Y染色体微缺失检测指导

Y 染色体微缺失是严重少精子或无精子症的重要原因，是导致男性不育的第二大遗
传因素，其发生率仅次于Klinefelter 综合征( 克氏综合征) 。

从1999 年开始，欧洲男科学协会和欧洲分子遗传实验质控网(EAA/EMQN为提高诊断质量，出版了
色体微缺失分子诊断指南，并提供了客观的实验质量评价方法。

最新版的实验室指
南是2013年9月EAA/EMQ根据12年的临床积累和专家共识，在1999版和2004 版的基础上修订而成。

新指南重点阐明：在少精子症或无精子症男性中发现的
色体微缺失区域，主要是无精子因子(azoospermia factor , AZF)区域仅包含AZFa AZFb AZFbc、AZFc和AZFabc区，独立的AZFd区并不存在；AZFc区中gr/gr 缺失
是影响精子生成的一个危险因素，但临床意义尚存争议，不作为常规检查指标；检
测位点增加并不能提高检测灵敏度，反而可能使结果复杂化；基于两管多重PCR的检测方法仍适用于整个AZF缺失检测。

EAA/EMQN2年国际质量评估计划(EQA计划)
的实施表明，参与实验室通过规范实验操作，改善报告质量，可有效降低诊断错误
率。

Y染色体微缺失在中国不育男性中的发生频率为%处于较高水平，我们建议将
AZF检测作为男性严重少精子或无精子症的常规检测项目，呼吁国内AZF 检测实验室加入EQA 计划，完善中国Y 染色体微缺失检测实验操作规
范。

Y染色体微缺失分子检测在中国已幵展多年，国内专家对AZF缺失模式、检测序列
标签位点(sequenee - tagged site, STS) 的数量、检测方法和内部质量控制等临床
问题未达成共识。

各实验室的诊断操作方法有很大不同，导致不准确或错误诊断时
有发生，迫切需要建立Y染色体微缺失诊断标准和质量控制标准。

EAA/EMQ更新的2013版指南对以上问题都给出了明确的专家共识，对我国建立自己的检测指南有重
要的指导意
义。

、 Y 染色体微缺失发生频率
Y 染色体微缺失在健康人群中发生率约为 1/4 000 ，但在不育男性中显着升高，微 缺失发生频率为2%-10%甚至更高）。

2013版指南指出Y 染色体微缺失在中国不育 男性中发生频率为 %，处于较高水平。

2006年朱晓斌等 ［1］ 针对中国不育男性染色体
的研究表明 AZF 微缺失在非梗阻性无精子症患者中的发生率为
%，严重少精子症患
者中发生率为 %，与国内外其他学者的研究基本一致。

随着微缺失分子机制的阐明和 Y 染色体男性特异区域的结构（MSY ）测序完成，结合 十多年临床数据分析，EAA 专家总结沿用Repping 等［2］对Y 染色体微缺失区域的定 义模式，分为：AZFa 区缺失、AZFb 区缺失、AZFbc 区缺失和 AZFc 区缺失，认为只
有该微缺失模式有明确的临床表现。

国内外学者对 AZFd 区缺失是否存在一直存有 争议。

尽管发现在AZFb 与 AZFc 两区域之间存在新的缺失位点（一些学者认为的AZFd 区缺失 ），但是该区域缺失没有明确的临床意义，也并非独立存在的缺失模式。

所 以第四区域AZFd 区缺失仍存在较多争议。

Musi tmanolu 等［3］在2005年的一项研究 中指出AZFd 缺失可能与精子形成有关，但仍缺乏有力的临床证据。

等［4］在精子正常和轻度少精子症患者中都发现了假定的 AZFd 区缺失。

然而，至今 为止 AZFd 区域尚未发现与精子生成相关的候选基因，其缺失所对应的临床表型还 二、 gr/gr 缺失不纳入常规检查项目 研究证实gr/gr 缺失属于AZFc 部分缺失，是影响精子生成的一个重要因素，但是
否需要将其作为常规检查指标尚存争议。

尽管 gr/gr 缺失可导致AZFc 区一半以上
基因丢失，但其临床意义仍不明确，因为该缺失患者精子生成表型变化多样，从少
2013 年，陈科 需进 步确认。

精到精子数目正常都存在0 gr/gr 缺失表型在不同人种和地域间存在差异，已有研 究证实在欧洲白种人 （ 除了法国人 [5] 和德国人 [6]） 和西太平洋居民中， gr/gr 缺失 是男性生精障碍的高危因素 [7] 0
但在部分亚洲国家如日本和中国 [8,9] ， gr/gr 缺 失在健康人群中的概率和在不育患者的概率无显着差别。

李铮等 [10]研究发现Y 染 色体 gr/gr 缺失既存在于严重不育男性，也存在于生精功能正常的捐精者中，缺失 可能遗传自父亲，并未影响精子的发生，不能认为是精子发生的遗传风险因子。

因 此在中国 gr/gr 缺失不建议作为 Y 染色体微缺失常规检测的缺失模式。

三、AZF 缺失基因型/表型相关性
Y 染色体微缺失主要是 AZF 的缺失，该区域包含精子生成的相关基因家族，不同程 度的缺失可导致少精子或无精子症。

AZF 区进一步可分为 AZFa AZFb AZFc 区域。

AZFa 区域缺失通常导致唯支持细胞综合征 （SCO 综合征）和无精子症。

如果诊断为整 个AZFa 区域缺失，从睾丸中获得精子的概率为 00 AZFb 和AZFbc （P5/P1近端；P5/P1 远端，P4/P1远端）缺失的典型睾丸组织学特征是 SCO 综合征或精子发生阻滞导致的 无精子症。

研究表明这些缺失与整个 AZFa 区域缺失情况一样，患者也不能通过睾 丸穿刺（TESE ）获得精子。

严重少精子或无精子症患者中 AZFc 缺失发生频率最高, AZFc 缺失的临床表型和睾丸组织学类型多种多样0
一般说来， 存精子生成能力0罕见情况下，其缺失在自然状态下可遗传给其男性后代
50%AZF （缺失的无精子症患者可通过 TESE 获得精子，进行单精子卵胞浆内注射（ICSI ） 受孕，但这些患者的男性后代都将是 AZF （ 缺失的携带者
四、 Y 染色体微缺失检测人群 Y 染色体微缺失检测不仅可以明确严重少精子或无精子症的病因，而且可以对预后 AZFc 缺失患者尚残 [11] 0近
做出一定的评估。

Y染色体微缺失通常见于无精子症或精子浓度少于2X 106/ml的
患者。

一般的临床参数，如激素水平睾丸大小精索静脉曲张睾丸畸形感染
等对是否存在Y染色体微缺失没有任何预测价值，Y染色体微缺失必须通过分子检
测来确定。

拟行ICSI 的严重少精子症应该做Y 染色体微缺失检测，而对非梗阻性无精子症患者在行TESE 或者睾丸显微切开取精术前也应该进行常规检测，因为当整个AZFa整个AZFb AZFbc或者AZFabc缺失时都不建议给患者做手术。

需要特
别提醒的是，如果采用辅助生育技术，AZFc缺失可以垂直遗传给男性后代。

如果患者通过AZF检测发现部分AZFa AZFb或AZFc缺失，建议家族中其他男性也
进行AZF检测，因为这种缺失是可以遗传的。

但整个AZFa AZFb AZFbc或者AZFabc
缺失时不建议家族其他男性成员做AZF检测，因为这些缺失通常没有精子生成。

对丈夫携带AZFc区缺失类型的夫妻，研究其ICSI受孕情况［12］，大部分研究表明
Y 染色体微缺失存在与否不影响受精率和受孕率，但也有个别报道指出微缺失会导致受精率下降，影响胚胎质量，降低囊胚率和ICSI 成功率［13］。

五STS
Y染色体微缺失上的STS位点高达131个，如果用于Y染色体微缺失检测的STS过
少，将有可能漏检某些区域的缺失，但若采用的STS过多，则可能包含一些多态性
序列，而这些位点在正常可育男性中也可出现缺失。

指南指出，原则上只要对每个AZF区域一个非多态性的STS位点进行分析就足以判
断AZFa AZFb AZFc是否存在缺失。

任何一个已知缺失区域都包括多个STS位点,
每个区域设置2个STS位点有助于增加检测的准确性。

鉴于众多实验室经验总结和外部质量控制，并考虑到多重PCF扩增的形式，在1999和2004版指南中推荐的经
典STS引物仍然有效，这些引物包括：AZFa: sY84、sY86；AZFb sY 127、sY 134；AZFc: sY254、sY255 （都在DAZ基因上）。

这些STS位点引物由多个实验室和外部
质量控制实验证明：结果可信重复性好。

采用这些引物几乎能够检测到所有临床上的相关缺失和文献报道的3个AZF区域95%以上的缺失，设计的这套引物能完全满
足常规检测。

它是一个简单的标准，便于实验室质量控制和缩小实验室之间的检测差异，因此强烈推荐所有实验室都采用这些引物。

指南指出一些检测方法和试剂可检测很多STS位点，但并不能提高检测的灵敏度,
反而可能使结果复杂化、难以解释，因为这可能检测到很多假的缺失位点，尤其是
当DNA质量不好，PCR条件不是最佳时。

而大部分试剂盒并没有额外的单重PCR来确认可疑结果，因此指南并不推荐增加STS位点［14］。

六、PCR的形式和内部质量控制
Y染色体微缺失检测采用多重PCF体系，体系中设置的PCR引物应该包括2个内对
照：sY 14(SRY)、ZFX/ZFY; 6 个STS位点：sY84、sY86、sY 127、sY 134、sY254、sY255。

PCR需设立内对照（SRY、ZFX/ZFY基因），阳性对照（健康的男性DNA）,阴性对照（女性DNA和水空白对照（用水代替模板，即含有除模板DNA外所有成分的PCR反应）。

阳性对照监测实验操作是否有效，阴性对照监测DNA是否污染，空白对照监测试剂
是否污染。

内对照SRY基因是男性性别决定基因，位于Y染色体短臂，内对照SRY
基因可以在ZFY基因丢失时证明Y染色体特征序列的存在（比如：在XX男性中）。

ZFX基因检测不仅可以作为女性DNA对照，也可作为没有SRY S因的46, XX男性患
者唯一的阳性对照。

指南推荐的相关操作都经过认真设计和优化，采用两管多重PCR反应，每管多重PCR
反应体系中都包括每个区域的一个位点。

当标本出现整个AZFa AZFb或AZFc区缺失时，两管PCR反应中相应区域设置的2个STS位点产物都会缺失。

当AZFa和AZFb
区域出现部分缺失时，相关区域单个位点的缺失是有可能的，但需小心求证，对整
个区域进行详细的研究，目前这种情况很少见，被认为是例外。

通常认为AZFc 区的SY254或SY255单个缺失是实验结果错误。

七、Y染色体微缺失检测方法
EAA/EMQ推荐采用多重PCF方法检测Y染色体微缺失。

基于多重PCR的Y染色体微
缺失检测方法很多，如实时荧光PCR(Real- time PCR) 、电泳法和芯片法等。

Real
-time PCF检测采用荧光标记探针，不涉及电泳，检测速度更快，数字化结果更加
直观，因此指南推荐有条件的实验室都应采用该方法。

在没有Feal - time PCF 检测仪的实验室，可采用电泳法或毛细电泳法。

其他的检测方法如基因芯片检测，其
花费昂贵，且包含太多不必要的位点，不为指南所推荐。

实验室建立一种新的检测
方法，都需经过大量样本验证，并明确指出所采用的方法，而不是简单的描述"根据指南方法"。

指南推荐方法特指两管多重PCR方法，检测位点如上文所述6个经
典位
点。

八、EAA/EMQN 12年实验总结
进行AZF检测的实验室应该加入"EQA计划"。

从2000至2012年间，参加质量评估
的实验室从57家增加至148家。

诊断错误率显着下降，从开始前5年的8%到现在
的1%- 2%参与评估的诊断报告格式不断规范，质量大幅提高。

最近4年间，大约
50%的分析报告获得满分，与计划开始的前几年相比有了很大提
升。

目前国内实验室对于Y染色体微缺失的检测方法和筛查位点并没有形成共识，所以
检测结果也存在较大差异，因此建议在中国建立Y 染色体微缺失检测标准体系，并加入EQA计划。