苹果中多酚氧化酶最适-pH-的测定

实验二苹果中多酚氧化酶最适pH 的测定

一、实验原理

存在于果蔬中的多酚氧化酶（polyphenol oxidase,PPO）在适宜的条件下能引起果蔬的酶促褐变。因此，多酚氧化酶对于食品加工具有重要意义。多酚氧化酶是一种含铜离子的酶，它能催化两类不同的反应。一是一元酚羟基化，二是邻-二酚氧化。在一些植物中，多酚氧化酶能同时催化这两类反应；而在另一些植物中，多酚氧化酶仅能催化邻-二酚氧化，却不能催化一元酚羟基化。如果采用邻-二酚作底物，那么随着酶催化反应进行，反应混合物的吸光值因邻-苯醌的量的增加而增大，因此可采用分光光度法测定多酚氧化酶的活力。

二、试剂和仪器

试剂：0.2mol/L醋酸-醋酸钠缓冲液，pH分别为3.6、4.0、4.6、5.0和5.6、0.2mol/L 磷酸盐缓冲液，pH分别为6.0、6.5、7.0、7.5和8.0、0.01mol/L儿茶酚溶液、0.05mol/L 磷酸盐缓冲液，pH=6.5、丙酮

仪器：组织捣碎机、抽滤装置、721分光光度计（含比色皿）、秒表、常规玻璃仪器、离心机

三、实验步骤

1、从苹果中萃取多酚氧化酶

将100 g苹果迅速去梗和核后切成小块，和400mL左右预先冷冻至－26℃的丙酮一起倒入组织捣碎机中均质（20,000 rpm，2 min），然后迅速抽滤，保留滤纸上的沉淀部分，将沉淀薄层中残留的丙酮用冷风吹去，至沉淀无丙酮味。将所得丙酮粉转移至150 mL 0.05mol/L磷酸盐缓冲液（pH 6.5）中，搅拌30 min，然后离心（4℃,10000 r/m,20 min），离心所得上清液如有混浊，则用8层纱布过滤，从而得到多酚氧化酶提取液。

2、不同pH下多酚氧化酶活力的测定

在比色皿中分别加入1.8~1.1 mL pH为3.6的缓冲液和0.7mL儿茶酚溶液，搅匀后加入0.5~1.2mL多酚氧化酶提取液，迅速搅匀，测定反应混合物在400 nm 下的吸光值随时间的变化，参比以缓冲液代替酶液。依次测定4.0、4.6、5.0、5.6、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0几个pH。

四、数据记录与处理

数据记录：

pH值 3.6 4.0 4.6 5.0 5.6 6.0 6.5 7.0 7.5 8.0 加酶量

（mL）

1.0 1.2

10´OD值0.172 0.166

（12s）

0.160 0.150 0.147

（12s）

0.115

（12s）

0.106

（15s）

0.130

（11s）

0.160

（11s）

0.151 20´OD值0.214 0.204 0.210 0.194 0.149 0.115 0.107 0.132 0.162 0.151 30´OD值0.258 0.250 0.258 0.240 0.152 0.115 0.109 0.134 0.163 0.151 40´OD值0.300 0.295 0.302 0.296 0.156 0.117 0.108 0.135 0.165 0.152 50´OD值0.341 0.338 0.348 0.329 0.161 0.117 0.110 0.136 0.166 0.153 60´OD值0.382 0.377 0.392 0.373 0.166 0.118 0.111 0.137 0.170 0.154 70´OD值0.420 0.418 0.433 0.415 0.171 0.121 0.113 0.139 0.173 0.156 80´OD值0.457 0.456 0.475 0.455 0.175 0.123 0.117 0.143 0.175 0.158 90´OD值0.494 0.494 0.514 0.496 0.179 0.126 0.118 0.143 0.178 0.161 100´OD值0.529 0.530 0.554 0.534 0.186 0.127 0.120 0.145 0.182 0.164 110´OD值0.565 0.567 0.591 0.572 0.188 0.130 0.121 0.151 0.184 0.165 120´OD值0.598 0.601 0.626 0.607 0.192 0.133 0.124 0.151 0.188 0.168 用Excel处理数据，得到不同pH下消光-时间曲线的斜率，斜率的物理意义即每分钟增加的消光值，也即酶的活力单位数。

数据处理：

pH值 3.6 4.0 4.6 5.0 5.6 6.0 6.5 7.0 7.5 8.0 加酶量 1.0mL 1.2mL

酶活力0.2328 0.2410 0.2540 0.2498 0.0264 0.0102 0.0102 0.0114 0.0155 0.0098 酶活mL 0.2328 0.2410 0.2540 0.2498 0.022 0.0085 0.0085 0.0095 0.0129 0.0082

用Excel作图得到下图：

由酶活力-pH曲线关系可以得知苹果中的多酚氧化酶在pH=4.6时的酶活力最高，也就是说pH4.6是苹果中多酚氧化酶的最适pH。

五、讨论

1、苹果中存在着多酚氧化酶的天然底物，因此在制备多酚氧化酶提取液的过程中，快速和低温是必要的条件，否则将得到褐色的酶液。

2、丙酮可使酶蛋白沉淀下来，从而与天然底物分离，但是常温下丙酮会导致酶变性，因此必须先冷却至－26℃。事实上，在试验中，丙酮并没有冷却到－26℃，因此匀浆时现取现用。

3、本实验所测酶活较低，可能有两个原因，一是所选的两个苹果有一个是红苹果不是酶活相对高点的青苹果；二是在通风橱里用吹风机吹去丙酮时，所吹的风不是冷风，二是带有温度的热风，导致酶有些许的失活所致。