河豚毒素简介

河豚毒素

河豚毒素（tetrodotoxin, TTX）是一种毒性很强、相对分子质量小的非蛋白毒素，最初从豚科鱼中发现，故被命名为河豚毒素。TTX为典型的Na+通道阻断剂，中毒者往往肢体麻木、瘫痪、甚至死亡；但另一方面，TTX具有镇痛、镇静、降压等功效，在临床上的应用十分广泛。

1.河豚毒素的结构与性质

河豚毒素的化学研究始于1909 年, 1964 年以后由Woodward 测定了TTX 的结构, 1972 年Kishi 等采用化学方法成功合成了河豚毒素。河豚毒素分子式为C11H17N3O8, 分子量为319.27。分子主要由3 个氮原子组成, 它们与氢氧原子形成特殊的结构。其结构特征如图1, 含有1 个碳环, 1 个胍基, 6 个羟基, 在C—5 和C—10位有一个半醛糖内酯连接着分开的环。有专家将其称为“自然界最奇特的分子之一”, 也是世界上最致命的毒药之一。1 g 河豚毒素的毒性是1 g 氰化物的1 万倍。

TTX 粗制品为棕黄色粉末, 纯品为无色晶体, 呈针状或菱形, 无臭, 无味, 易吸湿潮解, 不溶于无水乙醇、乙醚、苯等有机溶剂, 微溶于水, 极易溶于稀酸水溶液。TTX 在溶液中存在TTX、半缩醛型TTX、内酯型TTX动态平衡的三种结构。TTX 理化性质比较稳定, 在中性和酸性条件下对热稳定, 240 ℃开始碳化, 但300 ℃以上也不分解。在碱水溶液中易分解, 在5%氢氧化钾溶液中于80 ℃～100 ℃可分解成黄色结晶2- 氨基- 6- 羟甲基- 8- 羟基- 喹唑啉, 这也是TTX 化学检测法的理论基础。

2. 河豚毒素中毒机理

2.1 中毒临床表现

河豚鱼中毒发病急速而剧烈，潜伏期为0.5～3h(一般10～45min)。初期有颜面潮红、头痛，继而出现剧烈恶习、呕吐、腹痛、腹泻等肠胃道症状。然后出现感觉神经麻痹症状，口唇、舌、指端麻木和刺痛。感觉减退。继而出现运动神经麻痹症状，手、臂肌肉无力，抬手

困难，腿部无力以致运动失调，步态蹒跚，身体摇摆；舌头发硬、语言不清，甚至全身麻痹、瘫痪。病情严重者出现低血压、心动过缓和瞳孔固定放大，呼吸迟缓浅表，逐渐呼吸困难，以至呼吸麻痹，脉搏由亢进到细弱不整，最后死于呼吸衰竭。可于4～6h 内死亡，致死时间最快者可在发病后10min 死亡。如抢救及时病程超过8～9h 未死亡者多能恢复，病死率40%～60%。

2.1中毒机理

TTX 对小鼠腹腔注射的LD50 是8～10 μg/kg，比氰化钠毒性大1000 倍。人的致死剂量6～7 μg/kg。TTX 中毒机理是抑制神经细胞膜对钠离子的通透性，从而阻断神经冲动的传导，使神经呈麻痹状态。研究表明，TTX 活性基团是1 、2 、3 位的胍胺基和附近的C 4、C 9、C 10 位的羟基。胍胺基在生理p H条件下发生质子化，形成正电活性区域，与钠通道受体蛋白的负电性羰基相互作用，阻滞钠离子进入通道。钠离子受体至少有 6 个特异性靶分子结合位点，TTX 是与钠通道受体部位Ⅰ结合。TTX 受体位于可兴奋细胞膜外侧、钠通道外口附近，TTX 与受体部位结合，阻碍钠离子接近通道外口。研究表明，TTX 特异性作用于钠通道，对钾、钙通道和神通经肌肉的突触及胆碱指酶无直接影响。研究还表明，毒素能通过血脑屏障进入中枢对中枢产生明显的抑制作用。总的来说，TTX 对呼吸和心血管的抑制是对中枢和外周的共同作用结果。

2.2 中毒解治

TT X 中毒目前尚无特效解毒药，中毒早期应彻底催吐、洗胃和导泻，以排出尚未吸收的毒素。催吐应尽快进行，可1% 的硫酸铜100ml。如病人已有呕吐则不需药物催吐，应立即用1:2000～1:4000高锰酸钾或1%～9%碳酸氢钠液或0.2%活性炭悬液大量、反复洗胃，以便尽快彻底排除胃内毒素，导泻可用50% 硫酸镁50ml。中期中毒可用安全有效的解毒剂L －半胱氨酸盐酸盐静脉滴注以促进毒素的排泄和维持水和电解质的平衡。呼吸困难可用洛贝林、尼可刹米等药物注射，肌肉麻痹可用1% 盐酸士的宁肌肉注射2ml 每日3 次，同时并用高渗葡萄糖液输液以保护肝脏帮助排毒。

3.河豚毒素的检测

目前TTX 的检测方法：一是生物学检验法，小鼠活体实验。最早的方法是20 世纪40 年代Kao基于一定重量的小鼠经腹腔注射TTX 后其死亡时间的倒数于TTX 的剂量之间存在线性关系而建立起来的。1984年Davio等建立了竞争性置换检测法，其依据是TTX 可特异置换事先与大鼠脑膜受体结合的H-STX(石房蛤毒素，Saxitoxin)。1992 年，Penz等还通过检测TTX等Na+ 通道阻滞剂对麻痹下存活大鼠心电图的影响来测定TT X。在动物实验基础上，又建立起离体组织培养法，1991 年，Kaofman 等建立的定量比色细胞分析法。二是理化检测法，TTX 在强碱的作用下会发生降解，生成一个荧光化合物2-氨基-6-甲羟基-8羟基喹啉(简称C9碱)，这是许多方法的理论基础。Nunez 等最早提出通过测定荧光化合物C9 碱来测定TTX 的荧光分析法，该法的检出限为0.34～10.0mg/L。由于TTX 在碱性条件下生成C9 碱的同时还定量生成草酸钠，陈玉仁等据此在光法基础上建立紫外分光光度法，检出限是20～100mg/L 。其它如薄层分析法，反相高效液相色谱法(HPLC)，毛细管电泳法等。近年来，还出现一些检出率极高的新方法，Quilliam等将离子发射质谱应用于TTX的定性定量分析，检出限为0.2mg/L。三是免疫学检测法，TTX 的免疫检测法的基础是单克隆抗体(McAb)，是将小分子的TTX 连接到大分子载体上，使其成为完全抗原并应用于动物。使用的载体有牛血清白蛋白(bovine serum albumin，BSA)和钥孔虫戚血蓝蛋白(keyhole limpet hemocyanin，KLH)，这种方法目前仍处于发展完善中。

4.河豚毒素的提取

TTX 的提取方法主要有乙酸提取或改良乙酸提取、树脂提取和甲醇提取等。目前, 我国TTX 提取常用的方法是从河豚鱼体不同部位提取纯化TTX, 一般工艺流程为[7]: 河豚鱼→水, 乙酸等浸提→除蛋白质、脂类→离子交换等方法分离→脱色→活性炭吸附、聚丙烯酰胺层析等方法纯化→浓缩、精制→结晶, 此法TTX的提纯难达到试剂级的高精水平。由于很多文献报道TTX 多克隆抗体能够与TTX 特异性结合, 中和其毒性, 因此可以考虑将TTX 多克隆抗体偶联于载体制成免疫亲和层析介质, 再对TTX 进行纯化, 简化其提取工艺, 提高TTX 产率。

由于大量捕杀河豚鱼受到资源和时空的限制, 破坏了河豚鱼资源, 甚至导致生态平衡的破坏, 所以人们不得不另辟蹊径。根据河豚毒素的微生物起源, 分离出产河豚毒素的微生物类群, 通过微生物发酵来产生河豚毒素。产TTX 的微生物类群有弧菌属(Vibrio)的溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)和鳗弧菌(Vibrio anguillarum),假单胞菌属(Pseudomonas), 希瓦氏菌属的腐败希瓦菌(Shewanella putrefy aciens), 交替单胞菌(Alteromonas),芽孢杆菌属(Bacillus), 链霉菌属(Streptomyces), 其中产毒力较高的主要是溶藻弧菌和河豚毒素互生单胞菌(Alteromonas tetrodonis)。但微生物产河豚毒素产量非常低, 仅为ng 级。由于其产生机制尚不清楚, 提高其产量及其纯化方法也是一个难题。

5.河豚毒素的应用

河豚毒素有着特殊结构和作用机理, 引起了人们的广泛关注。神经生物学家证实微量毒液就有治疗作用。河豚毒素也可作为局部麻醉药, 其局部麻醉作用比一般麻药强。国外已有将河豚毒素与普通麻药配伍作为局部麻药的专利出售。河豚毒素对癌痛的镇痛也很有效。研究人员发现癌症病人24 h 持续杜冷丁治疗收效甚微, 而注射河豚毒素, 每天2 次, 连续3 天疼痛便缓解。河豚毒素不仅可以有效缓解晚期癌症引起的剧烈痛楚, 还可治疗顽固性哮喘等。

我国研究人员发现, 河豚毒素还是一种戒毒良药。研究人员对吸毒者进行试验, 在注射极微量的河豚毒素后, 所有各种“戒毒综合症”在30 min 后全部消失。连续注射5 d 后可完全戒除毒瘾, 且没有副作用。1998年, 加拿大国际韦克斯技术公司利用河豚毒素成功研制成一种名为tetrodin 的戒毒新药。利用河豚毒素来戒除毒瘾, 可谓“以毒攻毒”的一大创举。

目前河豚在我国的养殖产量每年达到1 至1.5 万t,年产值10 至20 亿元, 加工后的附加值提高5 至10 倍。但人们养殖河豚鱼仅仅限于食用, 追求无毒, 实际上河豚毒素的市场需求量更大, 而且河豚毒素本身的特点使其价值极为昂贵。据报道每克纯度达99 %以上的河豚毒素价值高达20 万美元, 甚至还有上升的趋势。一旦国家开禁, 河豚未来在中国的市场将成为全球最大的市场, 河豚毒素的应用前景也将更为广阔。

TTX 作为典型的钠离子通道阻滞剂，已成为医学研究的重要生物工具，也是潜在的生物战剂，制备高纯度河豚毒素在医学上作为抗肿瘤、抗神经痛等高效制剂在医学临床治疗中有着广阔的应用前景。同时河豚鱼作为与人们饮食生活直接或间接相关的物种，科学工作者也在积极寻求各种西医或中医的切实可行的TTX 的解毒办法，让河豚鱼这种海洋生物造福于人类。