农杆菌介导棉花转基因的方法

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转基因抗虫棉的遗传转化与功能验证

转基因抗虫棉的遗传转化与功能验证一、农杆菌介导的棉花胚胎再生遗传转化体系（一）实验方法以W0为受体，将pC2-dsGFP、pC2-dsJHAMT、pC2-dsPTTH3、pC2-dsPTTH5、pC2-dsJHBP载体的农杆菌菌株，运用农杆菌介导法分别将目的基因转入棉花下胚轴，通过组织培养技术获得转基因再生株系。

嫁接试验采用根系发达抗病性强的海岛棉（海7124）的实生苗做砧木，接穗是转化基因再生植株。

（二）实验步骤农杆菌介导的棉花遗传转化分3步，转化、胚胎发生和植株再生。

1）种子脱绒：轧花后的棉花种子，烘干（40℃左右），用适当硫酸（H2SO4）脱去短绒，自来水洗掉种子表面浓硫酸，充分晾干；2）种子的消毒处理：选取饱满棉花种子于无菌三角瓶中，无菌水冲洗一次，70%乙醇表面消毒种子30 Sec，弃去乙醇，加入30%过氧化氢（H2O2）于摇床振荡2-3 h，弃掉H2O2，无菌水冲洗种子3-5 次，保留少量无菌水浸过种子，存放28℃，18-24 h，待到种子破壳露白；3）外植体制备：在无菌条件下，滤掉消毒过种子的无菌水，剥去种子种壳，接种于苗培养基（1/2MS）上，28 ℃黑暗培养（N）3 d，然后在28℃、3000-5000 Lx光照下培养(D/N＝16 h/8 h) 3 d。

4）农杆菌活化与浸染液制备：将-70℃保存的农杆菌载体菌株，取出冻融。

在固体LB平板培养基上（含Kan 50μg/ml＋Rif/Str 50μg/ml）划线，28℃静止培养1-2天。

平板挑取单菌落，接种于含相应抗生素的LB液体（Kan 50μg/ml＋Rif/Str 50μg/ml）培养基（10ml）中，28℃振荡过夜，再按1%接种量转接入50mL新鲜培养基中（含Kan 50μg/ml＋Rif/Str 50μg/ml）培养8小时左右，测定OD600为0.5左右。

4℃，5000rpm离心5min ，收集菌体。

然后用5mLMSB0（含100 uM/ml AS）液体培养基重新悬浮沉淀，再转入15-45mL的MSB0（含100uM AS）液体培养基，28℃摇床上培养至OD600为0.5左右，稀释培养液OD600 值0.3-0.7 时备用。

转基因步骤

农杆菌诱导的棉花下胚轴遗传转化1:无菌苗的制备a：现将准备好的棉花种子去掉外面的硬壳，在超净工作台上用0.1%的升汞灭菌8分钟（期间不断的摇晃小三角瓶）。

将升汞倒回原来的瓶子后，用无菌水清洗3－4次，5min左右一次（清洗的期间不断地摇晃小瓶子）。

b：清洗完毕后，将种子转移到无菌培养基上，5—6颗每瓶（在转移时，所用到的勺子，镊子注意用酒精灯烧好，注意无菌操作）。

c：将已经转移好的培养基封口后，放入恒温培养箱培养。

d：恒温培养箱培养48h后扶苗（扶苗主要是将种皮去掉，将已经长出来的跟插入到培养基里面）。

e：96h后根据下胚轴生长情况切苗转化。

注意：上述全部过程都是在超净工作台上完成的，注意各个细节确保无菌操作。

需要准备的器具有无菌水，两个灭菌的空瓶子，升汞，镊子，无菌培养基，酒精灯，种子。

2:切苗转基因a：准备好需要的器具，两个带滤纸的大皿，带滤纸和不带滤纸的小皿数个，两把镊子，酒精灯。

b：切苗的要求，将生长正常无菌的下胚轴从无菌培养基上取出来去掉两端多余的部分，用已经灭菌的刀片将其切成6-8 mm的小段，在切得时候要做到一刀两段，不能用刀片将下胚轴损伤。

C：在切了一半的时候可以准备要用的菌液（假设同时转两个基因，只用一瓶菌液）1：取10ml MGL到三角瓶之中分别加入25ulAS2：将已经准备好的菌液取适当的量到离心管中，离心一分钟后待菌体沉积到离心管底部时即可。

3:将需要转化的基因在三角瓶上编号，用MGL抽打菌液后，取少量菌液转入到不同基因的三角瓶内（在光下看到溶液为薄雾状即可）。

4：将带有编号的三角瓶放到摇床上>30min5:将菌种转入到4摄氏度的冰箱中保存。

6：待切苗完成后，将下胚轴转入到对应的菌液中，8min后倒掉菌液，待下胚轴上的菌液完全干之后（可用小皿里的小滤纸反复吸收上面的菌液)，将下胚轴转入到带有小滤纸的共培养。

的培养皿中。

将转好的小培养皿放到恒温培养箱中，72h后转皿。

棉花转基因技术的研究及应用

（ｇｏａｔｉｍｍｄｔｅｅｔｎｆ）花粉管通道Ａｒｂｃｒ．ｅｉｅｇｎｒｓｒ、ｅｕａｄａｅ
棉花的基因组中并得以表达，且外源ＤＡ表达通常Ｎ表现出典型的孟德尔遗传规律。由于Ｔ质粒本身ｉ
能插入大到５ｂ的外源ＤＡ，０ｋＮ因此利用此转化载
在棉花遗传转化体系中，要有农杆菌介导主
ａｇｏａｔｒｓａｒｂｃｅｉｕｍ－ｄａｅｅｅｔａｓｅ，ｐｒｉｌｏａｄｅｔｇｎｒｎｆｒａｄｐｌｅｕｅｐｔｗａｅｅｔａｓｅ．Ｉｍｅｉｔｄｇｎｒｎｆｒａｔｃｅｂｍｂｒｍｎｅｅｔａｓｅｎｏｌｎｔｂａｈｙｇｎｒｎｆｒｎｔｉｐｐｒｈｉａｉｒｎｉｌｓｔｃｎｃｌｃａａｔｒ，ｄｖｌｐｎｎｐｌａｉｎｗｅｅｒｖｅｄ．ｈｓａｅ，ｔｅｒｂｓｃｐｃｐｅ，ｅｈｉａｈｒｃｅｓｅｅｏｍｅｔａｄａｐｉｔｒｅｉｗｅｉｃｏＫｅｒｓ：Ｃｔｏｙｗｏｄｏｔｎ；Ｇｅｅｉｒｎｆｒｔｎ；Ｄｅｅｏｍｅｔａｄａｐｉａｉｎｎｔｃｔｓｏｍａｉａｏｖｌｐｎｎｐｌｔｏｃ
关键词：棉花；遗传转化；究与应用研
中图分类号：５２０￥６．１文献标识码：Ａ文章编号：００— ０１２０）刊一０１０１０７９（０６增０４ — ５

棉花转化实验报告

棉花转化实验报告棉花转化实验报告一、引言棉花是世界上最重要的经济作物之一，广泛用于纺织品、纸张和食品工业。

然而，传统棉花种植面临着许多挑战，如病虫害、环境压力和耕地资源有限等。

因此，寻找一种高效的棉花转化方法，以提高产量和抗性，对于农业发展具有重要意义。

二、材料与方法本实验选取了常见的棉花品种作为研究对象，通过基因转化技术引入外源基因，以提高棉花的产量和抗性。

具体步骤如下：1. 构建转化载体：将目标基因与转化载体连接，构建出适合棉花转化的载体。

2. 组织培养：采集棉花幼胚作为外植体，在含有适当激素的培养基中进行愈伤组织的诱导和增殖。

3. 基因转化：将构建好的转化载体通过农杆菌介导法导入棉花愈伤组织细胞中，利用细胞的再生能力使转基因棉花植株产生。

4. 筛选转基因植株：通过对转基因植株进行筛选，利用PCR等方法检测目标基因是否成功转化。

5. 鉴定转基因植株：通过观察转基因植株的形态特征、生长情况和抗性等性状，对转基因棉花进行鉴定。

三、结果与讨论经过一系列的实验操作，我们成功地将外源基因导入了棉花植株中，并获得了转基因棉花。

通过PCR分析，我们确认了目标基因的存在。

在鉴定转基因棉花的过程中，我们观察到转基因植株在生长速度、花期和产量等方面均表现出了显著的改善。

同时，转基因棉花还表现出更好的抗虫性和耐逆性，对病虫害的抵抗能力明显增强。

这一实验结果表明，通过基因转化技术可以有效地提高棉花的产量和抗性。

转基因棉花具有广阔的应用前景，可以为农业生产带来诸多益处。

然而，我们也应该注意到转基因技术的潜在风险和争议。

在推广应用转基因棉花之前，需要进行更多的安全性评估和环境影响研究，以确保其对人类和环境的安全性。

四、结论本实验通过基因转化技术成功地将外源基因导入棉花植株中，获得了转基因棉花，并证实了转基因棉花在产量和抗性方面的优势。

这一研究为棉花种植的发展提供了新的思路和方法。

然而，转基因技术的应用仍需要更多的研究和评估，以确保其安全性和可持续性。

棉花茎尖基因枪—农杆菌转化体系的建立和GLU-CHI基因的导入

棉花茎尖基因枪—农杆菌转化体系的建立和GLU-CHI基因的导入棉花是世界重要的经济作物之一，但是由于长期受到黄萎病的危害，其产量和品质受到严重影响。

目前，通过常规育种方式来寻找合适的抗源尚存在困难。

因此，利用基因工程进行遗传改良的研究一直倍受人们关注。

本实验以川棉239和川棉45的茎尖为材料，建立起良好的再生体系和基因枪—农杆菌转化体系。

并把玉米几丁质酶基因和大麦β-1，3-葡聚糖酶基因的双价表达载体导入棉花，获得了抗卡那霉素的转基因棉花新材料，主要结果如下： 1．棉花茎尖再生体系的建立取1.5d苗龄的茎尖，接入MSB1（MSB+BA0.1mg/L）中培养2-3周，然后转入MSB2（MSB+活性炭lg/L）中培养2-3周，再转入MSB3（MSB+IBA 0.1mg/L+IAA0.1mg/L）中培养2周，再在1/2MSB上培养2-4周。

两个品种的再生频率达90％以上。

2．Kan筛选压的确定取1.5d苗龄的棉花茎尖，置于附加不同浓度（0、10、20、30、40、50、75、100mg/L）Kan的MSB1（MSB+BA 0.1mg/L）培养基中进行Kan敏感性测试，确定了筛选压浓度为：Kan 50mg/L。

3．棉花茎尖基因枪—农杆菌转化体系的建立取1.5d苗龄的茎尖，用钨弹轰击形成创伤，轰击距离为3cm，轰击压力为1550psi，真空度27-28 inches Hg（负压）。

然后用OD600值为1.1的农杆菌菌液（内含100mg/L乙酰丁香酮）抽真空感染30min，真空度为25 inches Hg。

转入表面附加有一层滤纸的MSB1+AS 100mg/L的培养基上28℃、暗处共培养3d后，将外植体转入延迟筛选培养基（MSB1+Cef500mg/L）中培养7d。

转基因棉花灭虫的原理

转基因棉花灭虫的原理一、转基因棉花的制作
1. 选择具有抗虫基因的捕食性细菌,提取此基因。

2. 使用热坏血酸杆菌作为载体,构建重组质粒。

3. 将重组质粒导入棉花组织,利用农杆菌介导的基因转化。

4. 在选择性培养基上长出转基因植株,获得转Bt基因棉花。

二、Bt基因蛋白的作用
1. Bt基因来源于土壤芽孢杆菌,可编码生产Bt蛋白。

2. Bt蛋白可降解为δ内酰胺,对鳞翅目昆虫具有高毒性。

3. 棉花生产Bt蛋白,使叶子、茎、棉絮中都含有这种蛋白质。

三、转基因棉花抗虫的机制
1. 鳞翅目虫幼虫取食转基因棉叶、茎时,会摄入Bt蛋白。

2. Bt蛋白在虫肠道被激活,破坏肠道细胞,导致虫体死亡。

3. 转基因棉种植可大幅减少使用农药,有效控制虫害。

四、转Bt基因棉花的优点
1. 对目标害虫具有高letal效应,防治效果好。

2. 可大幅减少农药使用,减轻环境负担。

3. 对人畜安全,Bt蛋白不溶于水,不会残留。

4. 种植管理简便,产量和质量较高。

五、注意事项
1. 要监控目标害虫,防止抗药性的产生。

2. 避免影响到非目标生物,保护生态环境。

3. 制定科学合理的种植计划和技术措施。

4. 加强转基因棉监管,确保食品安全。

农杆菌法转化茎尖获得转SNC1基因棉花及其T_1植株对棉花枯萎病的抗性

分子植物育种，００年，８卷，２期，２２２８页２１第第第５－５
Ｍｏｅｕａｌｎｅｄｎ，０１，１，．，５ — ５ｌｃｌｒａｔＰＢｒｅｉｇ２Ｖｏ．Ｎｏ２２２２８０８
研究报告
ＡｔｒＬｅｔｅ
ＬｅｉｎｒｎＷａｇＤｏｇｅ ’ ＳａｎＷｅａｗｅＨｕｎｇＬｅｉｇｉＪａｇｏｇｎｎｍｉｈｏＬｉｉＸｉｏｉａｐｎ
ＴｅＩｓｉｔｏＮｕｌｒｎｏｏｉａＴｃｎｌｇ，ｎｉｎａｅｆｇｉｌｒｌｃｅｃｓＵｒｍｑ，３０１ｈｔｕｅｆｃｅｄｌｇｃｌｅｈｏｏｙＸｉａｇｎｔａａＢｉｊＡｃｄｍｙｏＡｒｕｔａｉｅ，ｕｉ８０９ｃｕＳｎ
照比较，Ｔ代转基因棉花的枯萎病抗性明显提高。关键词Ｓ１农杆菌介导法，ＮＣ，茎尖，陆地棉，萎病枯
ＡｇｏｕｍｅｉｔｄＴａｓｏｍａｉｎｏＮＣｎｎｏＣｏｔｎＳｏｔｒｂｃｅｉｍ— ｄａｅｒｎｆｒｔｆＳ１ＧｅｅｉｔｔｈｏａｔｒｏｏＡｐｘａｄＦｓｒｕＷｉｓｓａｃｌｎｓｅｎｕａｉｍｌＲｅｉｎｅｉＴ１ａｔ基因棉花及其Ｔ植株对棉花枯萎病的抗性Ｎ１
雷江荣王冬梅邵林危晓薇黄乐平
新疆农业科学院核技术生物技术研究所，乌鲁木齐，３０１８０９通讯作者．ｍ０２＠ｙｈｏＣｒ．ｗｄ１１ａｏ．ｕｃＯｎ
摘要以陆地棉中３５和军棉１号的茎尖为外植体，利用农杆菌介导法将含有拟南芥抗病基因Ｓ１（ｐＮＣｓ — ｕ

农杆菌与质粒DNA子房注射法在棉花转基因研究中的应用

农杆菌与质粒DNA子房注射法在棉花转基因研究中的应用作者：匡政成等来源：《湖南农业科学》2014年第04期摘要：为了研究农杆菌和质粒DNA两种子房注射法对普通棉花品种的转化效率，以8891棉花为材料，分别在三亚和常德两地进行了转化试验。

结果表明：与质粒DNA注射相比，三亚地区农杆菌注射的转化效率高1.25个百分点；但农杆菌子房注射的落铃率高，获得的种子相对较少；而在不同的地点试验，常德地区的落铃率显著高于三亚地区；而质粒DNA直接注射的成铃率更高，虽然转化率相对较低，但也能获得有效的转化植株。

关键词：农杆菌子房注射；质粒DNA子房注射；棉花；遗传转化中图分类号：Q789 文献标识码：A 文章编号：1006-060X（2014）04-0031-03Abstract： In order to study the transformation efficiency of two ovary injection methods （with Agrobacterium tumefaciens or with plasmid DNA） to normal cotton variety 8891， the transformation experiments were conducted in Sanya and Changde， respectively. The results showed that the ovary injection with Agrobacterium tumefaciens in Sanya increased the transformation efficiency by 1.25 percentage points， but it had relatively higher boll shedding rate which causing relatively less seeds， moreover， the boll shedding rate in Changde was significantly higher than that in Sanya； ovary injection with plasmid DNA had relatively higher boll setting rate， and it can obtain the effective transformation plant although the transformation efficiency was relatively lower.Key words： ovary injection with Agrobacterium tumefaciens； ovary injection with plasmid DNA； cotton； genetic transformation转基因抗虫棉是目前转基因成功并广泛推广种植的作物之一[1]，其种植面积已占我国棉花总种植面积的70%，超过了200万hm2。

农杆菌介导SlNAC1基因转化棉花的研究

ＰｒｅｌｉｍｉｎａｒｙＳｔｕｄｉｅｓｏｎＴｒａｎｓｇｅｎｉｃＣｏｔｔｏｎｗｉｔｈＳＩＮＡＣ１Ｇｅｎｅ
ＭｅｄｉａｔｅｄｂｙＡｇｒｏｂａｃｔｒｉｕｍｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ
ＨｕａｎｇＹｕｎ，ＬａｎＪｉａｙａｎｇ，ＣｈｅｎＱｕａｎｑｉｕ，ＦｕＪｉａｐｉｎｇ，ＺｈａｎＸｉａｎｊｉｎ
摘要：本实验在无菌条件下，以棉花下胚轴为外植体，利用农杆菌介导转化番茄ＳｌＮＡＣ１基因，通过愈伤组
为棉花抗逆育种工作提供了新的选择。
１材料与方法
１．１供试的棉花品种
本课题保存的珂字棉３１２（Ｃｏｋｅｒ３１２）自交系。
１．２根癌农杆菌及质粒
农杆菌菌株ＧＶ３１０１由武汉双螺旋生物科技有限公司惠赠。质粒ｐＢＩＮＡＣ１由华中农业大学欧阳波课题组改造并提供。。］，含有ＮＡＣ１基因。图１
织培养、分化及ＰＣＲ检测棉花幼苗获得了Ｔ。代的阳性转基因棉花植６７株。
关键词：棉花；ＳｌＮＡＣ１；农杆菌；转化中图分类号：￥５６２．０３５．３文献标志码：Ａ文章编号：１０００ — ６３２Ｘ（２０１４）０３ — ００１５ — ０３

农杆菌介导棉花遗传转化体系优化

农杆菌介导棉花遗传转化体系优化棉花纤维是纺织工业的重要原料,利用基因工程的方法遗传改良棉花纤维品质是棉花分子育种的重要方向。

GbMYB2基因cDNA是从海岛棉中克隆出一段长度为747bp的开放读码框,本实验室前期的研究结果证实:在拟南芥中过量表达GbMYB2基因能够能够增加表皮毛的数目、根的长度。

为了进一步研究GbMYB2基因在棉花中的功能,本研究在完善棉花遗传转化体系的同时,利用农杆菌遗传转化的方法将其转入棉花获得转基因的植株。

农杆菌介导的棉花遗传转化体系通常以下胚轴为外植体,经历愈伤组织、胚性愈伤组织、体胚胎发生等过程获得再生植株。

但该遗传转化体系通常受到基因型限制、转化周期长、成胚率低等因素的限制。

为了解决上述有关问题,本文在前人的工作基础上对体系进行优化,分别从两个方面(以胚性愈伤为受体的转化体系和以茎尖为受体)对农杆菌的遗传转化体系进行了探讨,结果如下:1.对以下胚轴为受体的遗传转化体系进行了优化:首先,针对棉花遗传转化体系的面临的转化效率低的问题,对外植体、农杆菌浓度、共培养时间、农杆菌菌株、C源以及凝固剂等进行研究和对比,结果显示:50mg/L卡纳霉素可以有效筛选抗性愈伤组织;下胚轴是该转化体系的最佳外植体;LBA4405和EHA105均可作为该转化体系的工程菌菌株;农杆菌浓度控制在OD600为0.5左右;最佳共培养时间为48h；以葡萄糖为C源可减少褐化。

其次，针对转化体系中转化周期长和工作量大的问题，对继代次数以及不同形态的非胚性愈伤组织产胚能力以及生长速度等进行了分析，结果显示：MSB5培养基继代次数两次；绿色和灰色相间的颗粒状非胚性愈伤组织生长速度和产胚能力最高；对非胚性愈伤及时进行分化培养可缩短转化周期；最后，针对转化体系中畸形胚发生率高的问题，对转化程序进行了优化，结果显示：应在加有滤纸的分化培养基上诱导产生胚后及时转入营养物质充足在的未加滤纸的培养基中进一步培养，并及时转接。

以GFP为报告基因优化农杆菌介导海岛棉转基因体系的研究

摘要：为了进一步建立优化的根癌农杆菌介导海岛棉外源基因转化体系，高海岛棉外源基因转化率。以生提理状态基本一致的海岛棉新海３０号的胚性愈伤组织为受体材料，绿色荧光蛋白基因（Ｐ为报告基因，浸染以ＧＦ）将时间和共培养时间作为试验要素，选适宜的浸染时间和共培养时间。结果表明，癌农杆菌介导的海岛棉外源筛根基因转化体系的最佳浸泡时间为１ｉ，培养时间为２。５ｒｎ共ａ４ｈ关键词：海岛棉；Ｐ基因；传转化；ＣＧＦ遗ＰＲ
合，Ｐ就可以作为棉花遗传转化体系中的报告分ＧＦ
子，最大的优点是检测极为方便。此外，如果转基因植物中有较高水平的ＧＦＰ转录子时，可使用长波紫外灯进行检测，在手提式紫外灯的直接照射下［。如２］
入棉花，而为该转化方法提供新的证据。有关海从岛棉农杆菌介导的转基因体系研究少有报道，因此利用ＧＦＰ做为报告基因，筛选海岛棉最佳转化体系
具有重要意义。
ＧＦＰ用于水稻［、麦［、米＿、蔗［等作物的３小］４玉］５甘］６
一
将已经预培养的新海３０的胚性愈伤，入经活放
化的菌液中，液Ｏ值为０３．，染菌液设菌Ｄ．～０５浸计４个时间梯度，掉菌液，无菌水冲洗２３遍，倒用－用灭菌的滤纸吸干残余菌液，均匀分布于垫有滤纸

农杆菌真空渗透法转化花粉获得棉花转acsB基因植株

lImnoo1 pANG mqerse1 tuv wqrmnox2 lv wnxyrCzqx2 tuAO mnoxyr{nox1
C1|}~tofAgricultur},Biot}chnology,Zh}jiangUniv}rsityHangzhou,D10029E2|}~t.ofBiology,P}kingUniv}rsity100871,ChinaF
byvacuum infiltrationofpollenwithAgrobacterium tumefaciens
授粉子房数
No.of pollinated
ovary
结铃数
No.of effective
boll
结铃率
Rateof effective boll(% )
畸形铃数
No.of abnormal
别用 HindⅢ 和 BamHⅠ 于 37℃酶切过夜,经电泳分开后转印于尼龙膜,预杂交、杂交和探针的同位素标记均按 Fermentas试剂盒说明书进行。杂交膜用 2倍的 SSC、0.1%SDS(5min,2次),以及 0.1 倍的 SSC、0.1%SDS(68℃,15min,2次)的溶液漂洗后,压 X射线片进行放射自显影后观察结果。经潮霉素抗性、GUS表达、PCR 产物和 Southern 杂交检测均为阳性的转化体 ,定为转基因棉花。
够发芽和生长,且胚根亦不会褐化,与对照相比只是生长速度稍慢。30mg/L潮霉素对未转化种子的发芽已有一定的影响 ,但有一部分棉花种子还是能发芽和生长,但胚根褐化,下胚轴生长缓慢。50 mg/L和 100mg/L的潮霉素浓度不论对未转化种子的发芽还是对苗的生长都有很大的影响 ,胚根一接触培养基就立即褐化,胚轴生长停滞。因此,50 mg/L的潮霉素浓度对转化种子进行筛选最为适

农杆菌介导转基因植物t-dna的整合方式

农杆菌介导转基因植物t-dna的整合方式
农杆菌介导转基因植物T-DNA的整合方式
农杆菌介导转基因植物T-DNA的整合方式是指利用农杆菌介导技术将外源基因导入植物基因组中的过程。

农杆菌介导转基因技术是一种常用的植物遗传转化技术，通过该技术可以将外源基因导入到植物细胞中，并将其整合到植物基因组中，从而实现对植物性状的改良和优化。

农杆菌介导转基因植物T-DNA的整合方式主要包括以下几个步骤：
1. 农杆菌感染：首先需要将含有目标外源基因的质粒导入到农杆菌中，然后利用农杆菌的特殊途径将质粒中的T-DNA片段转移到植物细胞中。

2. T-DNA整合：一旦T-DNA片段进入到植物细胞中，它会与植物基因组中的某个位置发生重组，从而将外源基因整合到植物基因组中。

这个过程是随机的，T-DNA片段可以整合到植物基因组的不同位置。

3. 外源基因表达：一旦T-DNA片段整合到植物基因组中，外
源基因就可以在植物细胞中得到表达，从而产生目标蛋白质或RNA。

4. 遗传稳定性：经过一系列的培养和筛选，可以获得稳定遗传的转基因植物株系，这些植物株系可以传递给下一代，从而实现外源基因在植物种群中的稳定传递和表达。

农杆菌介导转基因植物T-DNA的整合方式是一种高效、可靠
的转基因技术，它已经被广泛应用于多种重要农作物的遗传改良和品种选育中。

通过这种技术，可以实现对植物抗病、抗虫、耐逆性等重要性状的改良，为农业生产提供了强有力的技术支持。

同时，随着分子生物学和生物技术的不断发展，农杆菌介导转基因植物T-DNA的整合方式也在不断完善和优化，为农
作物遗传改良和新品种选育提供了更加强大的技术平台。

转基因抗虫棉的生产方法

转基因抗虫棉的生产方法
随着人口的不断增长和经济的发展，粮食和纺织品需求不断增加。

但是，农业生产面临严重的损失，其中最主要的问题就是虫害。

转基因抗虫棉是许多国家的重要之举，通过转基因技术，从其他生物种类中引进抗虫基因，使得棉花在生长过程中对虫害更加抗拒，从而将棉花产量的损失降至最低。

下面，我们来详细了解一下转基因抗虫棉的生产方法。

第一步：筛选抗虫基因
转基因棉花的主要目的是提高棉花抗虫性，因此在生产之前，首先需要从其他生物中选择具有优良抗虫性的基因。

例如，引入来自取籽小蠹或焦糖盲蝽的基因，可以使棉花对这两种常见的害虫产生抗性。

第二步：将抗虫基因转入棉花
将筛选出的抗虫基因转入棉花的方法有多种，比较常见的是农杆菌介导的转化方法。

在这种方法中，先将被筛选出来的基因克隆到农杆菌T-DNA上，再将该T-DNA转入棉花幼胚的细胞中。

第三步：筛选具有抗虫性的棉花植株
将农杆菌介导的转化后，得到的棉花幼胚，经过一段时间的培养，可以得到具有转基因抗虫基因的棉花植株。

然后，在大棚环境下，对这些植株进行蚜虫、取籽小蠹等常见害虫的人工感染，筛选出哪些转基因植株抵御虫害，产量仍高，这些棉花就是成功的转基因抗虫棉。

第四步：繁殖和推广
筛选出的转基因抗虫棉经过多年的实验表明，该品种在抗虫方面表现更优秀，具有很高的抗虫性和较高的产量。

因此，生产商会将这些棉花繁殖，推广到生产中，以提高棉花生产效益。

总的来说，用遗传工程技术改良棉花，使其具有抗虫性，是一种有效的防治虫害的方法，通过不断地改进，提高棉花的产量和质量，同时也能够保障棉农的收益。

农杆菌介导外源基因转化棉花上胚轴方法的研究

ｐｏｉ）ｒｏｔｒｎｅｅｎｉｅｎｏｃｔｎｂｇｏｃｅａＨｎｄａｄｔｎｆｍ￣ｉ．Ｔｅｐｅｃｌｒｔｅａｔｉ — ｍｅｉｇｔ，ｃ－ｕｔｅｒｔｎｅｒｅｗｒ￣ｌｔｄｉｔｏｔｙａｒｂｔｉｅｐｅｇｅａｏａｒｎｅｉｅｒｓａｏｈｒ－ｕｕｅｉ，ｂｃｅａｉ￣ｎｉｔａｏｔｎｔｍｒｌｎｒｓｎｏｃｌｒｕ
阳立恒１郝秀２，延英，２英，曲
（．疆农业大学农学院，疆吗鲁术齐８０５；．疆农业科学院微生物应用研究所，１新新３０２２新新疆乌鲁木齐８０９；．京工业大学，苏南京２００）３０１３南江１０９
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农的研究
ｔｄａｔｉｔｓｃｎｎ．ｔｆｕｉｇｏａｔｒｍ￣ｍｅｉｔｄｔａｓｏｍｔｎｉｅｔａｓｎａｉｎｏｏｅｅｔｇｒｔｉｇｅｉｔｌｆｃｔｎｗｅｅｓｄｉａｉｏｉｏｃ，ｅｃｏｓｎａｒｂｃｅｔ－ｄａｅｎｆｒａｉｎｔｒｎｆｎｔｆｍｐｔｎｅｍｉｎｐｃｙｏｔｒｔ — ｍｅｎｎｂｃｇｉｒｏｈｏｏｃｍｔｏｏｏｕ
ｏｔｎａｃｐｒｎｅｏｅｏｓｇｎａｓｎａｏ，ＰＩｎｏｙｉｈｓｈ￣ｒｅａｅＩ）ｇｎｒｉｌｔｎｎｒｅｎＦｇｅｎｆｏｆｏｔｒｅｔｇｎｕｅｅｔｎｆｎｔｎＮＴＩ（ｅｍｃｐｏｐｏｍｓｒｃｏｓｅｏｉｘｒｏｉｎｆｓＩｅｅｃｒｎｓｅｉｋｋｒｄＧＰ（ｒｕｍ￣ｅｔａｙｇｅｏａｃａｅｌｎ

一种农杆菌介导的棉花瞬时转化方法[发明专利]

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201711045105.9(22)申请日 2017.10.31(71)申请人河南大学地址 475001 河南省开封市明伦街85号(72)发明人苗雨晨　李坤　李海鹏　郭玉涛　郭敬功　(74)专利代理机构郑州联科专利事务所(普通合伙) 41104代理人时立新(51)Int.Cl.C12N 15/84(2006.01)A01H 5/00(2018.01)A01H 6/60(2018.01)(54)发明名称一种农杆菌介导的棉花瞬时转化方法(57)摘要本发明属于棉花基因工程技术领域，具体涉及一种高效快速的农杆菌介导的棉花瞬时转化体系的建立。

该方法具体包括制备瞬时转化溶液、培养棉花幼苗并进行高渗预处理、瞬时转化处理等步骤。

本申请所提供的棉花瞬时转化方法中，主要是利用渗透作用使农杆菌侵染幼苗，从而将外源基因携带至棉花中，进而在棉花中表达转入的基因。

总体而言，该方法具有成本低廉、操作方便、转化效率高等优点，可以为棉花中基因功能研究奠定方法学基础，同时也可为棉花功能基因在棉花中的亚细胞定位和相互作用提供参考方法，因而具有较好的实用性和科研应用价值。

权利要求书1页说明书7页序列表2页附图3页CN 107858372 A 2018.03.30C N 107858372A1.一种农杆菌介导的棉花瞬时转化方法，其特征在于，具体包括如下步骤：（1）制备瞬时转化溶液将含有待转化基因的重组质粒转化农杆菌后，将重组的农杆菌在YEP液体培养基中摇瓶培养，培养结束后，离心、收集菌体，用重悬液重悬菌体，调整OD 600=0.8~1.0作为瞬时转化溶液；所述重悬液为1/2 MS溶液，其中含有150~170 μM乙酰丁香酮、2~4%（w/v ）蔗糖和0.01~0.02%（v/v ）的Tween20；（2）培养棉花幼苗，并进行高渗预处理将棉花种子播种后，取生长6~8天左右的棉花幼苗，清洗、消毒后，置于高渗液中进行高渗预处理；所述高渗液配方为：含乙酰丁香酮和蔗糖的1/2 MS溶液；（3）瞬时转化处理将步骤（2）中高渗处理后的幼苗放入步骤（1）中的瞬时转化溶液中浸渍培养；培养结束后，将转化后的幼苗清洗干净后，置于含有抗生素和0.8%（w/v ）琼脂粉的1/2 MS溶液中继续培养。

将目的基因导入棉花细胞的方法

将目的基因导入棉花细胞的方法嘿，咱今天就来聊聊把目的基因导入棉花细胞的那些事儿哈！你想想看，棉花那可是咱生活中常见的好东西呀，做衣服、被子都少不了它。

那要怎么让它变得更厉害呢，这就得靠把目的基因导进去啦！有一种方法就像是给棉花细胞送个特别的“包裹”，这就是农杆菌介导转化法。

农杆菌就像是个勤劳的小邮差，能把目的基因这个“宝贝包裹”准确地送到棉花细胞里。

它和棉花细胞接触后呀，就能神不知鬼不觉地把基因送进去，是不是很神奇呀！还有电击法呢，这就好比给棉花细胞来一场小小的“电击风暴”。

通过电击，让棉花细胞的大门打开那么一下下，目的基因就能趁机溜进去啦。

就好像是在棉花细胞的世界里突然闪过一道闪电，然后基因就进去啦！另外呢，还有基因枪法，这可厉害了。

就像是给棉花细胞来了一场“基因子弹雨”，把包裹着目的基因的小颗粒像子弹一样射向棉花细胞，然后这些基因就能在细胞里安营扎寨啦。

你说这多有意思呀，科学家们就像是一群神奇的魔法师，用各种奇妙的方法把目的基因导入棉花细胞，让棉花变得更优秀。

比如说，导入了抗虫基因的棉花，就不那么容易被害虫欺负啦，农民伯伯也能省不少心呢。

或者导入了一些能让棉花品质更好的基因，那做出来的衣服、被子不就更舒服啦？这就好像是给棉花这个“大宝贝”进行了一次特别的升级改造，让它拥有了更多的超能力。

那你想想，如果没有这些方法，我们怎么能让棉花变得这么厉害呢？这些方法就像是打开棉花新世界大门的钥匙呀！咱再回过头来看看这些方法，每一种都有它独特的魅力和作用。

农杆菌介导转化法的巧妙，电击法的直接，基因枪法的霸气，它们都在为了让棉花变得更好而努力呢。

所以说呀，这些将目的基因导入棉花细胞的方法可真是太重要啦！它们让棉花有了更多的可能性，也让我们的生活变得更加丰富多彩。

以后呀，说不定还会有更多更厉害的方法出现呢，那时候棉花又会变成啥样呢，真让人期待呀！这就是关于将目的基因导入棉花细胞的那些事儿，你懂了不？。

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目录摘要 (4)1 前言 (4)1.1植物转基因的意义 (4)1.2棉花转基因常用的方法 ............................. 错误！未定义书签。

1.2.1基因枪法 (5)1.2.2 PEG法 (5)1.2.3显微注射法、电击法及激光法 (5)1.2.4花粉管通道法 (6)1.2.5农杆菌介导法 (6)1.3植物耐盐相关的SOS2 基因 (9)1.3.1SOS2 基因的定位克隆 (9)1.3.2SOS2 编码一个假定的丝氨酸/ 苏氨酸蛋白激酶错误！未定义书签。

1.4农杆菌介导棉花的作用 (10)2 供试材料 ............................................................. 错误！未定义书签。

2.1棉花的胚性愈伤 ......................................... 错误！未定义书签。

2.2介导菌种 ..................................................... 错误！未定义书签。

3 方法与结果 ......................................................... 错误！未定义书签。

3.1实验方法 ..................................................... 错误！未定义书签。

3.1.1平板划线 ............................................ 错误！未定义书签。

3.1.2菌落PCR鉴定................................... 错误！未定义书签。

3.1.3小摇 .................................................... 错误！未定义书签。

3.1.4大摇 .................................................... 错误！未定义书签。

3.1.5集菌 (12)3.1.6重悬 .................................................... 错误！未定义书签。

3.1.7农杆菌侵染与共培养 ........................ 错误！未定义书签。

3.1.8抗性愈伤筛选 .................................... 错误！未定义书签。

3.2抗性愈伤组织的鉴定（结果） ................. 错误！未定义书签。

3.2.1愈伤组织DNA的提取 (14)3.2.2扩PCR与电泳分析........................... 错误！未定义书签。

4 农杆菌介导的讨论 (15)4.1植物受体因子与农杆菌间的作用机理 (15)4.2农杆菌菌株和质粒要求 ............................. 错误！未定义书签。

4.3 Ti载体容量 (16)5 结束语 (16)参考文献 (17)Abstract (19)致谢信 (20)农杆菌介导棉花转基因的方法左耳东（河南大学民生学院2008级生物技术专业开封475004）摘要：SOS2 基因编码一个446氨基酸的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶。

研究发现，拟南芥受盐胁迫时，质膜上钠氢转运蛋白SCaBP8蛋白的活性增强，受了SOS2磷酸化的调节，增加植株耐盐性。

本文通过GV3101农杆菌介导的转化方法，将SOS2基因转入棉花茎尖愈伤组织，繁育成苗，获得转基因棉花，以期熟练掌握农杆菌介导SOS2基因转入棉花愈伤组织的方法。

结果显示，通过农杆菌介导得到的抗性愈伤组织，经过提取DNA、PCR扩增、电泳分析，确定得到具有耐盐性基因的棉花愈伤组织，成功运用了农杆菌介导SOS2基因转入棉花愈伤组织。

关键词：棉花转基因农杆菌介导转化愈伤组织SOS2基因1前言1.1植物转基因的意义自从1984年首次获得转基因烟草[1]以来, 植物转基因技术日益得到广泛的应用, 它对于分子遗传学研究和植物改良都具有特别重要的意义。

在基础研究上, 对于植物基因的表达与调控、分子元件的鉴定与利用[2]等, 植物基因转化技术无疑是一个有利的研究工具在改良农艺性状上, 它可以大大缩短育种年限, 加快育种进程[3,4];更为重要的是,植物基因转化打破了物种间基因交流的界限, 目的基因的来源极为广泛, 不仅可以来自不同的植物物种, 还可以来自动物、微生物包括真菌等等。

多年以来, 人们一直利用它来改良植物的农艺性状, 如使植物获得抗病性、抗虫性、抗逆性以及提高产量、改善品质等等。

此外, 还有人利用转基因技术来创造雄性不育系[5]、生物反应器[4]等。

1.2棉花转基因常用的方法1.2.1基因枪法基因枪法，是1987 年由美国康奈尔大学的Sanford 提出的一种直接基因导入法,这种方法是借高速运动的金属粒将附着于其表面的核酸分子引入受体细胞,然后通过组织培养再生出完整植株。

由于基因枪法导入外源基因的技术本质上是一种物理过程,因此它具有不用原生质体再生培养、受体材料来源广泛、不受基因型限制、缩短了获得转基因植株的周期、获得的转基因植株变异率低、通常具有正常的育性等优点[6]。

但是基因枪法也有自身的缺点:转化效率不高,大多在0. 1～1. 0 %的范围内,难以选择;外源基因序列常是多拷贝插入,从而导致基因沉默;转入的基因有时是呈非孟德尔遗传; 费用较高等[7]。

1.2.2PEG法PEG法是一种通过化学物质PEG(聚乙二醇) 处理去壁的原生质体作为转化受体,改变细胞膜的通透性而使原生质体获得转化。

Krens等首次通过此法在烟草中获得成功。

但是此法具有明显的缺点:原生质体培养再生难度较大;受基因型限制;原生质体再生培养的转化植株变异率高,易产生白化苗;转化率低[7 ] 。

1.2.3显微注射法、电击法及激光法显微注射法(microinjection) 是用显微注射器将遗传物质注射到培养细胞中,通过组织培养最终获得转化植株。

此项技术起初主要应用于动物,八十年代中期开始应用于植物的遗传转化。

虽然该法具有DNA 注射的准确性、预见性、克服远源杂交的困难等优点,但其又有工作效率低、表达不稳定等缺点,故其应用受到了限制。

电击法(elect roporation) 是八十年代初发展起来的一种转化技术,首先在原生质体上运用此法将CAT 基因(氯霉素乙酰转移酶基因)转移到烟草、胡萝卜、玉米等植物的原生质体中并得以表达[8]。

此法的主要原理是在高压脉冲条件下,细胞膜上会出现瞬时可逆性开放小孔,为外源物质提供了通道,借此导入DNA 等遗传物质,达到转化的目的。

激光法同电击法类似,一定波长的激光聚焦后直径达0. 3～0. 5 微米时,高能量的激光束可引起细胞膜的可逆性穿孔,短时间内又可自动修复。

激光法和电击法均可用于双子叶和单子叶植物,转化受体材料广泛。

1.2.4花粉管通道法花粉管通道法(pollen - tube pathway) 又称子房注射法(overy injection) ,是将外源DNA 注入到子房中轴的胎座位置,经形成的花粉管胚囊,转化受精卵或胚细胞。

这是一种在整体植株水平上的转化方法,可使外源基因转移的操作直接在栽培作物上进行,免除了细胞和组织培养程序,并可直接获得转化的种子,开创了整株活体基因转化的新途径。

不过这种方法看似简单但操作要求极为严格[9]。

1.2.5农杆菌介导法农杆菌是一种革兰氏染色阴性菌,普遍存在于双子叶植物中。

农杆菌属共分为四个种,即根癌农杆菌、毛根农杆菌、放射性农杆菌、和旋钩子农杆菌。

目前研究较多的是根癌农杆菌(agrobac2terium tumefaciens AT) 和毛根农杆菌( agrobac2terium rhizogenes AR) ,它们都可以浸染植物细胞,但引起不同的病症,根癌农杆菌常引起植物近地面的根茎交界处形成帽状的肿瘤。

科学家们经过长期的研究发现,农杆菌中存在一种环状的、大小约150 ～200kb 的质粒( tumor2inducing plas2mid ,简称为Ti 质粒) ,植物肿瘤即是有Ti 质粒上的一段DNA 引起的,它通过特定的机制复制、切割、转移、整合到植物基因组中并表达,从而引起肿瘤的发生,这段DNA 称为T - DNA(t ransferredDNA)，是一种天然存在的遗传转化体系。

人们利用这种遗传转化体系将外源基因导入植物细胞,并利用植物细胞的全能性,通过组织培养,由一个细胞或一块组织再生成完整的转基因植株,此即农杆菌介导的遗传转化(agrobacterium2medi2ated t ransfermation)[9] 。

农杆菌Ti 质粒的T -DNA 中带有Onc基因(致癌基因) ,它在植物细胞内编码植物生长素和细胞分裂素,使受浸染的植物细胞不受限制地增殖而致瘤。

此外T - DNA还编码Opine 类化合物,作为农杆菌代谢的氮源和碳源。

Ti 上的T2DNA 是由两端两个不完整的25 个碱基对的顺向重复序列所界定,由于T -DNA 不含编码促使自身转移物质的基因,故可将其上的Onc基因及其它不必要的序列去掉,而插入要转化的目的基因序列,从而达到既不致使植物致瘤而又能改良植物的目的[9]。

自1983 年利用农杆菌转化获得首例转基因烟草以来,农杆菌介导的基因转化重要环节已形成了相当成熟的实验流程,在油料、糖料、纤维、花卉、果树、蔬菜、林木、谷类等植物中均获得了转基因植株。

据统计至今获得的转基因植株中80 %以上是农杆菌介导转化法获得的[8] 。

农杆菌转化的具体操作方法也多种多样,如直接感染植物伤口法、叶盘法、原生质体共培养法、真空容器中浸染完整植株[10]、愈伤组织共培养等。

由于单子叶植物不是农杆菌的天然寄主,农杆菌介导的遗传转化在水稻、小麦、玉米等主要农作物上的应用一度曾非常缓慢,但自1994 年首先在水稻上取得了重要突破以来[11],在小麦、玉米等粮食作物中相继取得了成功,显示了利用此法改良主要农作物品种的巨大潜力。

农杆菌介导法与其它方法相比较具有许多优点:操作简便不需特殊仪器,培养周期短;技术最成熟,转化效率高;外源基因多以单拷贝插入,稳定性好;可以利用不同的启动子控制目的基因在特定的器官进行特异表达;较少出现基因沉默现象[9 ,12 ];可将较大片段DNA 完整地转移到植物基因组中等[10 ,13]。

不过由于T - DNA 可以在植物染色体的任何区域内插入,就有可能导致有益基因的插入失活,因此外源基因插入问题尚有待于基因转移技术的进一步完善[12]。