(完整)高效液相色谱仪的结构
HPLC仪器图
3/8/2019
梯度洗脱（gradient)
梯度洗脱（溶剂程序）：在同一个分析周期内按 一定的程序改变流动相的组成,从而改变流动相 极性、离子强度、pH，来调整组分的k值，改变 分离因子α值，以达到最短时间内得到最佳分离 的目的。 ●梯度洗脱的特点 ●梯度洗脱的主要条件 ●梯度洗脱的基本原理
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3．操作条件差别 GC： 加温操作 HPLC：室温；高压（液体粘度大，峰展宽小） 3/8/2019
第三节 高效液相色谱仪
高效液相色谱仪的结构示意图：一般可分为五个主要 部分：高压输液系统，进样系统，分离系统, 检测系统和数据处理及控制系统。此外还配有 辅助装置：如梯度淋洗，自动进样及数据处理等。
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I kmb lg I b lg m lg k
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五
•五.数据记录系统和控制系统
色谱工作站 计算机：控制显示
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色谱工作站（计算机 ）：控制显示
流动相 供给和 输送
进样
分离
检测
记录、 数据处 理
温度控 制
收集
◆
流路系统（分析单元）：高、低压流路
◆ 3/8/2019 电路系统（控制单元）：信号传输与处理
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工作原理
当复合光透过流通池后,被组分吸收,其透过光具有 了组分的光谱吸收特征.此透过光被光栅分光后,形 成组分的吸收光谱,照到光电二极管阵列装置上,使 每个纳米光波的光强转化为相应的电信号,给出组分 的吸收光谱. 本检测器可以同时获得样品的色谱图(C-t)及每个色 谱峰的吸收光谱(A-入),得到三维光谱-色谱图,可以 同时得到定性和定量及色谱峰是否单一组分的信息 .
(一)高效液相色谱仪(二极管阵列检测器 荧光检测器 双
（一）高效液相色谱仪(二极管阵列检测器+荧光检测器+双泵柱后衍生）一、配置清单：1.液相色谱主机（主机包括：梯度系统，自动进样器，1台在线柱塞清洗装置，在线脱气机，柱温箱）2.荧光检测器1台3.二极管阵列检测器1台4.柱后衍生系统1套5.正版软件1套（工作站、操作系统、驱动等），全中文色谱1套管理系统，包括：64位色谱管理软件6.Oracle关系型图文数据库。
1套7.2ml样品瓶及瓶盖。
200个8.通用色谱柱接头。
2个9.原装C18色谱柱（5um 4.6×150mm；）1根10.1L溶剂瓶。
5个11.国产品牌电脑，含品牌打印机。
1套二、技术参数：1.四元梯度泵★1.1 工作模式：相互独立、电子控制的双柱塞直线驱动装置，双压力传感器反馈回路1.2 溶剂数量：四元1.3 流速范围：0.001～10.000mL/min，以0.001递增1.4 流速精确度：≦0.075%RSD（小数点后三位数字）1.5 流速准确度：±0.5%1.6 延迟体积：<650µL（包括进样器扩散体积），并且不随反压变化1.7 混合范围：0.0—100.0% 以0.1% 增量1.8 最大耐受压力：≧5000psi1.9 梯度准确度：± 0.5%，不随反压变化★1.10 梯度精度：≦0.15%RSD ，不随反压变化1.11 具有操作面板，可以独立设定工作参数、显示运行状态（必须提供彩页或官方文件证明）2.自动进样器★2.1 样品瓶数：≧115位（必须提供彩页或官方文件证明）2.2 进样范围：0.1—100uL2.3 进样次数：每个样品1—99次进样2.4 进样精度：≦0.25%RSD2.5 进样范围：0.1—100µL2.6 进样线性度：>0.999进样针清洗：针内外每次进样后通过专用流路自动清洗3.荧光检测器3.1 灯：150W 氙灯，连续弧光，3.2 灵敏度：水的拉曼光谱≥10003.3 激发波长：200～890nm3.4 发射波长：210～900nm3.5 波长重现性：±0.25nm3.6 波长准确度：±3nm3.7 流通池：< 13ul3.8 采样频率：80Hz3.9 流通池耐压：145psi3.10 需提供至少5次进样保留时间和峰面积重现性色谱图。
2.高效液相色谱仪和固定相、流动相
光电二极管阵列检测器
3. 差示折光检测器（differential refractive index detector） 除紫外检测器之外应用最多的检测器；
可连续检测参比池和样品池中溶液的折光 指数差值。差值与浓度呈正比；
特点：
通用型检测器 ; 灵敏度低（10-7g.mL-1），不能用于痕量分 析; 对温度敏感，要求使用温度恒定; 对流动相流量变化敏感，不能用于梯度洗脱。
六、液相色谱法流动相
1. 流动相特性 2. （1）流动相的种类、配比可显著改变组
分分离状况； 3. （2）亲水性固定液常采用疏水性流动相
， 称为正相液液色谱法; 4. （3）流动相的极性大于固定液的极性，
则称为反相液液色谱 。
组分在两种类型分离柱上的出峰顺序相反。
2. 流动相类别 按流动相组成分：单组分和多组分； 按极性分：极性、弱极性、非极性； 按使用方式分：固定组成淋洗和梯度淋洗
外梯度: 两台高压泵， 将两种不同极性的溶剂 按一定的比例送入梯度 混合室，混合后进入色 谱柱。
内梯度: 一台高压泵, 通过比例调节阀,将两 种或多种不同极性的溶 剂按一定的比例抽入高 压泵中混合。
讨论1
用ODS柱分析一有机弱酸混合物样品， 以某一比例甲醇-水为流动相时，样品容 量因子较小，若想使容量因子增加，较 好的办法是 A 增加流动相中甲醇的比例 B增加流动相中水的比例 C流动相中加入少量HAc D流动相中加入少量的氨水
高压泵按其性质可分为恒压泵、恒流泵两类
1）往复式柱塞泵： 恒流 泵； 易于更换溶剂，适用于梯 度洗脱但有脉冲波动，可 以加一阻尼器抑制脉冲。
2）气动放大泵： 恒压泵 液缸体积大，更换流动相 不方便，不便于梯度洗脱， 无脉冲、稳定流量的输出, 现多用于装柱。
图1高效液相色谱仪的系统流程图原理
液相色谱- 质谱连用技术受到普遍重视, 如分析氨基甲酸酯 农药和多核芳烃等; 液相色谱- 红外光谱连用也发展很快,如在环 境污染分析测定水中的烃类, 海水中的不挥发烃类, 使环境污染 分析得到新的发展。
高效液相色谱仪的应用
高效液相色谱法只要求样品能制成溶液, 不受样品挥发性的 限制,流动相可选择的范围宽,固定相的种类繁多,因而可以分离 热不稳定和非挥发性的、离解的和非离解的以及各种分子量范 围的物质。
与试样预处理技术相配合,HPLC 所达到的高分辨率和高灵 敏度, 使分离和同时测定性质上十分相近的物质成为可能,能够 分离复杂相体中的微量成分。随着固定相的发展, 有可能在充分 保持生化物质活性的条件下完成其分离。
（2）高压输液泵容易出现的问题是：①压力升不上去：检查一下桌面上是否 有漏下的液滴，如果有拧紧漏液处即可。②压力过高：看一下抽取流动相的 塑料管里是否有气泡，如果有，则按一下Stop，这时候千万别抽气泡，等压 力降下来，最好到0Psi，这时候抽出气泡。如果在过高的压力下抽气泡，后 果会非常严重，流通池会被鼓破，无法分析样品，并且会给你带来很多困 惑，当然如果有经验的话会及时发现，因为流通池破了后会流出蓝色的墨水 样的液体。
高速——流速为0.1～10.0 mL/min。 高效——塔板数可达5000/米。在一根柱中同时分离成份可达 100种。 高灵敏度——紫外检测器灵敏度可达0.01ng。同时消耗样品 少。 HPLC与经典液相色谱相比有以下优点：
速度快——通常分析一个样品在15～30 min，有些样品甚至在 5 min内即可完成。
液相色谱仪的结构及组成(施超欧2005)
2 自动（电动、气动）—其阀同手动基本一致。特点是 可自动连续进样、可自动调节进样量、进样重复性好、 适合大批量样品的分析，而且还可以稀释、添加标准、 重复进样、衍生等。
手动进样阀
取样时，流动相直接进柱，进样口与定量管连接，样 品充满定量管后，多余样品从6流出。
Si—硅胶柱，典型的正相柱，适合非极性化合物的分 离，流动相多为非极性的溶剂。
SAX—强碱性阴离子交换柱，硅胶基质，pH在3-7.5， 用于阴离子化合物的分离，如苯(萘)磺酸类、羧酸类。
SCX—强酸性阴离子交换柱，硅胶基质，用于阳离子 化合物的分离，如嘌呤、嘧啶类。
WAX—弱碱性阴离子交换柱，硅胶基质，用于特定的 化合物或生化分析。
3 如果采用比例阀切换流动相、流动相为低压混合，一 般需在线脱气才能运行（有多种方式）。最常见的为 四元比例阀。
单泵、双泵采用高压混合，不易产生气泡。精度比 比例阀高，因此目前也有四元高压混合的泵，如SSI、 Dionex，可以以二元、四元的方式组合。
多元泵（流路）用于组合研究的高档色谱仪。
4 HPLC一般运行的压力在几十到几百大气压；压力越 低对泵和色谱柱有利。低压色谱一般用于生化分析。
液相色谱的溶剂输送系统
色 谱 泵
恒 压 泵
恒 流 泵
气 动 放 大 泵 注 射 泵 单 柱 塞 泵 双 柱 塞 泵 隔 膜 泵
并 联 泵 串 联 泵
不同梯度对系统体积的影响
低 压 梯
B AC
D
度 比例阀
溶剂输送 系统(泵)
阻尼器 混合器
进样器
色谱柱
检测器
滞后(系统)体积
注意∶滞后体积包括进样器、阻尼 器、混合器及其管路
第五章高效液相色谱法
9
基本理论
热力学理论：塔板理论——平衡理论 热力学理论：塔板理论——平衡理论 动力学理论：速率理论—— 范第姆特 动力学理论：速率理论 ——范第姆特 方程 色谱图的基本参数：与气相色谱法类 似
10
各类高效液相色谱法的分离原理及选 择
液-固吸附色谱 液-液分配色谱 离子交换色谱 体积排阻色谱 亲和色谱
3
高效液相色谱法的类型
根据固定相的不同 液-固色谱 液-液色谱 根据分离机理的不同 分配色谱 吸附色谱 离子交换色谱 体积排阻色谱 亲和色谱
4
分配色谱：分离组分在两相中的分配系数不 同 吸附色谱：固定相对分离组分的吸附能力不 同 离子交换色谱：不同离子与固定相上的相反 电荷离子间作用力大小不同 体积排阻色谱：根据样品分子尺寸的不同按 分子大小分开 亲和色谱：不同基体上键合多种不同特性的 配位体作固定相，用具有不同pH的缓冲溶液 做流动相，依据生物分子与基体上键联的配 位体之间存在的特异性亲和作用力不同
30
流动相
1. 流动相特性
(1)液相色谱的流动相又称为：淋洗液，洗脱剂 液相色谱的流动相又称为：淋洗液， 液相色谱的流动相又称为 。流动相组成改变，极性改变，可显著改变组分 流动相组成改变，极性改变， 分离状况； 分离状况； (2)亲水性固定液常采用疏水性流动相 ， 即流 亲水性固定液常采用疏水性流动相， 亲水性固定液常采用疏水性流动相 动相的极性小于固定相的极性， 动相的极性小于固定相的极性，称为正相液液色 谱法，极性柱也称正相柱。 谱法，极性柱也称正相柱。 (3)若流动相的极性大于固定液的极性 ， 则称 若流动相的极性大于固定液的极性， 若流动相的极性大于固定液的极性 为反相液液色谱，非极性柱也称为反相柱。 为反相液液色谱，非极性柱也称为反相柱。组分 31 在两种类型分离柱上的出峰顺序相反。 在两种类型分离柱上的出峰顺序相反。
高效液相色谱分析法(仪器+组成+分离类型+流动相选择)
2、主 要 部 件
(1) 高压输液泵
主要部件之一，压力：30MPa以上。 为了获得高柱效而使用粒度很小的固定相（ <10μm），液体的流动相高速通过时，将产生 很高的压力，因此高压、高速是高效液相色谱 的特点之一。 应具有压力平稳、脉冲小、 流量稳定可调、耐腐蚀等特性
(2)梯度淋洗装置
3.离子交换色谱分离固定相
结构类别： （1）薄壳型离子交换树脂
薄壳玻璃珠为担体，表 面涂约1%的离子交换树脂； （2）离子交换键合固定相
薄壳键合型；微粒硅胶 键合型（键合离子交换基团）
树脂类别： （1） 阳离子交换树脂（强酸 性、弱酸性） （2） 阴离子交换树脂（强碱 性、弱碱性）
4. 空间排阻分离固定相
liquid-solid adsorption chromatography 固定相：固体吸附剂如硅胶、氧化铝等，较
常使用的是5～10μm的硅胶吸附剂；
流动相：各种不同极性的一元或多元溶剂。 基本原理：利用溶质分子占据固定相表面吸 附活性中心能力的差异；适用于分离相对分子 质量中等的油溶性试样，对具有官能团的化合 物和异构体有较高选择性； 缺点：非线形等温吸附常引起峰的拖尾；
GC：H = A + B / u + C • u （填充柱）
A = 2λ • dp
A ∝ λ • dp
B = 2γ • Dm = 2γ • Dg B ∝ t R ，B ∝ Dg
Dg
∝
T η
或Dg
∝
T M
B = 2γ • Dm
Dm
∝
T η
柱温T ↓低，流动相η ↑大 ⇒B相忽略
在高效液相色谱中, 液体的扩散系数
(4) 高效分离柱
高效液相、气相色谱法及红外色谱仪的简单介绍
高效液相色谱法
二、高效液相色谱法的特点
特点：高压、高效、高速
Feature of HPLC
高沸点、热不稳定有机及生化试样的高效分离分析方法。
概述
• 高效液相色谱法（HPLC）是60年代末以经典液相色谱法 为基础，引入了气相色谱的理论与实验方法，流动相用高 压泵输送，采用高效固定相和在线检测等手段发展而成的 分离分析方法 。 • 与气相色谱法相比具有：适用范围广，样品预处理简单， 分离效率高，流动相选择范围广，检测方法多为非破坏性 的，流出组分可回收等优点。
研究范围
• 近红外区：主要研究稀土和过渡金属离子的化合物， 水，含氢原子团化合物的定量分析。 • 中红外光区（又称红外光谱区）：绝大多数有机化 合物和无机离子的基频吸收带都出现在该区，由于 基频振动是最强的吸收，适宜进行定性、定量分析。 • 远红外光谱区：由于低频骨架振动能很灵敏地反应 出结构变化，所以对异构体的研究特别方便，还可 用于金属有机化合物的、氢键、吸附现象的研究， 但由于该光区弱，一般不在此范围内进行分析。
2.主要部件
（1）高压输液泵
主 要 部 件 之 一 ， 压 力 ： 150～350×105 Pa。 为了获得高柱效而使用粒 度很小的固定相（ <10 μm）
，液体的流动相高速通过时， 将产生很高的压力，因此高 压、高速是高效液相色谱的 特点之一。 应具有压力平稳、脉冲小、 流量稳定可调、耐腐蚀等特 性。
三种重要仪器的原理及使用 方法
气相色谱法 高效液相色谱法
红外吸收光谱法
目录
1 2 3
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
气相色谱法
气相色谱仪 气相色谱检测器
4
气相色谱的应用
定义
以惰性气体为流动相、以固定液或固 体吸附剂作为固定相的色谱法称为气 相色谱法（GC）。
高效液相色谱仪的基本结构
高效液相色谱仪的基本结构
高效液相色谱仪（High Performance Liquid Chromatography，HPLC）的基本结构包括以下
几个主要组成部分：
1. 色谱柱：色谱柱是HPLC中最重要的部分，用来分离混合物中的化合物。
色谱柱通常是由一种填充材料（常为固体颗粒）填充在特定长度的金属或玻璃管中形成的。
填充材料可以为疏水性、亲水性、离子交换等，根据需要选择。
2. 注射器：注射器用于将待测样品溶液注入色谱柱，通常为一个可调节容积的活塞机构。
3. 泵系统：泵系统用来提供稳定的流动相（溶剂）流动，将待测物溶液从注射器推入色谱柱。
4. 检测器：检测器用于检测待测物质离子或分子的信号，常见的检测器有紫外-可见光谱检测器、荧光检测器、电化学检测器等。
5. 计算机与数据处理系统：计算机与数据处理系统用于采集、存储和分析检测器所得到的数据，并进行数据处理和结果计算。
6. 控制模块：控制模块用于控制其他各部分的运行，如泵的流速控制、注射器的操作等。
7. 进样器：进样器用于将待测样品从样品瓶中自动或手动进样到注射器中。
8. 恒温装置：恒温装置用于保持色谱柱和溶剂的温度恒定，以确保分析结果的稳定性。
9. 分离柱：分离柱是一种将待测物物质快速分离开的设备。
高效液相色谱法介绍(一)
使用单一溶剂，往往不能达到很好的分离效果，往往使用混合溶剂通常使用 一个高极性和低级性溶剂组成的混合溶剂，高极性的溶剂还有增加区分度的 作用，常用的溶剂组合 洗脱剂：一般常用溶剂按照极性从小到大的顺序排列大概为： 石油迷<己烷<苯<乙醚<THF（次氢呋喃）<乙酸乙酯<丙酮<乙醇<甲醇 极性小的用乙酸乙酯：石油醚系统 极性较大的用甲醇：氯仿系统 极性大的用甲醇：水：正丁醇：醋酸系统 拖尾可以加入少量氨水或冰醋酸
七、常见故障的排除
故 泵启动不良
障
故 障 原 因 （1）溶剂水平面太低 （2）溶剂中有气泡析出 （1）色谱柱超负荷 （2）非缓冲流动相使酸性 或碱性样品的色谱峰 发生拖尾 （1）柱子超负荷 （2）样品组分在柱子上积 聚，柱子沾污柱效变 坏 （3）柱填料与流动相未完 全达到平衡 （1）柱子被玷污，柱效下 降 （2）固定相流失 （3）梯度系统对色谱柱 （固定相）不合适. （4）柱温过高 （5）流动相强度太高
峰形不好，出现平头峰或拖 尾峰
分离度下降
保留时间减少
故
障
故 障 原 因 （1）温度不稳 （2）泵启动不良 （3）溶剂中有气泡 （1）长时间的基线漂移可 能由于室温波动引起 （2）池座垫圈漏液 （3）流通池污染 （4）UV灯不亮 （1）样品阀，进样垫或注 射器被污染 （2）溶解样品溶剂的洗脱 峰 （3）样品溶液中有气泡 （4）梯度洗脱溶剂不纯 （特别是水） （1）电源线内部折断 （2）灯启动器有毛病 （3）UV灯泡有毛病 （4）保险丝断开
a.光源（氘灯）发出的光经聚光透镜聚焦，由可旋转组合滤光片滤 除杂散光，再通过入口狭缝至下面反射镜，经反射到达光栅，光 栅将光衍射色散成不同波长的单色光，当某一波（190nm~600nm） 的单色光经平面镜反射，反射至分束器时，透过光分束器的光通 过样品的流通池，最终到达检测样品的光电二极管测量；被光分 束器反射的光到达检测基线波动的参比光电二级管；当获得测量 和参比光电二极管的信号差，即为样品的检测信息。 b.可变波长紫外吸收检测器的某一时刻只能采集某一特定波长的 吸收信号。 光栅的偏转可由预先编制的采集信号程序加以控制，以便于采 集某一特定波长的吸收信号，并可使色谱分离过程洗脱出的每 个组分峰都获得最灵敏的检测。
液相色谱仪结构及原理
液相色谱仪结构及原理高效液相色谱法是在经典色谱法的基础上，引用了气相色谱的理论，在技术上，流动相改为高压输送（最高输送压力可达 4.9´107Pa）;色谱柱是以特殊的方法用小粒径的填料填充而成，从而使柱效大大高于经典液相色谱（每米塔板数可达几万或几十万）；同时柱后连有高灵敏度的检测器，可对流出物进行连续检测。
一、特点：1．高压：液相色谱法以液体为流动相（称为载液），液体流经色谱柱，受到阻力较大，为了迅速地通过色谱柱，必须对载液施加高压。
一般可达150～350×105Pa。
2. 高速：流动相在柱内的流速较经典色谱快得多，一般可达1～10ml/min。
高效液相色谱法所需的分析时间较之经典液相色谱法少得多，一般少于1h 。
3. 高效：近来研究出许多新型固定相，使分离效率大大提高。
4.高灵敏度：高效液相色谱已广泛采用高灵敏度的检测器，进一步提高了分析的灵敏度。
如荧光检测器灵敏度可达10-11g。
另外，用样量小，一般几个微升。
5.适应范围宽：气相色谱法与高效液相色谱法的比较：气相色谱法虽具有分离能力好，灵敏度高，分析速度快，操作方便等优点，但是受技术条件的限制，沸点太高的物质或热稳定性差的物质都难于应用气相色谱法进行分析。
而高效液相色谱法，只要求试样能制成溶液，而不需要气化，因此不受试样挥发性的限制。
对于高沸点、热稳定性差、相对分子量大（大于400 以上）的有机物（这些物质几乎占有机物总数的75% ～80% ）原则上都可应用高效液相色谱法来进行分离、分析。
据统计，在已知化合物中，能用气相色谱分析的约占20%，而能用液相色谱分析的约占70～80%。
二、性质及原理：高效液相色谱按其固定相的性质可分为高效凝胶色谱、疏水性高效液相色谱、反相高效液相色谱、高效离子交换液相色谱、高效亲和液相色谱以及高效聚焦液相色谱等类型。
用不同类型的高效液相色谱分离或分析各种化合物的原理基本上与相对应的普通液相层析的原理相似。
(完整版)Agilent1260液相色谱系统操作规程
在柱温箱上手动输入规定的温度即可。
6.3.2.5紫外检测器（VWD G1314F）参数设定
在“波长”下方的空白处输入所需的检测波长,如254nm, 在“峰宽 (响应时间)”下方点击下拉式箭头,选择合适的响应时间, 如>0.1min (2s)。 在“时间表” 中可以“插入”一行，输入随时间切换的波长，如1min ，波长=300nm。点击“确定”，进入下一参数设定。
6.3.1.6右键点击四元泵下面的空白处，选择“方法”选项，进入泵编辑画面，设置使用的流动相比例和流速或选择已有方法开始系统平衡。
6.3.1.7点击四元泵下面的瓶图标，输入溶剂的实际体积和瓶体积。 也可输入停泵的体积，点击“确定”。
6.3.2方法编辑
若已创建方法，可在“方法”菜单选择“调用方法”，选择相应的方法。若无，需按下面步骤建立：
手动进样针：取样前应用试样润洗3次以上，使用后应用甲醇/乙腈清洗3次以上。
废液处理：及时清理废液瓶，以防废液溢出。
6.8仪器安全保障
6.8.1每天使用仪器之前，要打开Purge阀将各个通道冲洗4～5min左右；
6.8.2及时更换Purge Valve内的过滤芯(当打开Purge Valve，流速为5ml/min压力高于10bar时)。Purge阀在关闭状态时，不宜过紧。
从专用包装盒内取出色谱柱，松动并取下色谱柱出入口的止动塞；
将与进样器相连的管线一端插入色谱柱入口端，拧紧螺帽；
(注意:安装时色谱柱上的流向标志应与管路的流动相流向一致。)
将与检测器相连的管线一端插入色谱柱出口端，拧紧螺帽。
6.2开机
6.2.1通电前应检查仪器设备之间的电源线、数据线和输液管道是否连接正常。
6.3.5打印报告
大学 师范类 化学专业 仪器分析学科 第三章高效液相色谱法
阳离子交换
- + M++ RSO3 H
H+ + RSO3 M+
-
阴离子交换
Cl X RNR+ + 3
阳离子交换树脂
RNR3 X + Cl-
+
-
3、流动相
水相缓冲液+有机溶剂
调节选择性的 主要参数
盐种类及浓度 pH值
各种阴离子的在阴离子交换剂上的滞留次序：
2 2 2 柠檬酸离子 SO4 C 2O4 I NO3 CrO4 Br
( BH+ RSO3 )m ( BH+ RSO3 ) s
离子对
+ + 通式 B+ + A ( ) ( B B A A )s m 疏水性离子对不易在水中离解而迅速进入有机相中， 存在下述萃取平衡：
X+水相+ Y-水相
[B A ]s [ B A ]s KB A [B ]m [B ]m [A ] m
故要减小He，提高柱效，应采用小颗粒固定 相并填充均匀。
HPLC
2、分子扩散相Hd（纵向扩散项）
cd Dm Hd u
cd ：常数
Dm ：分子在流动相中的扩散系数
u :
流动相流速
Dm 一般很小，当u较大时，Hd很小，Hd可忽略
HPLC
3、传质阻力项
HPLC
（1） 固定相传质阻力项
Hs Cs d f Ds u
硅烷化反应
硅胶
十八烷基 氯硅烷
ODS(C18)键合相 非极性
键合固定相类 型 疏水基团 烷烃（C8和C18）、苯基等 极性基团 丙氨基 氰乙基 醚和醇等
《仪器分析》4-高效液相色谱法
(4) 示差折光检测器： 是一种中等灵敏度(10–6 g/mL)的通用型检测器。
是利用纯流动相和含有待测组分的流动相之间折射率的 差别进行检测的。
可分为三类：反射式；折射式（偏振式）和干涉式。常 用前两种。
优点：灵敏度适宜，操作简便是一种通用型的检测器； 缺点：对温度变化敏感，不能用于梯度洗脱。 应用范围：聚合物、糖。还用于分析以紫外检测和荧光
精选课件
药典中的液相色谱检测器
精选课件
常用的检测器:
(1) 紫外光度检测器：是一种选择性浓度检测器，仅 对那些在紫外波长有吸收的物质有响应。
作用原理：基于待测试样对特定波长的紫外光有选择 性的吸收，试样浓度与吸光度的关系服从比尔定律。
结构：
1－低压汞灯 2－透镜 3－遮光板 4－测量池 5－参比池 6－紫外滤光片 7－双紫外光敏电阻
精选课件
⑶ 色谱柱 GC柱很长，特别是毛细管柱可长至几十米至上百米，柱效
很高(理论塔板数N = 104~106)。HPLC柱较短，一般为15~25 cm，柱效(理论塔板数N = 103~104)，低于GC柱。 ⑷ 检测器
与GC相比，HPLC检测器种类较多。 ⑸ 制备色谱
GC难以制备样品，因为进样量小，难以收集或被破坏。 HPLC可进行制备，即制备色谱。
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2. 进样系统
在高效液相色谱中，常用的进样方式： 高压阀进样：优点是能用于高压，适于大体积进样，重现性
好；缺点是进样阀进样时需排掉一部分试样，不同的进样 量需用不同的定量管，同时峰的扩展也比注射进样大。 微量注射器进样：也可由微量注射器注入取样环少量样品， 即采用较大体积取样环而进少量试样，进样量由注射器控 制，试样不充满取样环，只填充一部分体积。
高效液相色谱仪的测定原理
一． 实验目的：
1． 学习高效液相色谱法的测定原理；
2． 了解并掌握高效液相色谱仪（HP1100） 的基本构造。
二． 实验原理：
高效液相色谱法是重要的色谱方法，是在经典 液相色谱法和气相色谱的基础上发展起来的，（经 典液相色谱法使用粗粒多孔固定相，装填在大口径、 长玻璃管柱内，流动相仅靠重力流经色谱柱，溶质 在固定相的传质、扩散速度极其缓慢，柱入口压力 低，仅有低的柱效，分析时间长；气相色谱原理类 似，流动相为气体，只能分离小分子量、低沸点的 有机化合物，配合程序升温可分析高沸点的有机化 合物。）弥补了经典液相色谱法和气相色谱的缺点。
（如酚类、胺类、羰基类及氨基酸类
等）。
反相色谱法 一般用非极性固定相（如C18、
C8）；流动相为水或缓冲液，常加入甲醇、乙腈、
异丙醇、丙酮、四氢呋喃等与水互溶的有机溶剂以
调节保留时间。适用于分离非极性和极性较弱的化
合物。RPC在现代液相色谱中应用最为广泛，据统
计，它占整个HPLC应用的80%左右。
随着柱填料的快速发展，反相色谱法的应 用范围逐渐扩大，现已应用于某些无机样
品或易解离样品的分析。为控制样品在分
析过程的解离，常用缓冲液控制流动相的 pH值。但需要注意的是，C18和C8使用的 pH值通常为2.5~7.5（2~8），太高的pH值 会使硅胶溶解，太低的pH值会使键合的烷 基脱落。有报告新商品柱可在pH 1.5~10范定相极性 流动相极性 组分洗脱次序
5． 检测器：常用的有紫外检测器 （VWD），光电二极管矩阵检测器（DAD）折光指 数检测器（RID），电导检测器（ECD），荧光检测 器（FD）。
折光指数检测器（RID），电导检测器 （ECD）分别测定柱后流出液的总体折射率和电 导率，测定灵敏度低，易受流量和温度的影响，造 成较大的漂移和噪声，不适合痕量分析。
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四、高效液相色谱仪的结构
高效液相色谱仪由高压输液系统、进样系统、分离系统、检测系统、记录系统等五大部分组成（图3-1-2）。
分析前，选择适当的色谱柱和流动相，开泵，冲洗柱子，待柱子达到平衡而且基线平直后，用微量注射器把样品注入进样口，流动相把试样带入色谱柱进行分离，分离后的组分依次流入检测器的流通池，最后和洗脱液一起排入流出物收集器。
当有样品组分流过流通池时，检测器把组分浓度转变成电信号，经过放大，用记录器记录下来就得到色谱图。
色谱图是定性、定量和评价柱效高低的依据。
图3-1-2 高效液相色谱仪的结构示意图
1.高压输液系统
高压输液系统由溶剂贮存器、高压泵、梯度洗脱装置和压力表等组成。
(1) 溶剂贮存器。
溶剂贮存器一般由玻璃、不锈钢或氟塑料制成，容量为1～2L，用来贮存足够数量、符合要求的流动相。
(2) 高压输液泵。
高压输液泵（图3-1-3）是高效液相色谱仪中关键部件之一，其功能是将溶剂贮存器中的流动相以高压形式连续不断地送入液路系统，使样品在色谱柱中完成分离过程。
由于液相色谱仪所用色谱柱径较细，所填固定相粒度很小，因此，对流动相的阻力较大，为了使流动相能较快地流过色谱柱，就需要高压泵注入流动相。
对泵的要求：输出压力高、流量范围大、流量恒定、无脉动，流量精度和重复性为0.5%左右。
此外，还应耐腐蚀，密封性好。
高压输液泵，按其性质可分为恒压泵和恒流泵两大类。
恒流泵是能给出恒定流量的泵，其流量与流动相粘度和柱渗透无关。
恒压泵是保持输出压力恒定，而流量随外界阻力变化而变化，如果系统阻力不发生变化，恒压泵就能提供恒定的流量。
图3-1-3 恒流柱塞泵
(3) 梯度洗脱装置。
梯度洗脱就是在分离过程中使两种或两种以上不同极性的溶剂按一定程序连续改变它们之间的比例，从而使流动相的强度、极性、pH值或离子强度相应地变化，达到提高分离效果，缩短分析时间的目的。
梯度洗脱装置分为两类：
一类是外梯度装置（又称低压梯度），流动相在常温常压下混合，用高压泵压至柱系统，仅需一台泵即可。
另一类是内梯度装置（又称高压梯度），将两种溶剂分别用泵增压后，按电器部件设置的程序，注入梯度混合室混合，再输至柱系统。
梯度洗脱的实质是通过不断地变化流动相的强度，来调整混合样品中各组分的k值，使所有谱带都以最佳平均k值通过色谱柱。
它在液相色谱中所起的作用相当于气相色谱中的程序升温，所不同的是，在梯度洗脱中溶质k值的变化是通过溶质的极性、pH值和离子强度来实现的，而不是借改变温度（温度程序）来达到。
2.进样系统
进样系统包括进样口、注射器和进样阀等，它的作用是把分析试样有效地送入色谱柱上进行分离。
六通进样阀是最理想的进样器，其结构如图3-1-4。
图3-1-4 六通进样阀装置
3.分离系统
分离系统包括色谱柱、恒温器和连接管等部件。
色谱柱一般用内部抛光的不锈钢制成，如图3-1-5。
其内径为2 ~ 6mm，柱长为10 ~50cm，柱形多为直形，内部充满微粒固定相，柱温一般为室温或接近室温。
图3-1-5 常见色谱柱外形
4.检测器
最常用的检测器为紫外吸收检测器，它的典型结构如图3-1-6。
图3-1-6 紫外检测器光路图
1-低压汞灯2-透镜3-遮光板4-测量池5-参比池6-紫外滤光片7-双紫外光敏电阻检测器是液相色谱仪的关键部件之一。
对检测器的要求是：灵敏度高，重复性好、线性范围宽、死体积小以及对温度和流量的变化不敏感等。
在液相色谱中，有两种类型的检测器，一类是溶质性检测器，它仅对被分离组分的物理或物理化学特性有响应。
属于此类检测器的有紫外、荧光、电化学检测器等；另一类是总体检测器，它对试样和洗脱液总的物理和化学性质响应。
属于此类检测器有示差折光检测器等。