6. 荧光分光光度法解析

如荧光素的乙醇溶液在0℃以下每降低10 ℃，荧 光效率增加3%，冷至-80℃时，荧光效率为100%。
影响荧光的外界因素
（三）pH值：
具酸或碱性基团的有机物质，在不同 pH 值
时，其结构可能发生变化，因而荧光强度将发生
改变；对无机荧光物质，因 pH 值会影响其稳定 性，因而也可使其荧光强度发生改变。
6.2.2.4 分子荧光的类型
• 分子因吸收光能而被激发，所产生的次级 光发射现象称为光致发光； • 分子被激发的能量是由化学反应释放的能 量所提供，其发光现象称为化学发光。
•由生物体内化学反应所引起的发光现象，被称 为生物发光。
• 荧光棒
• 荧光棒内主要由过氧化物、酯类化合物 和荧光染料三种化学成分构成。荧光棒 发光原理是过氧化物和酯类化合物发生 反应后，能量传递至荧光染料，再由染 料发出荧光。
如 -OH、-OR、 -NH2、-CN、-NR2等；
吸电子基降低荧光，如 -COOH、 -
C=O、 -NO2、-NO、-X等；
取代基之间若发生氢键，增强分子平面性和 刚性会加强荧光:
COOH COOH
水杨酸
O C OH OH
OH
OH
无荧光 有荧光 有荧光
重原子降低荧光但增强磷光， 如苯环被卤素取代，从氟苯到碘苯，荧光逐渐减弱 到消失，该现象也称重原子效应。
转换”。（“内转换”过程同样也发生在三线
激发态的电子能级间）
3.荧光发射：当激发态的分子通过振动驰豫—内转移— 振动驰豫到达第一单线激发态的最低振动能级时，第 一单线激发态最低振动能级的电子可通过发射辐射 （光子）跃回到基态的不同振动能级，此过程称 为 “荧光发射”。如果荧光几率较高，则发射过程较 快，需10-9 ～10-7秒。（它代表荧光的寿命） 4.磷光发射：第一电子三线激发态最低振动能级(亚稳态) 的分子以发射辐射（光子）的形式回到基态的不同振 动能级，此过程称为 “磷光发射”。 荧光和磷光的根本区别: 荧光是由单重跃迁-单重引起的， 磷光则由三重跃迁-单重产生的。
分子去活化过程及荧光的发生
1. 振动弛豫：在溶液中，处于激发态的溶质分子与溶剂
分子间发生碰撞，把一部分能量以热的形式迅速传递
给溶剂分子（环境），在10-11～10-13 秒时间回到同 一电子激发态的最低振动能级，这一过程称为振动弛 豫。
2. 内转移：当激发态S2的较低振动能级与S1的较 高振动能级的能量相当或重叠时，分子有可能 从S2的振动能级以无辐射方式过渡到S1的能量 相等的振动能级上，这一无辐射过程称为“内
共轭度越大，荧光越强。
共轭结构与荧光的关系
lex=205nm lem=278nm F=0.11
lex=286nm lem=321nm F=0.29
lex=356nm lem=404nm F=0.36
共轭结构与荧光的关系
分子结构与荧光
3）刚性结构和共平面性：
分子刚性（ Rigidity ）越强，分子振动少， 与其它分子碰撞失活的机率下降，荧光量子效率 提高。 如荧光素（ 大）与酚酞（=0）
单色器
I0 液 槽 I 单色器

。
检测器
荧光分光光度计的结构示意图 单色器：选择激发光波长的第一单色器和选择发射光 (测量)波 长的第二单色器。 光源：高压汞灯、氙灯 检测器：光电倍增管
• 激发光源 要求发射强度大,波长范围宽,而且在整个 波长范围内强度一致.常用高压汞灯和氙弧 灯. • 滤光片和分光器 干涉滤光片;分光器多采用光栅 • 样品室 样品室由样品池及样品转换器组成.其中 样品池用石英或低荧光的玻璃材料.
• 用绿色荧光蛋白标记的细胞
• 用这种能自己发光的荧光分子来作为生 物体(细胞、细胞器)的标记。 • 将这种荧光分子通过化学方法挂在其他 不可见的分子上，原来不可见的部分就 变得可见了。
荧光染料
• 能发出荧光的染料。在吸收可见光和紫 外光后，能把紫外光转变为波长较长的 可见光波而反射出来，呈闪亮的鲜艳色 彩。 • 用于增白洗衣粉中的增白剂， • 指示信号用的各种荧光路标漆， • 荧光标志服等。
↑，荧光强度↑，测定灵敏度↑。荧光法绝对灵 敏 度 实 际 定 义 为 φ ε /H （ H 发 射 光 谱 半 峰 宽 度 μ m-1 ） 。
• •
发射单色器
用于选择投射到检测器的荧光波长。
检测器
荧光或磷光的强度较弱，要求检测器灵敏度高。 精密的荧光光度计采用光电倍增管为检测器，将转入 的光信号转变为电信号，并将其放大，由记录器记录 荧光强度。
6.3.2 荧光分析方法特点及应用
(一)荧光分析方法及特点 1．标准曲线法 用已知的标准物质经过和试样同样的处理后， 配成一系列标液。测定标液的荧光强度，用荧光强 度对标液浓度绘制标准曲线，然后根据试液的荧光 强度，在标准曲线上求出试样中荧光物质的含量。
1.产生并可观察到荧光的条件：
i ）分子具有与辐射频率相应的 荧光结构
（内因）；
ii）吸收特征频率的光后，应可产生具一定 量子效率的荧光。 即量子效率 F足够大：
发射的荧光量子数 F 吸收的光量子数
2.分子结构与荧光的关系
1）跃迁类型：
通常，具有 —* 及 n—* 跃迁结构的分子 才会产生荧光。而且具 —* 跃迁的荧光效率比 n—*跃迁的要大得多。 2）共轭效应：
电子处于激发态是不稳定状态，返回基态时，通过辐射 跃迁(发光)和无辐射跃迁等方式失去能量。 传递途径 辐射跃迁 无辐射跃迁
荧光
延迟荧光
磷光
系间窜跃 内转移
外转移
振动弛豫
激发态停留时间短、返回速度快的途径，发生的几率大，发 光强度相对大。 荧光：时间较短,第一激发单重态的最低振动能级→基态。 磷光：自旋禁阻，时间较长，第一激发三重态的最低振动能级 →基态。
苯胺
+ OH NH4 +
H
NH2
pH7~12
OHH
+
NHpH >13
pH < 2
苯胺在pH7-12溶液中会发生蓝色荧光，在pH小于2或大于13的溶 液中都不发生荧光。
影响荧光的外界因素
（四）内滤光和自吸： 体系内存在可以吸收荧光的物质，或荧光物 质的荧光短波长与激发光长波长有重叠，均可使 荧光强度下降，称为内滤光；当荧光物质浓度较 大时，可吸收自身的荧光发射称为荧光自吸。
影响荧光的外界因素
（五）荧光猝灭：
碰撞猝灭； 静态猝灭； 转入三重态的猝灭； 电子转移猝灭；
自猝灭。
例：猝灭剂（quencher）的影响
荧光猝灭：是指荧光物质分子与溶剂或其它溶质 分子相互作用，引起荧光强度降低、消失或荧光强 度与浓度不呈现线性关系的现象。 引起荧光猝灭的物质，称为猝灭剂，如卤素 离子、重金属离子、氧分子、硝基化合物、重氮化 合物、羰基化合物等吸电子极性物质。 荧光猝灭法: 有些猝灭剂的加入，其荧光强度的减 少与荧光猝灭剂的浓度呈线性关系，可用于测定 猝灭剂的含量，这种方法称为荧光猝灭法。
图6－8 蒽在乙醇溶液中的镜像光谱
3.荧光光谱的特点： ①斯托克斯位移（Stokes shift)。与激发光谱相比，
荧光光谱的波长总是出现在更长的波长处；
②荧光光谱与激发波长无关。无论用λ=250和350nm
作激发光源，所得荧光光谱形状和峰的位置都是相同；
③吸收光谱与发射光谱大致成镜像对称。
6.2.4 荧光量子产率与分子结构
第6章.荧光分光光度法
6.1 6.2 6.3 6.4 概述 方法原理 荧光分析法 荧光分光光度法在生物工程分析中的应用
6.1 概述
荧光蛋白质
• 在2008年10月8日，诺贝尔奖委员会将化学奖 授予日本化学家下村修（Osamu Shimomura） 、美国科学家马丁•沙尔菲（Martin Chalfie ）和美籍华裔科学家钱永健（Roger Y. Tsien）三人，以表彰他们“发现和发展了绿 色荧光蛋白质（Green Fluorescent Protein, GFP）”技术。
荧光增白剂
• 它的特性是能激发入射光线产生荧光， 使所染物质获得类似荧石的闪闪发光的 效应，使肉眼看到的物质很白，达到增 白的效果。 • 其作用是把制品吸收的不可见的紫外线 辐射转变成紫蓝色的荧光辐射，与原有 的黄光辐射互为补色成为白光，提高产 品在日光下的白度。
6.2 方法原理
6.2.1荧光（磷光）产生机理
（3） 刚性平面结构
-O O -O O C O
C
COO-
COO-
酚酞(无荧光)
荧光素
O
N Mg N O
N O-
8－羟基喹啉(弱荧光)
红色荧光
联二苯 φ= 0.2
芴 φ= 1.0 C H 2
( 强荧光物质)
3,4-苯并芘
刚性结构和共平面性与荧光的关系
OH N
8 — 羟基喹啉
O N Mg1/2
8 — 羟基喹啉镁
6.3荧光分析法
一．荧光分析的定量基础 荧光强度与溶液浓度的关系 F=F I0 Cb
F — 荧光效率
— 荧光物质的摩尔吸光系数 I0 — 激发光强度
I0
I
F
b — 液层厚度
溶液的荧光
F = KC （该式只有当 Cb≤ 0.05时才 成立）
2. 荧光分光光度计
2. 荧光分光光度计
光源 放大和指示仪表
刚性结构和共平面性与荧光的关系
刚性结构和共平面性与荧光的关系
H3C
SO3Na CH3 N CH3
7 - 二甲胺萘 – 1 - 磺酸盐 F =0.75
CH3 N
SO3Na
8 - 二甲胺萘 – 1 - 磺酸盐 F 结构与荧光
4）取代效应：
给电子取代基增强荧光（p-共轭），
2．荧光分析法的灵敏度 比吸光法高得多，更适合于低浓度物质的分子。 这两种方法在灵敏度方面的差别主要是由于同浓度相 关的参数的测量方式不同。