分离工程复习资料

第一章绪论

1、生物工程学的概念：生物工程学亦称生物技术，是指通过技术手段，利用生物体或生物过程生产有经济价值产品的学科，生物工程是基础科学和应用科学相结合的产物。

生物工程学的研究领域：基因工程、细胞工程、微生物工程、酶工程。

2、生物分离工程的概念：是生物化学工程的一个重要组成部分，指从发酵液、酶反应液或动植物细胞培养液中分离、纯化生物产品的过程，因它处于整个生物产品生产过程的后端，又称为生物工程下游技术。它描述了生物产品分离、纯化过程的原理、方法和设备。

3、生物分离加工过程按工艺流程顺序可分为四个主要阶段：发酵液的预处理、提取、精制和成品加工。

第二章发酵液的预处理

1、发酵液的一般特征有哪些？发酵液预处理的目的和要求有哪些？

（1）组分大部分是水；

（2）产物浓度低；

（3）固形物主要是菌体和蛋白的胶状物；

（4）含有培养基残留成分；

（5）含有代谢副产物；

（6）含有色素、毒性物质、热原质等有机杂质。

（一）发酵液预处理的目的

1）改变发酵液中固体粒子的物理性质，提高固液分离的效率；

2）使产物转入便于后处理的某一相中；

3）去除发酵液中部分杂质，以利于后续各步操作。

总之，改变发酵液的性质，以利于固液分离。

（二）、发酵液预处理的要求

1、菌体的分离(正确控制发酵终点);

2、固体悬浮物的去除；

3、蛋白质的去除；

4、重金属离子的去除；

5、色素、热原质、毒性物质等有机杂质的去除；

6、改变发酵液的性质，以利于提取和精制后续工序的操作顺利进行；

7、调节适宜的pH值。

2、发酵液预处理的方法有哪些？并简述各种方法的原理和特点？

（一）凝聚和絮凝

1、凝聚：在投加的化学物质作用下，胶体脱稳并使粒子相互聚集成1mm大小块状凝聚体的过程。(使胶体粒子间的排斥电位降低而发生沉淀)

2、絮凝：指某些高分子絮凝剂能在悬浮粒子之间产生桥梁作用，使胶粒形成粗大絮凝团的过程。

（二）、加热法

①降低发酵液的粘度；

②去除某些热变性蛋白等物质；

③降低悬浮液的最终体积，破坏凝胶结构，增加滤饼的孔隙度，使固液分离变得十分容易。

关键取决于产品的热稳定性。

（三）、调节悬浮液的pH值

全细胞的聚集作用高度依赖于pH的大小，恰当的pH能够促进聚集作用。

一般用草酸、无机酸或碱来调节pH值。

（四）加水稀释法

主要适用于离心沉降分离发酵液预处理过程。同重量悬浮固体的发酵液，稀释到适当倍数，对后续的离心沉降分离速度非常有利。

（五）、加入助滤剂法

是一种颗粒均匀，质地坚硬，不可压缩的粒状物质，用于扩大过滤表面的适用范围。

使用方法：在滤布上预涂或按一定比例混入悬浮液中。（六）、加吸附剂法或加盐法

加吸附剂法是使细菌细胞吸附在吸附剂上的方法；无机盐在发酵液中形成庞大的絮状物，把发酵液中的悬浮粒子裹住，吸附在其中。

（七）高价无机离子去除法

1、Ca2+的去除常用草酸去除；

2、Mg 2+的去除常用磷酸盐去除；

3、Fe 3+的去除常加入黄血盐，也可加入碱化剂。（八）、可溶性杂蛋白质的去除法

1、等电点沉淀法；

2、热处理法；

3、化学变性沉淀法；

4、吸附法。

（九）色素及其他杂质的去除方法

常用的脱色法有离子交换和活性炭吸附。

3、发酵液过滤的目的是什么？影响发酵液过滤速度的因素有哪些？

目的：一是为了获得含所需产物的细胞（菌丝）或发酵液；二是为了去除发酵液中的固形杂质。

影响因素：（一）菌种，菌种决定了各种悬浮粒子的大小和形状。如真菌较粗大，易过滤，不需做特殊处理，用真空过滤即可；而放线菌较小，且菌丝体细而分枝，过滤困难，需进行预处理。

（二）发酵液的粘度，1、发酵条件，发酵条件包括培养基组成、未用完培养基的量、消沫剂、发酵周

期等。2、放罐时间（发酵终了时间）3、发酵染菌4、发酵液的pH值、温度。

第三章细胞分离技术

1、常用细胞分离方法有哪些？并说明其原理。

一、过滤：指利用多孔性介质截流固体悬浮液中的固体颗粒，进行固液分离的方法。

二、离心沉降：是利用惯性离心力和物质的沉降系数或浮力密度的不同而进行的一项分离、浓缩或提取条件。

1）离心沉降的原理：固体和液体之间存在一定的密度差，且固体密度大于液体的密度。

2）影响离心沉降速度的因素：密度差、颗粒大小、液体粘度、离心力大小

离心分离法根据其操作方式的不同，又可分为差速离心和密度梯度离心。

差速离心法的原理：差速离心是利用不同离心速度产生不同离心力，将各种亚细胞组分和各种颗粒分别分开。不同物质有不同的形状、大小、质量和密度，当在介质中离心时，它们的沉降速度各有差异。

一般密度梯度离心法：把样品铺放在一个连续的液体密度梯度上，然后进行离心，并控制离心分离的时间，使得粒子完全沉降之前，在液体梯度中移动而形成不连续的分离区带。

等密度梯度离心法：不同粒子存在密度差时，在离心力场作用下，粒子或向下沉降，或向上浮起，一直移动到与它们密度恰好相等的位置上（即等密度点）并形成区带，此即等密度梯度离心法。

三、离心过滤原理：以离心力作为推动力完成过滤操作,具有离心和过滤的双重作用。

2、什么是细胞破碎和细胞破碎率？细胞破碎的方法主要有哪些？其原理各是什么?

细胞破碎：指选用物理，化学，酶或机械的方法来破坏细胞壁或细胞膜。

破碎率：被破碎细胞的数量占原始细胞数量的百分数。

1）珠磨法，作用机理：微生物细胞悬浮液与极细的研磨剂在搅拌浆作用下充分混匀，珠子之间及珠子与细胞之间相互剪切、碰撞，促使细胞壁破裂，释放出内含物。

2) 高压匀浆法，作用机理：从高压室压出的细胞悬浮液，经过阀座的中心孔道从阀座和阀杆之间的小环隙中喷出，速度可达几百米每秒。这种高速喷出的悬液又射击到静止的碰撞环上，被迫改变方向从出口管流出。

3) 超声波法，作用机理：声频高于15～20KHz的超声波在高强度声能输入可以引起空化现象，使气泡形成、胀大和破碎的现象。

4) 化学渗透法，作用机理：化学渗透取决于化学试剂的类型及细胞壁和膜的结构与组成。不同试剂对各种微生物细胞作用的部位和方式有所差异。

5) 酶溶法，作用机理：溶酶具有高度专一性，蛋白酶只能水解蛋白质，葡聚糖酶只能水解葡聚糖，因此，利用溶酶系统处理细胞必须根据细胞的结构和化学组成选择适当的酶，并确定相应的使用次序。

6) 物理法

3、什么是包含体？包含体形成的原因有哪些？包含体的溶解常用的试剂有哪些？

1) 包含体的概念：在基因工程菌细胞内表达的重组蛋白，常常互相交联在一起，形成不溶性的聚积物，通常称为包含体。

2)包含体形成的原因：①产生少量蛋白时，可溶，量过多时，在细胞内超过其溶解度而沉淀；

②蛋白质合成速度太快，肽链来不及形成正常的折叠构象，导致分子间因疏水作用聚合而不溶，生物活性受影响；

③高表达的蛋白没有形成正常的二硫键，或宿主细胞内氧化还原等条件不同而生成不同的-S-S-；

④蛋白的溶解需要与其他成分结合或经其他成分诱导形成适当的可溶性构象，当产生的蛋白量过多，所需其他成分相对不足，如折叠酶，分子伴侣等。

⑤包含体的形成亦与蛋白质自身稳定性有关。

3)包含体的溶解

1)溶解常用试剂:

尿素、盐酸胍→破坏蛋白质的高级结构

去污剂SDS→破坏肽链之间的疏水作用

2)二硫键的还原剂:

二硫基苏糖醇(DTT)、2-巯基已醇→使二硫键处于可逆断裂状态

4、蛋白质复性常用的方法有哪些?

1、稀释与透析复性法：稀释复性是将变性蛋白质溶液直接加入到复性缓冲液中，蛋白质周围变性剂浓度降低，从而使蛋白质折叠成天然构象。透析复性，用透析、超滤或电渗析等方法除去变性剂。

2、凝胶过滤复性技术：凝胶通过分子筛效应将变性蛋白质与变性剂加以分离，从而使变性蛋白质进入复性溶液进行复性。

3、反胶束萃取复性法