23ʃ0.04b 2.22ʃ0.01b 0.02日摄食率D a i l yf e e d i n t a k e r a t e /(%㊃d -1)1.74ʃ0.01b 1.55ʃ0.03a 1.75ʃ0.02b 1.74ʃ0.01b <0.001饲料效率F e e d e f f ic i e n c y/%1.17ʃ0.01a 1.31ʃ0.02c 1.24ʃ0.01b 1.25ʃ0.01b <0.001蛋白质效率P r o t e i n e f f i c i e n c yr a t i o 2.37ʃ0.01a2.63ʃ0.02c2.54ʃ0.01b2.55ʃ0.01b<0.001肥满度C o n d i t i o n f a c t o r /%4.19ʃ0.24 4.51ʃ0.33 4.07ʃ0.27 4.41ʃ0.21 0.193肝体比H e p a t o s o m a t i c i n d e x /%1.39ʃ0.23 1.57ʃ0.49 1.53ʃ0.18 1.48ʃ0.26 0.490脏体比V i s c e r o s o m a t i c i n d e x /%5.84ʃ0.116.09ʃ0.526.02ʃ0.165.81ʃ0.130.750存活率S u r v i v a l r a t e /%100.00ʃ0.00 100.00ʃ0.00 100.00ʃ0.00 100.00ʃ0.00注:同一行内不同上标字母表示存在显著差异(P <0.05),n =3㊂*:P 值对应的数字没有单位㊂V a l u e s i n t h e s a m e r o w l a b e l e d w i t h d i f f e r e n t s u pe r -s c r i p t l e t t e r s a r e s i g n if i c a n t l y di f f e r e n t (P <0.05),n =3.*:T h e n u m b e r s i n t h e P -v a l u e c o l u m n h a v e n o u n i t .2.2体成分如表4所示,相比于H P 组,低蛋白水平饲料喂养下的L P 组表现出鱼体蛋白质和脂肪含量下降㊂与L P组相比之,饲料添加1%亮氨酸㊁精氨酸显著提高了鱼体脂肪水平(P <0.05),且在一定程度上挽救了因饲料蛋白不足造成的鱼体蛋白水平下降(P <0.05)㊂鱼体灰分㊁水分含量不受各组实验日粮影响(P >0.05)㊂2.3 消化酶因各处理组鱼体蛋白㊁脂肪水平存在差异,首先考虑功能性氨基酸是否对消化酶活性产生影响,对肠道中的α-淀粉酶(α-a m yl a s e ,A M S )㊁脂肪酶和胰蛋白酶进行了测定(见表5)㊂与L P 对照组相比,饲料中添加1%精氨酸能够有效提高淀粉酶和脂肪酶活性(P <0.05)㊂此外,各组间胰蛋白酶活性无明显差异(P >0.05)㊂表4 饲料添加亮氨酸㊁精氨酸对大菱鲆全鱼体组成的影响(湿质量)T a b l e 4 B o d y c o m p o s i t i o n o f S .m a x i m u s f e d d i e t s w i t h L e u c i n e a n d A r g i n i n e (w e t w e i gh t )%体组成B o d y c o m po s i t i o n s 组别G r o u pL PH PL P +LL P +RP *水分M o i s t u r e77.46ʃ0.1176.95ʃ0.3577.11ʃ0.3377.5ʃ0.160.413粗蛋白C r u d e p r o t e i n 14.91ʃ0.02a 15.96ʃ0.16b 15.35ʃ0.23a b15.19ʃ0.26a b 0.014粗脂肪C r u d e l i p i d 3.64ʃ0.21a4.14ʃ0.33b4.12ʃ0.26b4.03ʃ0.08b0.004灰分A s h3.66ʃ0.15 3.28ʃ0.023.23ʃ0.053.27ʃ0.130.060注:同一行内不同上标字母表示存在显著差异(P <0.05),n =3㊂*:P 值对应的数字没有单位㊂V a l u e s i n t h e s a m e r o w l a b e l e d w i t h d i f f e r e n t s u pe r -s c r i p t l e t t e r s a r e s i g n if i c a n t l y di f f e r e n t (P <0.05),n =3.*:T h e n u m b e r s i n t h e P -v a l u e c o l u m n h a v e n o u n i t .表5 饲料添加亮氨酸㊁精氨酸对大菱鲆肠道消化酶的影响T a b l e 5 T h e i n t e s t i n a l d i g e s t i v e e n z y m e o f S .m a x i m u s f e d d i e t s w i t h L e u c i n e a n d A r gi n i n e U ㊃m g-1消化酶D i g e s t i v e e n z ym e 组别G r o u pL PH PL P +LL P +RP *α-淀粉酶A M S0.86ʃ0.02a 0.96ʃ0.32b0.87aʃ0.01a 1.17ʃ0.02c<0.001脂肪酶L i pa s e 1.36ʃ0.02a1.41ʃ0.12a b1.37ʃ0.06a1.46ʃ0.02b0.004胰蛋白酶T r y p s i n 744.03ʃ5.64745ʃ3.02739ʃ8.12734ʃ9.950.309注:同一行内不同上标字母表示存在显著差异(P <0.05),n =3㊂*:P 值对应的数字没有单位㊂V a l u e s i n t h e s a m e r o w l a b e l e d w i t h d i f f e r e n t s u pe r -s c r i p t l e t t e r s a r e s i g n if i c a n t l y di f f e r e n t (P <0.05),n =3.*:T h e n u m b e r s i n t h e P -v a l u e c o l u m n h a v e n o u n i t .2.4抗氧化指标与非特异性免疫指标如表6所示,精氨酸的添加明显提升了大菱鲆血浆C A T ㊁L Z M 和T -A O C 活性(P <0.05),但血清S O D 活力与日粮精氨酸添加无关(P >0.05)㊂饲料中73中 国 海 洋 大 学 学 报2024年添加1%亮氨酸能够有效提高大菱鲆血清L Z M 活性㊂不同蛋白水平对大菱鲆血清L Z M 活性㊁S O D 活力㊁T -A O C 活性和C A T 活性均无明显影响(P >0.05)㊂2.5T O R 信号应答通路相关蛋白表达量的动态学变化亮氨酸是激活T O R 信号应答通路最有效的氨基酸,本实验通过检测大菱鲆摄食亮氨酸补充剂后肝脏和肌肉中m T O R ㊁S 6和4E -B P 1蛋白的磷酸化水平来监测摄食后T O R 信号应答通路的活性变化㊂研究显示,L P 组大菱鲆肝脏m T O R 在摄食后2h 被激活,并持续至6h ,到12h 开始减弱,受饲料蛋白水平影响,H P 组激活水平明显强于L P 组㊂同L P 组相比,L P +L 组添加亮氨酸显著提高了p -m T O R 活性水平,且激活可持续至12h ㊂大菱鲆肝脏S 6和4E -B P 1蛋白的磷酸化水平在各处理组显示出差异,L P 组大菱鲆肝脏S 6在摄食后2h 有所激活,在6h 达到顶峰,随后蛋白表达量逐渐下降㊂较高的饲料蛋白水平(H P )和饲料添加1%亮氨酸(L P +L e u )都能提高p -S 6㊁p -4E -B P 1的活性水平,且维持至12h(见图1)㊂表6 饲料添加亮氨酸、精氨酸对大菱鲆血清生化指标的影响T a b l e 6 T h e s e r u m b i o c h e m i c a l i n d i c e s o f S .m a x i m u s f e d d i e t s w i t h L e u c i n e a n d A r gi n i n e 血清生化指标S e r u m b i o c h e m i c a l i n d e x组别G r o u pL PH PL P +LL P +RP *L Y Z /(U ㊃m L -1)16.09ʃ0.27a16.58ʃ0.17a b16.26ʃ0.30a b16.77ʃ0.34b0.036S O D /(U ㊃m L -1)33.32ʃ0.8333.22ʃ0.3933.46ʃ0.0734.03ʃ0.210.214T -A O C /(U ㊃m L -1)18.16ʃ0.04a 18.29ʃ0.13a 18.44ʃ0.41a 19.17ʃ0.29b 0.006C A T /(U ㊃m L -1)8.64ʃ0.15a9.19ʃ0.46a b9.41ʃ0.10a b9.91ʃ0.47b0.012注:同一行内不同上标字母表示存在显著差异(P <0.05),n =3㊂L Y Z :溶菌酶;S O D :超氧化物歧化酶;T -A O C :总抗氧化能力;C A T :过氧化氢酶㊂*:P 值对应的数字没有单位㊂V a l u e s i n t h e s a m e r o w l a b e l e d w i t h d i f f e r e n t s u p e r s c r i p t l e t t e r s a r e s i g n i f i c a n t l y d i f f e r e n t (P <0.05),n =3.L Y Z :L ys o -z y m e ;S O D :S u p e r o x i d e d i s m u t a s e ;T -A O C :T h e t o t a l a n t i o x i d a n t c a p a c i t y;C A T :C a t a l a s e .*:T h e n u m b e r s i n t h e P -v a l u e c o l u m n h a v e n o u n i t.(蛋白质印迹检测大菱鲆摄食后后不同时间点肝脏中m T O R ㊁S 6和4E -B P 1的总水平和磷酸化形式的水平㊂L P :低蛋白水平饲料;H P:高蛋白水平饲料;L P +L e u :低蛋白水平饲料添加亮氨酸补充剂;m T O R :雷帕霉素靶蛋白;S 6:核糖体蛋白S 6;4E -B P 1:真核起始因子4E 结合蛋白1㊂T h e l e v e l so f t o t a l a n d t h e p h o s p h o r y l a t e d f o r m s o f m T O R ,S 6a n d 4E -B P 1i n l i v e r a t d i f f e r e n t t i m e p o i n t s a f t e r f e e d i n g w e r e e x a m i n e d b y we s t e r n b l o t s .L P :L o w p r o t e i n d i e t ;H P :H i g h p r o t e i n d i e t ;L P +L e u :L o w p r o t e i n d i e t w i t h l e u c i n e s u p p l e m e n t ;m T O R :M e c h a n i s t i c t a r g e t of r a p a m y c i n ;S 6:R i b o s o m a l p r o t e i n S 6;4E -B P 1:4E -b i n d i ng pr o t e i n 1.)图1 饲喂L e u 补充剂对大菱鲆幼鱼肝脏中m T O R 信号通路的影响F i g .1 E f f e c t s o f L e u s u p p l e m e n t a t i o n o f m T O R s i g n a l i n g i n l i v e r o f ju v e n i l e t u r b o t 精氨酸也能够激活哺乳动物的T O R 信号通路㊂本研究显示,同L P 组相比,L P+A r g 组提高了p-m T O R 活性水平㊂大菱鲆肝脏S 6和4E -B P 1蛋白的磷酸化水平受到精氨酸添加的影响,与阴性对照组相比,饲料添加1%精氨酸(L P +A r g )能提高p -S 6㊁p-4E -B P 1的活性水平,且维持至12h(见图2)㊂835期田 原,等:低蛋白饲料添加亮氨酸㊁精氨酸对大菱鲆幼鱼生长㊁消化㊁免疫及m T O R信号通路的影响(蛋白质印迹检测大菱鲆摄食后后不同时间点肝脏中m T O R ㊁S 6和4E -B P 1的总水平和磷酸化形式的水平㊂L P :低蛋白水平饲料;H P:高蛋白水平饲料;L P +A r g:低蛋白水平饲料添加精氨酸补充剂;m T O R :雷帕霉素靶蛋白;S 6:核糖体蛋白S 6;4E -B P 1:真核起始因子4E 结合蛋白1㊂T h e l e v e l s o f t o t a l a n d t h e p h o s p h o r y l a t e d f o r m s o f m T O R ,S 6a n d 4E -B P 1i n l i v e r a t d i f f e r e n t t i m e p o i n t s a f t e r f e e d i n g w e r e e x a m i n e d b y we s t e r n b l o t s .L P :L o w p r o t e i n d i e t ;H P :H i g h p r o t e i n d i e t ;L P +A r g :L o w p r o t e i n d i e t w i t h a r g i n i n e s u p p l e m e n t ;m T O R :M e c h a n i s t i c t a r g e t of r a p a m yc i n ;S 6:R i b o s o m a l p r o t e i n S 6;4E -B P 1:4E -b i nd i n g pr o t e i n 1.)图2 饲喂A r g 补充剂对大菱鲆幼鱼肝脏中mT O R 信号通路的影响F i g .2 E f f e c t s o f A r g s u p p l e m e n t a t i o n o n m T O R s i g n a l i n g i n l i v e r o f ju v e n i l e t u r b o t 摄食后大菱鲆肌肉中T O R 信号应答通路相关蛋白的表达量变化呈现与肝脏类似模式(见图3)㊂摄食2h 后L P 组大菱鲆肌肉m T O R 被有效激活,持续至6h 时开始减弱,之后逐渐恢复基础水平㊂6h 内L P +L 组大菱鲆肌肉中m T O R 激活程度均显著高于L P 组,且在摄食后12h 饲料添加亮氨酸(L P +L 组)能够维持大菱鲆肌肉m T O R 激活状态㊂大菱鲆肌肉S 6蛋白的磷酸化在摄食后2h 开始激活并在6h 达到顶峰,L P 处理组在摄食后12h 激活程度逐渐下降㊂与L P 组相比,饲料添加1%亮氨酸(L P +L 组)能够有效提高S 6激活峰值,且持续激活至12h ㊂同S 6相似,大菱鲆摄食后肌肉中4E -B P 1也在L P +L 组显示出较强的状态㊂实验显示(见图4),精氨酸在肌肉中也起到了激活T O R 信号通路的作用㊂与L P 组相比,饲料添加1%精氨酸(L P +A r g )能够有效提高磷酸化m T O R 的激活峰值㊂大菱鲆肌肉S 6和4E -B P 1蛋白的磷酸化在摄食后2h 开始激活,L P +A r g 组显示出比LP 组更高的激活水平㊂3 讨论足够的饲料蛋白水平是维持大菱鲆正常生长的必备条件,饲料蛋白不足将导致其生长水平低下㊂亮氨酸和精氨酸都是鱼类的必需氨基酸,对多种鱼类在各生长阶段生长起着重要作用㊂饲料中补充适宜的亮氨酸可以提高鱼类的生长性能,这在大菱鲆[13]㊁银鲫(C a r a s s i u s a u r a t u s g i b e l i o v a r .C A S Ⅲ)[20]㊁牙鲆(P a r a l i c h t h y s o l i v a c e u s )[21]㊁石斑鱼(E p i n e ph e l u s c o -i o i d e s )[22]等硬骨鱼中都已经被证实㊂饲料中添加适量精氨酸能够提升卵形鲳鲹(T r a c h i n o t u s o v a t u s )[23]和团头鲂(M e g a l o b r a m a a m b l y c e ph a l a )[24]等多种水产动物的生长效果㊂在本实验中,L P 饲料抑制了大菱鲆幼鱼的正常生长,而L P 饲料添加1%亮氨酸或1%精氨酸显著提高了大菱鲆的特定生长率㊁饲料效率㊁蛋白质效率和增重率,从而挽救因饲料蛋白不足带来的不利生长情况㊂此外,饲料氨基酸水平未对肥满度㊁肝体比和脏体比产生影响㊂本研究表明,饲料中添加适量功能性氨基酸可以提高大菱鲆幼鱼饲料利用率,同时提高蛋白质效率,这与在杂交鲶鱼(P e l t e o b a gr u s v a c h -e l l i ˑL e i o c a s s i s l o n gi r o s t r i s )[25]和银鲫[20]中的研究结果一致㊂不过,对军曹鱼(R a c h yc e n t r o n c a n ad u m )[26]和卵形鲳鲹[23]的研究表明,饲料中过量的精氨酸水平抑制了它们的生长㊂大菱鲆幼鱼对精氨酸需求量为饲料干物质的3.17%,本实验中L P +R 组精氨酸水平接近需求量,并未造成负面影响㊂过量亮氨酸水平也不利于牙鲆[21]和鲢鱼(M y l o p h a r y n go d o n p i c e u s )的生长[10]㊂93中 国 海 洋 大 学 学 报2024年(通过蛋白质印迹检测大菱鲆摄食后后不同时间点肌肉中m T O R ㊁S 6和4E -B P 1的总水平和磷酸化形式的水平㊂L P :低蛋白水平饲料;H P:高蛋白水平饲料;L P +L e u :低蛋白水平饲料添加亮氨酸补充剂;m T O R :雷帕霉素靶蛋白;S 6:核糖体蛋白S 6;4E -B P 1:真核起始因子4E 结合蛋白1㊂T h el e v e l s o f t o t a l a n d t h e p h o s p h o r y l a t e d f o r m s o f m T O R ,S 6a n d 4E -B P 1i n m u s c l e a t d i f f e r e n t t i m e p o i n t s a f t e r f e e d i n g w e r e e x a m i n e d b y we s t e r n b l o t s .L P :L o w p r o t e i n d i e t ;H P :H i g h p r o t e i n d i e t ;L P +L e u :L o w p r o t e i n d i e t w i t h l e u c i n e s u p p l e m e n t ;m T O R :M e c h a n i s t i c t a r g e t of r a p a m yc i n ;S 6:R i -b o s o m a l p r o t e i n S 6;4E -B P 1:4E -b i nd i n g pr o t e i n 1.)图3 饲喂L e u 补充剂对大菱鲆幼鱼肌肉中m T O R 信号通路的影响F i g .3 E f f e c t s o f L e u s u p p l e m e n t a t i o n o n m T O R s i g n a l i n g i n m u s c l e o f ju v e n i l e t u r b ot (蛋白质印迹检测大菱鲆摄食后后不同时间点肌肉中m T O R ㊁S 6和4E -B P 1的总水平和磷酸化形式的水平㊂L P :低蛋白水平饲料;H P:高蛋白水平饲料;L P +A r g:低蛋白水平饲料添加精氨酸补充剂;m T O R :雷帕霉素靶蛋白;S 6:核糖体蛋白S 6;4E -B P 1:真核起始因子4E 结合蛋白1㊂T h e l e v e l s o f t o t a l a n d t h e p h o s p h o r y l a t e d f o r m s o f m T O R ,S 6a n d 4E -B P 1i n m u s c l e a t d i f f e r e n t t i m e p o i n t s a f t e r f e e d i n g w e r e e x a m i n e d b y we s t e r n b l o t s .L P :L o w p r o t e i n d i e t ;H P :H i g h p r o t e i n d i e t ;L P +A r g :L o w p r o t e i n d i e t w i t h a r g i n i n e s u p p l e m e n t ;m T O R :M e c h a n i s t i c t a r g e t of r a p a m yc i n ;S 6:R i b o s o -m a l p r o t e i n S 6;4E -B P 1:4E -b i nd i n g pr o t e i n 1.)图4 饲喂A r g 补充剂对大菱鲆幼鱼肌肉中mT O R 信号通路的影响F i g .4 E f f e c t s o f A r g s u p p l e m e n t a t i o n o n m T O R s i g n a l i n g i n m u s c l e o f ju v e n i l e t u r b o t 045期田原,等:低蛋白饲料添加亮氨酸㊁精氨酸对大菱鲆幼鱼生长㊁消化㊁免疫及m T O R信号通路的影响在幼鱼时期,鱼类消化系统尚未完全发育,消化酶活性常被用作衡量鱼消化系统消化能力的指标㊂适量添加精氨酸能够促进鱼类肠道发育和提高消化能力㊂基于本研究结果,饲料添加1%精氨酸能够有效地提高大菱鲆幼鱼的淀粉酶活性和脂肪酶活性,这与在大黄鱼(L a r i m i c h t h y s c r o c e a)[27]和黑鲷(A c a n t h o p a g r u s s c h l e g e l i i)[28]中的研究结果一致㊂然而,并非所有消化酶在该组中都表现出最佳活性㊂例如,胰蛋白酶活性并未明显高于其他各处理组㊂而在大黄鱼中胰蛋白酶水平随着饲料精氨酸水平同步提高,这种不同可能是因生长阶段和物种差异造成的㊂精氨酸在调节高等脊椎动物的免疫应答和抗病能力效果方面尤为突出,在鱼类中精氨酸作为免疫调节剂受到了极大的关注㊂溶菌酶是鱼类先天免疫系统的重要组成部分,血浆溶菌酶波动能够反映出大菱鲆对应激源的反应㊂过氧化氢酶普遍存在于生物体内,酶促活性为机体提供了抗氧化防御机理㊂在本研究中发现,饲料添加1%精氨酸能够提高大菱鲆血浆总抗氧化能力和溶菌酶㊁过氧化氢酶活性,这意味着精氨酸能够提高大菱鲆的免疫应答和抗病能力,这与之前在斑鲈(L a t e o l a b r a x m a c u l a t u s)[29]和斑点叉尾鮰(I c t a l u-r u s p u n c t a t u s)[30]中得到的结论一致㊂先前的研究表明,精氨酸缺乏会在不同鱼类中造成一系列免疫问题,包括白细胞数量减少,溶菌酶和补体活性降低,刺激超氧阴离子㊁一氧化氮和免疫球蛋白生成,以及造成血凝反应,对病原体的抵抗力也因此下降㊂然而,饮食中过量的精氨酸似乎适得其反,降低了一些硬骨鱼类的免疫功能和抗病能力,例如鲤鱼(C y p r i n u s c a r p i o)[31]㊂m T O R信号通路能够整合多种信号刺激合成代谢(如蛋白质㊁脂质和核苷酸合成),进而促进细胞生长,同时抑制自噬等分解代谢过程,亮氨酸和精氨酸已经被证明是激活m T O R C1的最重要氨基酸之一[12,32]㊂在本研究中,与L P组相比,投喂晶体亮氨酸㊁精氨酸饲料的大菱鲆拥有更高的体蛋白和体脂肪水平,与H P 组相当㊂这与在许多硬骨鱼中的研究结果一致[33-34]㊂添加亮氨酸后,L P+L组大菱鲆显示出高的饲料蛋白质利用率和m T O R信号通路蛋白激活情况,与H P组相当㊂本研究结果表明,日粮中添加亮氨酸可提高肌肉和肝脏中m T O R㊁4E-B P1和S6的磷酸化水平㊂在哺乳动物中,亮氨酸被证明直接通过m T O R或间接通过P I3K-A K T-m T O R信号通路调节蛋白质合成㊂给限制饮食的成年大鼠口服亮氨酸可通过激活m T O R 信号通路来刺激骨骼肌中蛋白质合成[35]㊂低蛋白配方食物中添加亮氨酸可显著增加新生猪骨骼肌和内脏组织中的蛋白质合成,达到与高蛋白膳食相似的速率[36]㊂此外,L a n g等[37]报道称亮氨酸诱导的T O R磷酸化可能不依赖于P I3K-A K T信号通路㊂这些发现表明,与哺乳动物一样,亮氨酸可以激活硬骨鱼细胞中T O R或P I3K-A K T-T O R信号通路,且有助于鱼类肌肉蛋白质的合成㊂然而,凡纳滨对虾(L i t o p e n a e u s v a n-n a m e i)[38]幼虾的肌肉蛋白质含量不随亮氨酸水平的增加而变化㊂在银鲫[20]的研究中发现,饲料亮氨酸水平对肌肉中4E-B P2和S6K1的m R N A水平没有差异㊂这一点在大菱鲆幼鱼中也被证实,张凯凯等[5]认为大菱鲆幼鱼肌肉中4E-B P1-2和T O R的转录水平不受饲料亮氨酸的影响㊂因此,还需要更多的研究来阐明亮氨酸促进鱼类肌肉蛋白质合成的更详细的机制㊂与亮氨酸类似的,低蛋白饲料中添加精氨酸能够激活大菱鲆肌肉和肝脏中m T O R信号通路㊂这与在哺乳动物研究中得到的结论一致,Y a o等[39]发现日粮补充精氨酸可增加新生猪骨骼肌中的m T O R信号传导活性㊂相应的,在鱼类研究中发现适当的精氨酸还能显著提高草鱼(C t e n o p h a r y n g o d o n i d e l l a)肌肉中t o r和s6k1基因的表达水平[34]㊂从以上研究可以发现,亮氨酸和精氨酸都是能够激活大菱鲆m T O R信号通路的功能性氨基酸,此外,精氨酸还能够提高大菱鲆消化酶活性,这是在L P+L组没有观察到的㊂4结语低蛋白饲料中添加1%亮氨酸或1%精氨酸能够有效提高大菱鲆幼鱼生长性能,亮氨酸和精氨酸作为化学信使能够有效激活m T O R信号途径,进而影响大菱鲆肝脏和肌肉蛋白合成,提高低蛋白水平饲料喂养下大菱鲆的饲料蛋白效率和蛋白质沉积,最终促进了大菱鲆的生长㊂精氨酸作为有代表性的功能性氨基酸,能够影响大菱鲆生长㊁体组成㊁肠道消化吸收能力和特异性免疫㊂这些结果为进一步揭示功能性氨基酸调控鱼类生长的内在机制提供了参考㊂参考文献:[1] W i l s o n R P.A m i n o A c i d s a n d P r o t e i n s.I n:F i s h N u t r i t i o n[M].3r d E d i t i o n.N e t h e r l a n d s:E l s e v i e r,2002.[2] W u G Y.A m i n o a c i d s:M e t a b o l i s m,f u n c t i o n s,a n d n u t r i t i o n[J].A m i n o A c i d s,2009,37(1):1-17.[3] W u G Y.F u n c t i o n a l a m i n o a c i d s i n g r o w t h,r e p r o d u c t i o n,a n dh e a l t h[J].A d v a n c e s i n N u t r i t i o n,2010,1(1):31-37.[4]C o s t a s B,C o n c e i c a o L E C,D i a s J,e t a l.D i e t a r y a r g i n i n e a n d r e-p e a t e d h a n d l i n g i n c r e a s e d i s e a s e r e s i s t a n c e a n d m o d u l a t e i n n a t e i m-m u n e m e c h a n i s m s o f S e n e g a l e s e s o l e(S o l e a s e n e g a l e n s i s K a u p, 1858)[J].F i s h&S h e l l f i s h I m m u n o l o g y,2011,31(6):838-847.[5]Z h a n g K K,M a i K S,X u W,e t a l.E f f e c t s o f d i e t a r y a r g i n i n e a n d g l u-t a m i n e o n g r o w t h p e r f o r m a n c e,n o n s p e c i f i c i m m u n i t y,a n d d i s e a s e r e-s i s t a n c e i n r e l a t i o n t o a r g i n i n e c a t a b o l i s m i n j u v e n i l e t u r b o t(S c o p h t h a l-m u s m a x i m u s L.)[J].A q u a c u l t u r e,2017,468:246-254.14。
mtor信号通路常用检测指标
mtor信号通路常用检测指标mtor信号通路是一种重要的细胞信号传导通路，参与调控细胞的生长、增殖、代谢和存活等多个生命活动。
为了研究mtor信号通路的活性和功能，科学家们发展了一系列常用的检测指标。
本文将对这些常用的检测指标进行介绍和解析。
1. mtor蛋白的表达水平：mtor信号通路的核心是mtor蛋白，因此检测mtor蛋白的表达水平是研究该通路活性的重要指标。
常用的方法包括免疫印迹和免疫组化等。
2. mtor激酶活性：mtor蛋白是一种激酶，其活性的变化可以反映mtor信号通路的活性。
常用的方法包括in vitro激酶活性检测和in vivo磷酸化水平检测等。
3. mtor下游效应分子的磷酸化水平：mtor信号通路通过磷酸化一系列下游效应分子来调控细胞的生理过程。
因此，检测这些下游效应分子的磷酸化水平可以间接反映mtor信号通路的活性。
常用的方法包括免疫印迹和免疫组化等。
4. p70s6k的磷酸化水平：p70s6k是mtor信号通路的主要下游效应分子之一，其磷酸化水平的变化可以反映mtor信号通路的活性。
常用的方法包括免疫印迹和免疫组化等。
5. 4EBP1的磷酸化水平：4EBP1是mtor信号通路的另一个重要下游效应分子，其磷酸化水平的变化可以反映mtor信号通路的活性。
常用的方法包括免疫印迹和免疫组化等。
6. s6的磷酸化水平：s6是mtor信号通路的另一个下游效应分子，其磷酸化水平的变化可以反映mtor信号通路的活性。
常用的方法包括免疫印迹和免疫组化等。
7. mtor信号通路相关基因的表达水平：除了检测mtor蛋白及其下游效应分子的活性外，还可以通过检测mtor信号通路相关基因的表达水平来评估该通路的活性。
常用的方法包括实时荧光定量PCR和转录组测序等。
总结起来，mtor信号通路常用的检测指标包括mtor蛋白的表达水平、mtor激酶活性、mtor下游效应分子的磷酸化水平、p70s6k的磷酸化水平、4EBP1的磷酸化水平、s6的磷酸化水平以及mtor信号通路相关基因的表达水平等。
mTOR信号通路与肿瘤的研究进展 郑鹏生
图 1 mT O R 的结构图 Fig . 1 Str ucture o f mT O R
1. 2 m T OR 的存在形式 mT OR 在生物体以两种复 合物的形式存在 , 即 m TORC1 及 mT ORC2 。 mTORC1 包括 m TOR 、 mLST 8( mammalian ortholog of LST8 , 又 名 GβL )和 raptor ( regulatory-associated protein of m TOR) ; m TORC2 包括 mT OR 、 mLST 8 、 mSIN1 ( mitogen-activated pro tein kinase -associated pro tein 1) 及 rictor ( rapamycin insensitive companion of m TOR) 。 研究 表明 , 雷帕霉素主要通过与细胞内受体 F KBP12 结合 而抑制 m TORC1 , 但是对 m TORC2 无作用 。 目前研究 较多的是 mT ORC1 复合物 。 raptor 分子结构相对保 守 , 分子质量为 150 ku , 所有 rapt or 家族成员都在 N端有一段保守区及 3 个 H EA T 重复序列 , m T OR 分 子 N-端的重复序列使得它与 rapto r 结合紧密 , 而 C端与 rapt o r 结合较疏松[ 5] 。 如图 2 所示 , rapt o r 是一 种桥梁分子 , 它 可 以将 mT O R 与下 游的 靶分 子如 P70S6K 、4EBP 1 连 接起来 。 但是 , 在营养 素等上游 因子不 存在时 , m LST 8 将 m T OR 、rapt or 紧密地锁 在一起 , 使得 m T OR 不能与其下游的靶基因结合 ; 当 营养素存在情况下 , 这一复合物发生空间构象改变 , 使得 m LS T 8 和 rapt or 之 间的 结 合 断 裂 , 暴 露 出 m T OR , 从而 使其 下 游靶 基因 结合 于 rapt or 上
mTOR信号通路调控机制解析及疾病治疗策略
mTOR信号通路调控机制解析及疾病治疗策略mTOR（mammalian target of rapamycin）是一种高度保守的蛋白激酶，在细胞内起到重要的信号传导作用。
它能够感知营养状态、能源供应和环境压力，进而调控细胞生长、代谢和增殖。
mTOR信号通路异常与多种疾病如癌症、肥胖症、糖尿病、自身免疫疾病等密切相关。
因此，解析mTOR信号通路的调控机制，并开发相应的疾病治疗策略，对于促进健康和治疗疾病具有重要意义。
mTOR信号通路的调控机制是一个复杂的过程。
它主要通过两个复合物mTORC1和mTORC2发挥作用。
mTORC1是mTOR的一个复合物，由mTOR、Raptor和其他蛋白质组成。
mTORC1主要调控细胞代谢和生长过程，包括蛋白质合成、自噬、核苷酸合成等。
mTORC1的活化受到许多信号的调控，其中最重要的是脂质信号、胰岛素/IGF-1信号和氨基酸信号。
mTORC2则主要参与细胞内多种信号通路的调控，如AKT信号通路等。
mTOR信号通路在癌症中扮演着重要的角色。
癌细胞的异常增殖和代谢依赖于mTOR信号通路的过度活化。
因此，抑制mTOR信号通路已成为癌症治疗研究的重要方向。
目前，已有多种mTOR抑制剂被用于临床治疗，如雷帕霉素（rapamycin）及其衍生物。
这些药物能够选择性地抑制mTORC1的活性，从而抑制癌细胞的生长。
然而，单一的mTOR抑制剂在一些肿瘤治疗中效果并不显著，因此研究人员正在寻找新的组合治疗策略。
近年来，研究发现mTOR通路与免疫调节密切相关。
mTOR信号通路在免疫细胞中起到重要的调控作用，影响免疫细胞的功能和代谢。
因此，调控mTOR信号通路有望成为治疗自身免疫疾病的新策略。
例如，一些mTOR抑制剂已被用于治疗类风湿性关节炎和系统性红斑狼疮等自身免疫疾病。
此外，mTOR信号通路还参与肥胖症和糖尿病等代谢性疾病的发生和发展，因此调控mTOR信号通路也有望成为治疗这些疾病的新途径。
干货揭开mTOR的神秘面纱，信号通路一点就通
干货揭开mTOR的神秘面纱，信号通路一点就通mTOR是一个重要的真核细胞信号，其稳定性影响T细胞中细胞因子的表达，参与免疫抑制，影响转录和蛋白质合成，调节细胞的生长、凋亡、自噬等。
mTOR在肿瘤中也经常被激活，通过关键代谢酶的表达改变和/或活性改变，来进一步控制癌细胞的生长和代谢。
致癌信号传导和代谢改变在癌细胞中往往是相互关联的。
癌细胞通过代谢重编程，来确保在营养稀缺和压力微环境中的存活和增殖。
已有很多研究表明，癌症特异性代谢改变，包括氨基酸，葡萄糖，核苷酸，脂肪酸和脂质的异常代谢。
而代谢重编程往往由致癌信号传导介导。
mTOR信号传导就经常在肿瘤中被激活，并通过关键代谢酶的表达改变和/或活性改变，来进一步控制癌细胞的生长和代谢。
相反，代谢改变，例如通过增加的葡萄糖或氨基酸摄取，也可以影响mTOR 信号传导。
mTOR信号参与可以调节氨基酸，葡萄糖，核苷酸，脂肪酸和脂质的代谢，在研究中极其重要。
所以，今天带大家揭开mTOR 的神秘面纱。
mTOR研究可以追溯到1964年发现的雷帕霉素，因为它的全称叫做哺乳动物雷帕霉素靶点( mammalian target of rapamycin，mTOR ) 。
mTOR是一类丝/苏氨酸激酶，C端与磷脂酰肌醇激酶( PI3K ) 催化域同源，但是其本身又不具备酯酶激酶的活性，而是Ser/Thr蛋白激酶活性。
在细胞内存在mTORC1和mTORC2两种不同的复合体，由于mTORC2组分在小鼠中的缺失以及mTORC2抑制剂缺失而引起的早期致死性使其研究变得复杂。
经过几十年的研究表明，mTOR属于一个重要的真核细胞信号，其稳定性影响T细胞中细胞因子的表达，参与免疫抑制，影响转录和蛋白质合成，调节细胞的生长、凋亡、自噬等。
mTOR则被认定为肿瘤治疗的新靶点，对运动、代谢、神经等疾病具有重要的调节作用。
在疾病研究方面，mTOR在各种细胞过程中被激活，比如肿瘤形成、血管生成、胰岛素抵抗、脂肪形成及淋巴细胞活化，在多种癌症及2型糖尿病中表达失调。