酵母双杂交系统及其应用
酵母双杂技术的原理和应用
酵母双杂技术的原理和应用一、酵母双杂技术的原理酵母双杂技术是一种重要的基因工程技术，其原理主要包括以下几个方面：1.酵母双杂技术的基本原理：酵母双杂技术基于酵母细胞中的两种杂交酵母菌株，一种包含目标酵母蛋白的报告基因，另一种包含潜在的酵母互补DNA库。
通过把这两个酵母菌株共同培养在含有特定酵母蛋白诱导剂的培养基中，使得目标酵母蛋白和潜在互补DNA库中的DNA相互作用，从而筛选出与目标蛋白相互作用的DNA序列。
2.双杂交酵母菌株的构建：首先需要构建含有目标酵母蛋白的报告基因表达酵母菌株，该菌株会在酵母细胞中表达目标蛋白。
同时，还需要构建潜在酵母互补DNA库，该库中含有大量酵母基因组DNA片段的克隆。
3.酵母菌株的培养和筛选：将目标蛋白报告基因酵母菌株和酵母互补DNA库菌株共同培养在含有诱导剂的培养基中，诱导目标蛋白和潜在互补DNA库中的DNA发生相互作用。
然后利用适当的筛选方法，如抗生素抗性筛选或含有荧光素底物的筛选，筛选出与目标蛋白相互作用的克隆。
二、酵母双杂技术的应用酵母双杂技术广泛应用于生物医药、生物学研究等领域，具有多个重要的应用方面：1.蛋白相互作用的研究：通过酵母双杂技术，可以快速筛选出与目标蛋白相互作用的DNA序列，从而深入研究蛋白相互作用的机制和功能。
这对于揭示生物体内复杂蛋白相互作用网络、研究疾病相关蛋白相互作用具有重要意义。
2.新药靶点的发现：通过酵母双杂技术，可以筛选出与药物分子相互作用的蛋白，从而为新药靶点的发现提供候选蛋白。
这对于药物研发和临床治疗具有重要意义。
3.基因功能研究：通过酵母双杂技术，可以筛选出与目标基因相互作用的蛋白，从而推断目标基因的功能。
这有助于揭示基因的调控机制和功能。
4.疾病相关基因的筛选：通过酵母双杂技术，可以筛选出与疾病相关的基因，从而对疾病的发生机制和治疗提供有价值的信息。
5.基因治疗的研究：通过酵母双杂技术，可以筛选出与治疗目标相关的蛋白或基因，从而为基因治疗的研究提供候选靶点或治疗策略。
酵母双杂交酵母单杂交酵母三杂交课件
酵母单杂交系统的应用
寻找与特定DNA序列相互作用的蛋白质
01
通过将待研究的蛋白质与转录因子融合，可以筛选出与特定
DNA序列相互作用的蛋白质。
研究蛋白质的功能
02
通过分析蛋白质与DNA的相互作用，可以深入了解蛋白质的功
酵母杂交技术的发展趋势
操作简便化
随着技术的发展，酵母杂交技术 的操作将越来越简便，使得更多 的实验室和研究人员能够利用该
技术进行研究。
应用广泛化
随着研究的深入，酵母杂交技术 的应用范围将越来越广泛，不仅 局限于蛋白质之间的相互作用研 究，还可以应用于转录因子活性
等方面的研究。
系统化与自动化
未来，随着技术的发展，酵母杂 交技术将逐渐实现系统化和自动 化，进一步提高实验的准确性和
该方法基于真核生物的转录调控机制，通过将两个蛋白质的 编码基因分别与酵母的转录激活因子基因GAL4的N端和C端 融合，形成两个融合蛋白，再观察这两个融合蛋白在酵母细 胞中的相互作用对转录的影响。
酵母双杂交系统的应用
基因表达调控研究
药物筛选
通过分析不同条件下蛋白质之间的相 互作用，了解相关基因的表达调控机 制。
酵母三杂交系统
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酵母双杂交的原理和应用
酵母双杂交的原理和应用前言酵母双杂交技术是一种常用的分子生物学实验方法，用于研究蛋白质间相互作用。
本文将介绍酵母双杂交的原理和应用，并详细说明相关实验步骤和注意事项。
一、酵母双杂交原理酵母双杂交利用酵母细胞中的转录因子来检测两个蛋白质是否发生相互作用。
该技术包括两个主要步骤：酵母杂交库的构建和蛋白质相互作用的检测。
1.酵母杂交库的构建–首先，需要构建一个酵母细胞库，其中包含目标蛋白的编码序列，以及与之它相互作用的蛋白编码序列。
–这些蛋白编码序列被插入一个特殊的酵母表达载体中，该载体包含一个转录因子启动子和一个可变启动子。
当目标蛋白与与之相互作用的蛋白结合时，转录因子被激活，并启动报告基因的表达。
2.蛋白质相互作用的检测–将酵母杂交库与一个可能与目标蛋白相互作用的蛋白质编码序列进行杂交。
–利用筛选或选择的方法，检测是否存在转录因子的激活，从而判断蛋白质是否发生相互作用。
二、酵母双杂交的应用酵母双杂交技术在生物学研究中有广泛的应用，主要用于以下方面：1.蛋白质相互作用的筛选–酵母双杂交可以用于大规模筛选蛋白质间的相互作用。
通过构建酵母杂交库，并与目标蛋白进行杂交，可以鉴定潜在的相互作用蛋白，从而探索蛋白质间的相互作用网络。
2.功能区域的鉴定–通过酵母双杂交，可以鉴定特定的蛋白质功能区域。
例如，在研究某个转录因子的结构和功能时，可以利用酵母双杂交技术识别其与其他蛋白质相互作用的功能区域。
3.药物靶点的鉴定–酵母双杂交可以用于鉴定药物的靶点。
通过与已知药物相互作用的酵母杂交库进行筛选，可以发现与特定药物相互作用的蛋白质，进而确定药物的作用机制和潜在靶点。
4.疾病相关基因的鉴定–酵母双杂交还可以用于鉴定疾病相关基因。
通过与疾病相关蛋白相互作用的酵母杂交库进行筛选，可以发现与疾病发生发展相关的基因，从而揭示疾病的发病机制。
三、酵母双杂交实验步骤酵母双杂交实验包括以下步骤：1.构建酵母杂交库：–从样品中提取RNA或DNA片段；–将片段克隆到酵母表达载体中；–将载体转化至酵母细胞中。
酵母双杂交系统原理的应用
酵母双杂交系统原理的应用1. 什么是酵母双杂交系统酵母双杂交系统是一种常用的方法，用于检测蛋白质之间的相互作用。
这个系统利用酵母细胞中的转录因子和报告基因来实现。
当两个蛋白质相互作用时，可以触发报告基因的表达，从而显示出它们之间的相互作用。
2. 酵母双杂交系统的原理酵母双杂交系统的原理主要基于透明质酸选择活化子（activation domain）和DNA 结合结构域（DNA-binding domain）相互作用。
这种相互作用会激活基因的表达，从而触发报告基因的产生。
酵母细胞中通常包含两个重要的部分：转录因子DNA 结合结构域（DBD）和活化因子 DNA 结合结构域（AD）。
•转录因子 DNA 结合结构域（DBD）：该结构域能够识别和结合目标DNA序列，从而调控基因的转录。
•活化因子 DNA 结合结构域（AD）：该结构域能够激活特定的报告基因的表达。
当两个蛋白质相互作用时，将目标蛋白质的DBD域与AD域融合到一个融合蛋白中。
当这个融合蛋白与另一个蛋白质结合时，就会形成一个激活结构，从而使报告基因得以表达。
3. 酵母双杂交系统的应用酵母双杂交系统在生物学研究中应用广泛。
以下列举了一些常见的应用领域：3.1. 蛋白质-蛋白质相互作用的研究利用酵母双杂交系统，研究人员可以快速筛选并确认蛋白质与蛋白质之间的相互作用关系。
通过构建大规模的蛋白质库，可以鉴定出蛋白质与蛋白质之间的相互作用网络。
这有助于理解蛋白质相互作用对于细胞的功能和调控的作用。
3.2. 蛋白质-小分子相互作用的筛选酵母双杂交系统也可以用于筛选蛋白质与小分子之间的相互作用。
研究人员可以将小分子与AD结构域融合，并与目标蛋白质库进行酵母双杂交筛选。
这有助于发现新的药物靶点，并加速新药的开发过程。
3.3. 酵母基因组互作网络的构建通过酵母双杂交系统研究蛋白质与蛋白质之间的相互作用，可以构建酵母基因组互作网络。
这个网络可以用来预测蛋白质功能、发现新的互作关系，并帮助研究人员理解细胞的调控机制。
酵母双杂交的原理及其在分子生物学研究中的应用。
酵母双杂交的原理及其在分子生物学研究中的应用。
酵母双杂交是一种重要的分子生物学技术，可用于研究蛋白质相互作用、酵母遗传学以及药物筛选等领域。
本文将分为两个部分，首先介绍酵母双杂交的原理和方法，然后探讨其在分子生物学研究中的应用。
一、酵母双杂交的原理和方法酵母双杂交技术是通过构建一个人工的酵母表型来研究蛋白质间相互作用的技术。
其基本原理是利用转录因子的激活域和DNA结合域分离为两半，并将这两半与待测蛋白结合，从而使转录因子重组并激活报告基因的表达。
具体而言，酵母双杂交实验需要构建三个关键的DNA重组元件：酵母表达载体、效应报告基因和测试蛋白质。
1.1 酵母表达载体：酵母表达载体是一个质粒，其中包含两个重要的部分，即酵母选择性培养基选择基因和转录因子的激活域和DNA结合域。
1.2 效应报告的基因：效应报告基因可用于检测蛋白质相互作用的程度。
一般选择具有报告基因（如lacZ、GFP）的启动子和结构基因的基因组片段。
1.3 测试蛋白质：待测蛋白质需要与转录因子的激活域和DNA结合域相互作用。
测试蛋白可以来自多种来源，如细菌、动物或植物。
在酵母双杂交实验中，测试蛋白质片段被融合到转录因子激活域的N端，而其他可能相互作用的蛋白质片段被融合到DNA结合域的C端。
当这两个蛋白质结合后，转录因子就会再组装成一个功能完整的转录因子，从而激活效应报告基因的表达。
可以通过测定报告基因的表达水平来推测蛋白质之间的相互作用程度。
二、酵母双杂交在分子生物学研究中的应用2.1 研究蛋白质相互作用：酵母双杂交是研究蛋白质-蛋白质相互作用的重要工具。
通过构建不同蛋白质的基因库，可以筛选出与待测蛋白质相互作用的蛋白质，进而揭示细胞内蛋白质网络的结构和功能。
2.2 酵母遗传学研究：酵母双杂交还可以用于酵母遗传学的研究。
通过构建与酵母突变株相互作用的蛋白质基因库，可以筛选出与突变株互补的基因，从而揭示酵母基因功能和调控网络。
2.3 药物筛选：酵母双杂交技术可以应用于药物筛选，特别是针对蛋白质相互作用靶点的药物开发。
酵母双杂交技术
酵母双杂交常规技术一．双杂交系统原理及应用范围蛋白质之间的互作是很多反应机制分子水平的核心动作，如DNA合成、转录激活、蛋白质翻译、蛋白质定位和信号转导等所有的的反应的完成都涉及到蛋白质复合体的作用。
而随着酵母双杂系统的成熟和完善，其在蛋白质互作研究中的应用越来越广泛。
酵母双杂交系统是基于转录因子的典型结构特征所建立的，它利用了酵母的转录因子GAL4基因产物，该蛋白拥有两个典型的转录因子结构域DNA结合结构域（BD）与转录激活结构域（AD）。
前者结合GAL1启动子区的DNA序列，后者则激活转录（Fields and Song，1989）。
Fields和Song分别构建了含有含有编码GAL4 DNA结合结构域（GAL4BD）和GAL4转录激活结构（GAL4AD）序列的载体。
将我们所要研究的目的基因分别装载到这两个质粒载体中，两个结构域序列则分别与基因的ORF进行融合。
当转入相应酵母菌株后，若在酵母内表达的不同蛋白发生互作，则将使GAL4-BD和GAL4-AD相互靠近结合，再进一步与上游激活序列结合，激活相应报告基因（report gene）的表达。
特点与优点酵母双杂交系统的最主要的应用是快速、直接分析已知蛋白之间的相互作用及分离新的与已知蛋白作用的配体及其编码基因。
酵母双杂交系统检测蛋白之间的相互作用具有以下优点：（1）作用信号是在融合基因表达后，在细胞内重建转录因子的作用而给出的，省去了纯化蛋白质的繁琐步骤。
（2）检测在活细胞内进行，可以在一定程度上代表细胞内的真实情况。
（3）检测的结果可以是基因表达产物的积累效应，因而可检测存在于蛋白质之间的微弱的或暂时的相互作用。
（4）酵母双杂交系统可采用不同组织、器官、细胞类型和分化时期材料构建cDNA文库，能分析细胞浆、细胞核及膜结合蛋白等多种不同亚细胞部位及功能的蛋白。
局限性和存在的问题酵母双杂交系统是分析蛋白-蛋白间相互作用的有效和快速的方法，有多方面的应用，但仍存在一些局限性。
酵母双杂交的原理及其应用
酵母双杂交的原理及其应用
酵母双杂交是一种常用的蛋白质相互作用研究技术，通过构建酵母中的两个蛋白质相互作用所需要的分子间的结合，结合情况可以检测相互作用的程度或强度。
酵母双杂交的原理是基于兰伯特-贝尔特微分方程（Lambert-Beer-Bouguer Law），该方程描述了光强与溶液中物质的浓度之间的关系。
在双杂交中，一对目标蛋白质分别与两个不同的报告蛋白质（通常是启动子与其相应的转录激活因子）结合，形成一个蛋白质复合物。
当这两个蛋白质相互作用时，可以观察到报告蛋白质转录水平的上升。
酵母双杂交的应用广泛，可以用于以下方面：
1. 识别蛋白质-蛋白质相互作用：通过构建大规模的蛋白质相互作用图谱，可以帮助研究人员理解细胞内蛋白质相互作用网络的组织和功能。
2. 确定蛋白质结构和功能：通过和其他蛋白质的相互作用，可以获得相关蛋白质的结构和功能信息。
3. 寻找药物靶点：酵母双杂交可以用于筛选潜在的药物靶点，从而帮助药物研发。
4. 研究疾病机制：通过了解蛋白质之间的相互作用，可以揭示疾病的发生机制，
为疾病的治疗提供新的思路和方法。
总的来说，酵母双杂交技术是一种有效的方法，可以用于研究蛋白质相互作用和功能，对于生命科学研究具有重要的意义。
酵母双杂交系统及其应用
酵母双杂交系统及其应用Yeast Two-hybrid System and Its Application1.酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的生物学特性（1）单细胞真核生物尽管酵母细胞比较简单，但它们具有所有真核生物细胞的主要特征，如含有一个独立的细胞核、多条线性染色质包装成染色体、细胞质包含了全部的细胞器和细胞骨架结果（如肌动蛋白纤维）。
（2）与其它真核生物相比，它们的基因组较小，基因数目也较少；1996年已完成酵母全基因组测序（1.5 x 107 bp），是第一个被测序的真核生物。
大约有6000个基因。
目前已经建立了一个6000个菌株的文库，每一个菌株中只删除了一个基因。
其中5000多株在单倍体状态时能够存活，表明大多数酵母基因时非必需的。
（3）易于培养和操作,可以在实验室快速繁殖在指数生长期每90分钟繁殖一代，从单个细胞可以繁殖称克隆群体。
（4）单倍体和双倍体的存在使酿酒酵母便于进行遗传分析酿酒酵母可以以单倍体状态和双倍体状态生长。
单倍体和双倍体之间的转换是通过交配和孢子形成来实现的。
有两种单倍体细胞类型，分别为a型和α型。
在一起生长时，这些细胞因交配而形成a/α双倍体细胞。
在营养匮乏时，a/α双倍体发生减数分裂，产生一个子囊的结构，每个子囊含有4个单倍体孢子（两个a－孢子和两个α－孢子）。
但当生长条件改善时，这些孢子可以出芽并以单倍体细胞的形式生长或交配而重新形成双倍体。
一个酵母细胞可同时兼容几种不同质粒bud，芽, 蓓蕾starvation，饥饿, 饿死ascus，n.[微生物]子囊meiosis，n.减数分裂, 成熟分裂haploid，n.[生物]单倍体, 仅有一组染色体的细胞adj.单一的diploid，adj.双重的, 倍数的, 双倍的n.倍数染色体ascospore，n.[植]囊孢子rupture，v.破裂, 裂开, 断绝(关系等), 割裂。
n.破裂, 决裂, 敌对, 割裂spore，n.孢子vi.长孢子germinate，v.发芽, 发育, 使生长酿酒酵母生活周期2 酵母双杂交系统的原理蛋白质的相互作用是生命活动的基础，一切生命活动几乎都是通过蛋白质之间的相互作用而实现的。
酵母双杂交检测（Yeast
酵母双杂交检测（Yeast Two酵母双杂交检测（Yeast Two-Hybrid Assay）产品专题检测原理：酵母双杂交系统（Yeast two-hybrid assay）是⽤于体内研究蛋⽩相互作⽤的⼀种⾮常便利的⼯具，常⽤的如GAL4为基础的系统，使⽤酵母转录因⼦GAL4来检测转录激活后的蛋⽩相互作⽤。
某些转录因⼦（如GAL4）由两个可以分开，功能上相互独⽴的结构域组成，N端有⼀个147个氨基酸组成的DNA结合域（DNA binding domain，BD），C端有⼀个由113个氨基酸组成的转录激活域（transcription activation domain，AD）。
BD可以和上游激活序列（UAS）结合，⽽AD能激活UAS下游基因进⾏转录。
单独的BD或AD不能激活基因转录，两者只有通过某种⽅式结合在⼀起形成完整的转录激活因⼦的功能【见图1】。
酵母双杂交系统主要利⽤酵母GAL4的这个特性通过两个杂交蛋⽩在酵母细胞中的相互结合及对报告基因的转录激活来研究活细胞内蛋⽩质的相互作⽤，对蛋⽩质之间微弱、瞬间的作⽤都能通过报告基因敏感的检测到。
酵母双杂交系统应⽤：1）对新的与已经蛋⽩相互作⽤的鉴定2）对预测蛋⽩相互作⽤的确认3）对蛋⽩相互作⽤区域的鉴定双杂交检测原理图。
两个蛋⽩分别表达，⼀个（诱饵蛋⽩bait protein）融合到Gal4 DNA 图1.双杂交检测原理图。
结合域表达，另⼀个（诱捕蛋⽩prey protein）融合到Gal4转录激活结构域（AD）表达。
在Y2HGold酵母菌株中，只有当两个蛋⽩之间相互作⽤并结合到Gal4反应性启动⼦上才能活化报告基因（AUR1-C, ADE2, HIS3, 和MEL1）的表达。
酵母双杂交系统重要元件介绍（以Matchmarker GAL4-based two hybrid assay为例）诱饵（the bait）⼀、⼀、诱饵（为了建⽴GAL4 DNA-BD/bait融合蛋⽩，推荐使⽤质粒pGBKT7；要调查三元蛋⽩复合物，推荐使⽤含2个MCS区域的三杂交载体，能表达GAL4 DNA-BD/bait融合蛋⽩和第⼆个感兴趣蛋⽩，在bait和prey蛋⽩之间发挥桥梁作⽤。
酵母双杂交自激活
蛋白质相互作用在细胞生物学和疾病中的作用。
此外，酵母双杂交系统还可以用于筛选新的药物靶点或鉴定新
03
的治疗策略。
酵母双杂交系统的优缺点
优点
酵母双杂交系统具有高灵敏度和特异性，能够检测到低亲和力的相互作用。此外 ，它还具有高通量和高可重复性的特点，可以同时检测多个蛋白质之间的相互作 用。
缺点
然而，酵母双杂交系统也存在一些局限性。例如，它可能受到酵母细胞内其他因 素的影响，导致假阳性结果。此外，由于酵母细胞与人类细胞存在差异，因此某 些在酵母细胞中检测到的相互作用可能无法在人类细胞中重现。
蛋白质的相互作用可以通过多种方式进 在酵母双杂交实验中，了解蛋白质之间 行，例如通过蛋白质的直接接触或通过 的相互作用有助于预测自激活的可能性， 与它们相关的其他分子之间的相互作用。 并采取措施避免或减少这种现象的发生。
基因表达水平的影响
基因表达水平对酵母双杂交自激活也有重要影响。当一个基因的表达水平过高时， 它可能会产生过多的蛋白质，导致自激活。
2
该系统基于两种基本的酵母转录因子，即GAL4 和STE12，它们可以分别与DNA结合并激活转录。
3
当一个转录因子与另一个转录因子结合时，它们 可以形成一个杂合二聚体，从而激活转录。
酵母双杂交系统的应用
01
酵母双杂交系统被广泛应用于研究蛋白质之间的相互作用，特 别是在信号转导和转录调控领域。
02
它可以帮助科学家确定蛋白质相互作用的结构基础，以及研究
酵母双杂交自激活
目录
• 酵母双杂交系统简介 • 酵母双杂交自激活的发现与确认 • 酵母双杂交自激活的影响因素
目录
• 酵母双杂交自激活的调控策略 • 酵母双杂交自激活的实际应用 • 未来展望与研究方向
酵母双杂交的作用
酵母双杂交系统酵母双杂交系统酵母双杂交系统是在真核模式生物酵母中进行的，研究活细胞内蛋白质相互作用，对蛋白质之间微弱的、瞬间的作用也能够通过报告基因的表达产物敏感地检测得到，它是一种具有很高灵敏度的研究蛋白质之间关系的技术。
大量的研究文献表明，酵母双杂交技术既可以用来研究哺乳动物基因组编码的蛋白质之间的互作，也可以用来研究高等植物基因组编码的蛋白质之间的互作。
因此，它在许多的研究领域中有着广泛的应用。
1、利用酵母双杂交发现新的蛋白质和蛋白质的新功能酵母双杂交技术已经成为发现新基因的主要途径。
当我们将已知基因作为诱饵，在选定的cDNA文库中筛选与诱饵蛋白相互作用的蛋白，从筛选到的阳性酵母菌株中可以分离得到AD-LIBRARY载体，并从载体中进一步克隆得到随机插入的cDNA片段，并对该片段的编码序列在GENEBANK中进行比较，研究与已知基因在生物学功能上的联系。
另外，也可作为研究已知基因的新功能或多个筛选到的已知基因之间功能相关的主要方法。
例如：Engelender等人以神经末端蛋白alpha-synuclein 蛋白为诱饵蛋白，利用酵母双杂交CLONTECH MATCHMARKER SYSTEM 3为操作平台，从成人脑cDNA文库中发现了与alpha-synuclein相互作用的新蛋白Synphilin-1，并证明了Synphilin-1与alpha-synuclein 之间的相互作用与帕金森病的发病有密切相关。
为了研究两个蛋白之间的相互作用的结合位点，找到影响或抑制两个蛋白相互作用的因素，Michael等人又利用酵母双杂交技术和基因修饰证明了alpha-synuclein的1-65个氨基酸残基和Synphilin-1的349-555个氨基酸残基之间是相互作用的位点。
研究它们之间的相互作用位点有利于基因治疗药物的开发。
2、利用酵母双杂交在细胞体内研究抗原和抗体的相互作用利用酶联免疫（ELISA）、免疫共沉淀（CO-IP）技术都是利用抗原和抗体间的免疫反应，可以研究抗原和抗体之间的相互作用，但是，它们都是基于体外非细胞的环境中研究蛋白质与蛋白质的相互作用。
博士硕士研究生入学考试-细胞生物学-简答论述及参考答案
1.简述酵母双杂交系统原理及应用答：酵母双杂交系统（yeast two-hybrid system）是在酵母体内分析蛋白质-蛋白质相互作用的基因系统，也是一个基于转录因子模块结构的遗传学方法。
酵母双杂交系统的建立得力于对真核细胞调控转录起始过程的认识。
许多真核生物的转录激活因子都是由两个可以分开的、功能上相互独立的结构域(domain)组成的。
例如，酵母的转录激活因子GAL4，在N端有一个由147个氨基酸组成的DNA结合域(DNA binding domain,BD)，C端有一个由113个氨基酸组成的转录激活域(transcription activation domain,AD)。
GAL4分子的DNA结合域可以和上游激活序列(upstream activating sequence，UAS)结合，而转录激活域则能激活UAS下游的基因进行转录。
但是，单独的DNA结合域不能激活基因转录，单独的转录激活域也不能激活UAS的下游基因，它们之间只有通过某种方式结合在一起才具有完整的转录激活因子的功能。
酵母双杂交系统正是利用了GAL4的功能特点，通过两个杂交蛋白在酵母细胞中的相互结合及对报告基因的转录激活来捕获新的蛋白质。
2.miRNA、siRNA、dsRNA、shRNA的区别和联系答：miRNA，siRNA，dsRNA和shRNA都是RNA干扰技术中用到的小分子RNA，其不同之处在miRNA 是单链RNA，其余均为双链RNA；siRNA和dsRNA相似；shRNA需通过载体导入细胞后，然后利用细胞内的酶切机制得到siRNA而最终发挥RNA干扰作用。
3.试述磷酸酰肌醇双信号通路的基本内容及功能答：在这一信号转导途径中,膜受体与其相应的第一信使分子结合后，激活膜上的Gp蛋白(一种G蛋白),然后由Gq蛋白激活磷酸脂酶Cβ (phospholipase Cβ, PLC), 将膜上的脂酰肌醇4,5-二磷酸(phosphatidylinositol biphosphate, PIP2)分解为两个细胞内的第二信使：二酰甘油( diacylglycerol, DAG)和1,4,5-三磷酸肌醇(IP3)。
酵母双杂交系统-论文参考文献
酵母双杂交系统研究及其应用白玉杰综述药立波审校(第四军医大学生物化学及分子生物学教研室，西安710032)蛋白质是生命功能的物质基础，体内包括复制、转录、分泌、信号转导、代谢等多种生命活动都依赖于蛋白-蛋白、蛋白-核酸间的相互作用，对生命活动过程中蛋白质作用的研究有助于揭示生命过程的许多本质问题。
但由于蛋白质与其他生物大分子间作用依赖于细胞内环境，作用时间及作用力差异极大，因而传统生化方法受到较大限制，蛋白-蛋白及蛋白-核酸间作用的研究进展缓慢。
新兴起的双杂交系统应用有效的酵母遗传学方法分析蛋白间相互作用，能快速克隆编码与某一蛋白作用的配体蛋白的基因，得到广泛应用，在此基础上相继出现反向双杂交系统、三杂交系统等多种新技术，大大加速了此领域的研究。
一、酵母双杂交系统(一) 基本原理酵母双杂交系统由Fields和Song等首先在研究真核基因转录调控中建立 i 。
典型的真核生长转录因子，如GAL4、GCN4、等都含有二个不同的结构域: DNA结合结构域(DNA-binding domain)和转录激活结构域(transcription-activating domain)。
前者可识别DNA上的特异序列，并使转录激活结构域定位于所调节的基因的上游，转录激活结构域可同转录复合体的其他成分作用，启动它所调节的基因的转录。
二个结构域不但可在其连接区适当部位打开，仍具有各自的功能。
而且不同两结构域可重建发挥转录激活作用。
酵母双杂交系统利用杂交基因通过激活报道基因的表达探测蛋白－蛋白的相互作用。
主要有二类载体: a 含DNA -binding domain的载体; b 含DNA-activating domain的载体。
上述二类载体在构建融合基因时，测试蛋白基因与结构域基因必须在阅读框内融合。
融合基因在报告株中表达，其表达产物只有定位于核内才能驱动报告基因的转录。
例如GAL4-bd具有核定位序列(nuclear-localization sequence)，而GAL4-ad没有。
酵母双杂交技术的原理及应用
酵母双杂交技术的原理及应用酵母双杂交技术，听上去挺高级的名词对吧？别慌，其实它跟我们日常生活中的“拼爹”有点类似，不过它是在生物学里面玩的花样。
想象一下，你有两个朋友，想知道他们俩会不会成为超级好基友，那你可以用这个技术来一探究竟。
我们得有两种酵母，就像是两个潜在的基友候选人。
然后，我们给它们点刺激，让它们有机会结识、互动。
这个“刺激”就是让它们的基因混合在一起，看看能不能擦出什么火花。
这种技术背后的原理挺复杂，但想象成两个人打牌，要看看谁的牌更配对，就差不多了。
酵母也是，我们看它们的基因配对，看看哪些特征能够“一拍即合”。
而这个技术的应用可不少，不仅仅是让酵母们交朋友，还能帮助科学家们研究基因、了解生物的运作规律。
有了它，科学家们能够更准确地探索基因是如何影响生物性状的，就像解开谜题一样。
想象一下，如果你是一位厨师，你可能想知道为什么有些酵母可以让面包发得特别好吃，而有些却不行。
用这个技术，科学家们可以找出关键的基因，然后想办法让所有的面包都发得又快又好，那不就是个厨艺大咖吗？不过，别小看了这些酵母们，它们可是科学研究中的一把好手。
有了它们，科学家们能够在实验室里模拟各种情况，看看不同的基因组合会带来什么变化。
这就好像是一场“基因大混搭”，只不过最后得到的是科学数据，而不是时髦的搭配。
说到这些，我想起了一句俗语：“物以类聚，人以群分”。
这个技术就像是在研究生物界的“朋友圈”，看看谁跟谁更亲密、更默契。
也像是在研究生物界的“CP”配对，想知道哪些基因组合才是最佳拍档。
这个技术也有它的局限性。
酵母们虽然看起来基因搭配很好，但实际上在生活中却不一定能搭伙儿。
这就像是有些人看起来合得来，但真正相处起来可能却“水火不容”。
酵母双杂交技术不仅仅是一种实验方法，它还是科学探索的一把利器。
通过它，科学家们可以深入探索生物世界的奥秘，了解基因如何影响生物的种种特性。
就像探险一样，每次实验都是一次挖掘未知的冒险，不知道会有什么惊喜等着我们。
酵母双杂交系统(参考资料)
GENBANK序号 序号
NM_003282
P1 P5 P6 P1
16
800.000 700.000 β-G al Ac tivi ty ( Unit) 600.000 500.000 400.000 300.000 200.000 100.000 0.000 E1 E4 E8 E9 E11 E15 E17 E21 E22
10
11
以粒pGBT9-ERRα1/LBD的准备
DBD
LBD
PCR
ERRα1/LBD
13
14
2. 结果 2.1 酵母双杂交试验结果
A
A：在SD/-Leu/-Trp平板上接种的24个His+阳性克隆
B
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B：菌落滤膜影印后X-gal/Z 缓冲液显色法共有17个克隆在8h之内变蓝
克隆序号 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12. 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24
克隆编号 E1-3* E2-2 E2-5 * E4-1 * E8-1 * E9-3 * E10-2* E11-3 * E11-4 E12 -1 * E13-1 * E13-2 E14-1 * E15-3* E17-2* E17-3 E18-1* E18-2 E18-3 E20-5 * E21-3 E21-10 * E22-5 * E23-2 *
2
Yeast two-hybrid system:
a genetic assay for detecting protein-protein interactions
Regulation of gene expression in yeast
transcription activator
酵母双杂交技术的原理及其应用
酵母双杂交技术的原理及其应用1. 引言酵母双杂交技术是一种经典而常用的分子生物学技术，用于研究蛋白质间相互作用以及蛋白质与DNA或RNA的相互作用。
本文将介绍酵母双杂交技术的原理及其应用。
2. 原理酵母双杂交技术基于酵母细胞内的转录因子相互作用原理，利用酵母细胞内的转录活性来检测蛋白质间的相互作用。
其基本步骤如下：1.构建载体：将目标蛋白质的编码序列克隆到酵母双杂交载体中，该载体通常包含一个激活域和一个DNA结合域。
2.构建酵母菌株：将构建好的双杂交载体转化到酵母菌株中，产生转录因子的表达。
3.杂交实验：将两个不同的酵母菌株分别转化目标蛋白质的编码序列，使得两个蛋白质分别与激活域和DNA结合域相连。
4.检测蛋白质相互作用：利用报告基因检测酵母菌株中的转录活性，若目标蛋白质间存在相互作用，则报告基因被激活，并产生可观察的表型。
3. 应用3.1 蛋白质相互作用研究酵母双杂交技术广泛应用于研究蛋白质间的相互作用关系。
通过构建不同的载体和菌株，可以很方便地筛选和鉴定蛋白质相互作用的结构域和关键基序。
这有助于揭示蛋白质相互作用的机制和信号通路。
3.2 酶底物筛选酵母双杂交技术还可以用于酶底物的筛选。
通过将酶和可能的底物序列构建成双杂交载体，并转化到酵母菌株中，可以快速筛选出与酶底物结合的蛋白质。
这对于研究酶的底物特异性和酶促反应机理具有重要意义。
3.3 药物靶点筛选利用酵母双杂交技术，可以通过构建包含药物分子和可能的靶点蛋白质的双杂交载体，进行药物靶点的筛选。
这种方法可以高效地从大量的分子库中筛选出与药物相互作用的潜在靶点，对于药物开发具有重要意义。
3.4 蛋白质与DNA/RNA相互作用研究除了研究蛋白质间相互作用外，酵母双杂交技术还可以用于研究蛋白质与DNA/RNA的相互作用。
通过将DNA/RNA序列与目标蛋白质的编码序列构建成双杂交载体，并转化到酵母菌株中，可以检测蛋白质与DNA/RNA的相互作用，并进一步研究该相互作用的功能和调控机制。
酵母双杂交技术应用进展
酵母双杂交技术应用进展酵母双杂交技术是一种强大的生物技术方法，用于研究蛋白质之间的相互作用。
这项技术自20世纪80年代问世以来，已经广泛应用于基因功能研究、药物研发和生物技术应用等领域。
本文将介绍酵母双杂交技术的原理、应用进展及未来展望。
酵母双杂交技术是基于真核生物体内两个互补的转录因子，即GAL4和DBD-VP16，以及一个含有报告基因的载体穿梭质粒构建而成的。
在该技术中，一个转录因子（DBD-VP16）与一个诱饵蛋白结合，另一个转录因子（GAL4）与目标蛋白结合。
当诱饵蛋白与目标蛋白相互作用时，两个转录因子将形成一个复合物，该复合物将激活报告基因的表达。
通过检测报告基因的表达情况，可以确定蛋白质之间的相互作用。
基因功能研究酵母双杂交技术已成为研究基因功能的重要工具。
通过使用该技术，科学家们可以筛选出与特定基因相互作用的其他基因，从而揭示基因在细胞中的功能。
例如，一项研究发现人类肺癌细胞中抑癌基因TP53的相互作用蛋白，从而为肺癌治疗提供新的思路1。
在药物研发方面，酵母双杂交技术也发挥了重要作用。
通过该技术，科学家们可以筛选出能够与特定药物靶点相互作用的小分子化合物，从而发现新的药物候选。
例如，利用酵母双杂交技术成功发现了一种能够抑制乳腺癌细胞增殖的新药候选2。
酵母双杂交技术在生物技术应用方面也具有广泛的应用价值。
例如，利用该技术成功克隆了一个编码具有工业应用价值的酶的基因，并实现了该基因的高效表达3。
酵母双杂交技术还被用于构建具有重要应用价值的基因调控网络。
随着基因组学、蛋白质组学和代谢组学等研究的深入发展，酵母双杂交技术的应用前景将更加广阔。
在基因组学领域，利用酵母双杂交技术可以揭示基因之间的相互作用和调控关系，有助于深入理解生命活动的复杂性。
在蛋白质组学领域，酵母双杂交技术可以应用于蛋白质相互作用的研究，为揭示生物学过程和疾病机制提供有力支持。
在代谢组学领域，酵母双杂交技术可以帮助研究代谢物之间的相互作用和调控机制，为代谢调控和代谢性疾病研究提供新的视角。
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酵母双杂交系统及其应用Yeast Two-hybrid System and Its Application1. 酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）的生物学特性（1）单细胞真核生物尽管酵母细胞比较简单，但它们具有所有真核生物细胞的主要特征，如含有一个独立的细胞核、多条线性染色质包装成染色体、细胞质包含了全部的细胞器和细胞骨架结果（如肌动蛋白纤维）。
（2）与其它真核生物相比，它们的基因组较小，基因数目也较少；1996 年已完成酵母全基因组测序（1.5 x 10 7 bp ），是第一个被测序的真核生物。
大约有6000个基因。
目前已经建立了一个6000 个菌株的文库，每一个菌株中只删除了一个基因。
其中5000 多株在单倍体状态时能够存活，表明大多数酵母基因时非必需的。
（3）易于培养和操作,可以在实验室快速繁殖在指数生长期每90 分钟繁殖一代，从单个细胞可以繁殖称克隆群体。
（4）单倍体和双倍体的存在使酿酒酵母便于进行遗传分析酿酒酵母可以以单倍体状态和双倍体状态生长。
单倍体和双倍体之间的转换是通过交配和孢子形成来实现的。
有两种单倍体细胞类型，分别为a 型和α型。
在一起生长时，这些细胞因交配而形成a/ α双倍体细胞。
在营养匮乏时，a/ α双倍体发生减数分裂，产生一个子囊的结构，每个子囊含有4 个单倍体孢子（两个a－孢子和两个α－孢子）。
但当生长条件改善时，这些孢子可以出芽并以单倍体细胞的形式生长或交配而重新形成双倍体。
一个酵母细胞可同时兼容几种不同质粒bud，芽, 蓓蕾starvation ，饥饿, 饿死ascus，n.［微生物］子囊meiosis，n.减数分裂, 成熟分裂haploid，n.［生物］单倍体, 仅有一组染色体的细胞adj.单一的diploid ，adj.双重的, 倍数的, 双倍的n.倍数染色体ascospore，n.［植］囊孢子rupture，v.破裂, 裂开, 断绝（关系等）, 割裂。
n.破裂, 决裂, 敌对, 割裂germinate，v.发芽, 发育, 使生长spore，n.孢子vi. 长孢子酿酒酵母生活周期2 酵母双杂交系统的原理蛋白质的相互作用是生命活动的基础，一切生命活动几乎都是通过蛋白质之间的相互作用而实现的。
在生物体发育的不同阶段，细胞分裂、分化的不同时期，都离不开蛋白质间的相互作用。
酵母双杂交系统是一种采用分子遗传学手段、通过鉴定报告基因的转录活性检测蛋白质－蛋白质相互作用的方法。
Y2H 是由纽约州立大学的Stanley Fields 于1989 年首先创立的。
转录激活因子在结构上是组件式的(modular) ,即这些因子往往由两个或两个以上相互独立的结构域构成。
DNA 结合结构域(DNA binding domain, DB)转录激活结构域(activation domain, AD)例如，酵母转录子Gal4分子由一条多肽链组成，含有881个氨基酸。
它有两个结构域：DNA 结合结构域( DNA binding domain, DB )由位于N- 末端1~147 个氨基酸构成，能识别效应基因的上游激活序列( UAS, upstream activating sequence ) ,此外，在其N- 端还具有一段核定位序列；转录激活结构域( activation domain, AD )由位于C-末端的768~881 位氨基酸构成。
当Gal4 的两个结构域位于不同肽链上，只要它们在空间上充分接近，则能够恢复Gal4 作为转录因子的活性。
Fields 等将Snf1 与DB 融合，Snf4 与AD 融合，构建在穿梭质粒上。
其中，Snf1 是一种依赖于丝氨酸、苏氨酸的蛋白激酶，Snf4 是它的一个结合蛋白。
研究者将两种穿梭质粒转化酵母GGY: 171 菌株，该菌株含有LacZ 报告基因，并已去除相应转录因子基因。
该实验的结果表明由Snf1 和Snf4 相互作用使得AD 和BD 在空间上接近，激活了报告基因LacZ 的转录。
一般地，将DB-x 的融合蛋白称作诱饵(bait) , X 往往是已知蛋白; AD-Y 称作猎物(prey) ,Y 称作猎物;整个实验过程称作“狩猎” ( hunt或fish) 。
3 酵母双杂交系统的应用目前,在许多具有国际水准的实验室中, 酵母双杂交系统及其衍生方法已成为研究蛋白质相互作用的首选方法, 而且利用它已揭示了大量未知蛋白质的相互作用。
据对文献的统计, 目前已知的蛋白质相互作用至少有一半是通过酵母双杂交实验发现的。
鉴定两种已知蛋白之间有无相互作用鉴定已明确有相互作用蛋白质发生作用所必需的的结构域及特定氨基酸的改变对相互作用的影响寻找与某一特定蛋白质有相互作用的蛋白质蛋白质相互作用图谱的绘制随着基因组研究计划的发展，以及mRNA 在不同组织器官及不同发育阶段的表达图谱的构建(body map) ，蛋白质在不同时空状态下相互作用图谱 (即基因组蛋白连锁图谱Genome Protein Linkage Map )。
的构建也逐渐展开。
在双杂交系统的BD 及AD 均接上cDNA 库，让它们随机表达蛋白，这样检测报告基因表达的可能是A-B ，B-C ⋯等一系列崭新的蛋白一蛋白相互作用，据此可以绘出A → B→C 的蛋白联系图谱。
Fromont-Racine 等采用了相互作用结合技术(interaction mating strategy) ，将BD- 诱饵蛋白质(X) 与AD －基因组文库(Y) 分别转化两种不同交配型单倍体酵母菌株，使两者在滤膜上结合，然后涂布于选择培养基上，挑选出阳性克隆作为诱饵蛋白质进行第二轮筛选。
该方法省去了利用二倍体菌株表达时筛选过程中繁琐的交叉影印以及大量培养皿的使用，并可以显著地提高效率。
研究蛋白质－蛋白质相互作用的方法有Western blotting 、免疫沉淀法、噬菌体展示技术。
4 Y2H 的优点1.酵母双杂交体系研究蛋白一蛋白相互作用的整个过程只对核酸进行操作，充分利用了成熟的核酸技术和酵母这一快速方便的操作体系，使得实验简单易行。
现已发展出酵母双杂交体系的商品试剂盒和相应的cDNA 库。
2. 可以直接从基因文库中寻找编码相互作用蛋白的DNA 序列，而不需要分离纯化蛋白。
3. 可以研究蛋白之间的弱相互作用。
在细胞内，弱相互作用与强相互作用一样起着极其重要的生物学作用。
免疫沉淀法以及近来发展起来噬菌体展示技术要求蛋白一蛋白相互作用强度足够大，而不能检测蛋白之间的弱相互作用。
酵母双杂交体系中蛋白一蛋白相互作用发生在酵母细胞这一自然的状态下，使得该方法的灵敏度很高。
4. 检测在活细胞内进行,可以在一定程度上代表细胞内的真实情况。
5 Y2H 的局限性。
报告基因的转录发生在细胞核内首先，报告基因的转录发生在细胞核内，这要求两种杂交体蛋白都必需能进入核中，因此一些不容易进入核的蛋白就不适合用该体系进行研究。
为了拓展其应用范围，近来发展的一些载体在融合蛋白中加入了蛋白质核定位序（nuclear localization sequaence,NLS），部分解决了这个题。
已成功地在该体系中研究过的蛋白除了许多核蛋白（如转录因子）外，还包括许多细胞浆、细胞膜以及线粒体蛋白。
但对于发生在细胞质中或者细胞膜上的蛋白质相互作用是检测不到的。
有一些蛋白不适于用该体系但是，还有一些蛋白不适于用该体系。
如需要翻译后修饰（磷酸化或糖基化）才能起相互作用的蛋白不能直接用该体系进行研究。
因为在酵母中不一定会产生与高等动植物细胞内一样的翻译后修饰。
要研究这样的相互作用，必需对该体系加以改造。
另外有一些蛋白与DNA 结合结构域融合后，在没有转录激活杂交体蛋白存在的情况下也能激活报告基因的转录。
这些蛋白往往本身含有转录激活结构域或类似的结构域。
这样的蛋白需要经过改造，去掉它们的转录激活能力后才能用该体系研究。
有些蛋白杂交体对酵母细胞的正常功能有影晌，有的甚至是致死性的，这样的蛋白也无法在该体系中研究。
假阳性一个值得注意的问题是筛库过程中出现的假阳性问题。
虽然现有的体系都用两个报告基因进行双重筛选，但假阳性问题仍然存在。
一种假阳性是由于转录激活杂交体中的库蛋白本身是参与转录的蛋白，即使在DNA 结合域杂交体不存在的情况下，转录激活杂交体自身就能激活报告基因的转录，表现为阳性。
因此在筛选出阳性克隆后，需要用回收的转录激活域杂交体质粒单独转化酵母，以判定克隆是否为假阳性克隆。
另一类假阳性是在DNA 结合域杂交体存在下表现为阳性，但对DNA 结合域杂交体没有特异性，不相关的DNA 结合域杂交体与其共转化酵母时也表现为阳性。
在筛选出阳性克隆后，应将转录激活域杂交体同一些不相关的DNA 结合域杂交体一起转化酵母，以排除这类假阳性克隆。
Harper 等利用酵母交配发展一种快速检别这类假阳性的方法。
其大致过程是: 让阳性克隆在一定的选择培养基上生长使其失去DNA 结合域杂交体质粒，只剩下转录结合域杂交体质粒，然后与不同性别的含有与该蛋白无关的DNA 结合域杂交体的酵母交配，从形成的二倍体酵母是否表现为阳性判定原来的克隆是否为假阳性克隆。
而不需要提取回收阳性克隆的转录激活杂交体质粒，再与无关的DNA 结合域杂交体共转化酵母细胞这样一个繁琐的过程。
筛到的蛋白和另一类假阳性来自cDNA 库的构建。
可能cDNA 编码的某个蛋白的一部分能和目标蛋白起相互作用，而完整的蛋白则无法和目标蛋白结合;cDNA 库一般由Oligo-dT 或由随机引物合成。
随机引物构建的cDNA 库中DNA 的长度一般为几百bp，已将蛋白分成了多段，这样避免了一个蛋白内不同结构域间的相互影响，对用酵母双杂交体系进行筛库有利。
但这种库又可能使得原来在整个蛋白中不暴露的区域暴露，筛库时有可能将这样的区域筛出。
这样的假阳性需要用其它实验加以排除。
筛到的蛋白和目标蛋白的相互作用有可能是通过酵母的内源蛋白为介导产生的。
假阴性在酵母双杂交的应用中有时也会遇到假阴性现象。
所谓假阴性, 即两个蛋白本应发生相互作用,但报告基因不表达或表达程度甚低以至于检测不出来。
造成假阴性的原因主要有几方面:一、是融合蛋白的表达对细胞有毒性。
这时应该选择敏感性低的菌株或拷贝数低的载体。
二、是蛋白间的相互作用较弱, 应选择高敏感的菌株及多拷贝载体。
三、GAL4 和LexA 系统要求被测蛋白定位于细胞核，然而有些蛋白却有强疏水结构域，还有些蛋白携带定位于细胞其他细胞器的强信号，这样，涉及后2 类蛋白的相互作用在GAL4 和LexA 系统中就检测不到;四、GAL4 和LexA 系统依赖转录激活报告基因而检测蛋白相互作用，如果蛋白是抑制基因表达的，报告基因就不能被激活转录，双杂交系统就检测不到该蛋白相互作用了。