非水相生物催化

水在反应体系会发生分
配， 这种分配导致直接
以溶剂中的水含量计算 酶的结合水会出现误差，
以水活度计算才比较准
确。
三、水活度（activity of water）
1、定义：一定温度和压力下，体系中水的逸 度与纯水逸度之比； 用体系中水蒸汽压与相同条件下纯水蒸汽压之 比表示： Aw=P/Po
P：一定条件下体系中水的蒸汽压
有机介质中有两类水：结合水、游离水； 在结合水不变的条件下，体系含水量的变化对
酶催化活性影响不大；然而在一些体系中，溶 剂和底物性质对酶活力也有直接或间接影响。
为了排除溶剂对最适含水量的影响，Halling
建议用水活度（aw）描述有机介质中酶催化活 力与水的关系：
水在反应系统中的分配与平衡
利用基本理论来指导非水介质中酶催化反应 的研究和应用。
第二节 非水介质中酶的结构与性质
一、非水介质中酶的结构
（一）非水介质中酶的状态 固态酶（多）：包括冷冻干燥的酶粉或固定化 酶，它们以固定形式存在有机溶剂中。 可溶性酶：包括水溶性大分子共价修饰酶和非 共价修饰的高分子-酶复合物、表面活性剂-酶 复合物以及微乳液中的酶等。
正胶束体系
反相胶束体系
反相胶束：在与水不互溶的大量有机溶剂中，加入表 面活性剂后形成的油包水的微小水滴。
常用表面活性剂：AOT [丁二酸二（2-乙基）己酯磺酸钠]、 Tween 酶被限制在含水的微环中，而底物和产物可以自由进出胶 束。
小结
（二）气相介质的酶催化
指酶在气相介质中进行催化反应；适用范围：底物是气体或能转 化为气体的物质； 优点：某些酶在液相中使用受到一定限制，如酶和辅酶的操作不 稳定性，底物及产物的不溶性和酶的活性被产物抑制等，而气相 中的反应可以克服这些缺点。 气固相接触催化反应时将反应原料的气态混合物在一定温度、 压力下通过固体催化剂而完成的。
的速率和4-位上醇解的速率随溶剂疏水性变化而大不相同。
化学键选择性：
酶选择性的催化底物分子中化学性质不同的官
能团中某个基团。 如6-氨基-1-己醇的化学酰化反应中氨基的反 应性较羟基高而优先被酰化，但用黑曲霉脂肪 酶催化的结果却正好相反，即羟基占绝对优势， 这使得不用保护基而制备氨基醇单酸酯成为可 能。
一、非水介质中酶的结构
（二）活性位点和机制
在微水有机相中酶能够保持其整体结构的完整
性，酶活性部位与水溶液中的结构是相同的。 有机溶剂中酶反应机制与水溶液中的酶反应机 制相同。如在有机溶剂中的酶促转酯反应遵循 米氏方程；酶在有机溶剂中的最大催化活力对 应的pH也是酶在水溶液中的最佳pH.
（三）有机溶剂中酶分子的柔性
常用的有机溶剂有二甲基亚砜（DMSO）、二 甲基甲酰胺(DMF)、四氢呋喃(THF)、二噁烷、 丙酮和低级醇。
3、水- 有机溶剂两相系统
指由水和疏水性较强的有机溶剂组成的两相体系。疏水 性底物和产物溶解于有机相中，酶溶解于水相中。 由于双相体系中的酶催化反应是在水相中进行，必须保 证反应底物和产物在酶与两相之间又良好的质量传递条 件，因此振荡和搅拌将是该生物催化反应体系中最重要 的参数。
（三）超临界流体介质中的酶催化
如果达到特定的温度、压力，会出现液体与气体界面消 失的现象该点被称为临界点。超临界流体指温度和压力 超过临界点的流体。 常用的超临界流体有：CO2、氟利昂（CF3H）、 烷烃 类（甲烷、乙烯、丙烷）或无机化合物（SO2、N2O）。 酶在这些溶剂中就像在亲脂性有机溶剂中一样稳定。
三、水活度（activity of water）
3、水活度的调控
饱和溶液平衡法：将酶与盐的饱和溶液平衡， 含有底物的溶剂平衡至相同的水活度。
三、水活度（activity of water）
3、水活度的调控
高水合盐调节法：向干燥的反应体系中直 接加入一种高水和盐。如NaHPO4·12H2O 变为NaHPO4·2H2O时向反应体系释放水。
日本名古屋田野公司对硝基地平（1-取代的二 氢吡啶单酯或双酯）的研究。
假单胞菌脂肪酶催化二氢嘧啶二羧基酯类衍生 物选择性水解产生二羧酸单酯。相同酶在不同 有机溶剂体系中反应所得产物的构型相反。
2、酶的特异性发生变化
区域选择性：
指酶对底物分子中几个相同官能团中的一个具
有优先反应能力。
2-辛集-1,4-苯二酚二丁酸酯与醇的转酯化反应，1-位上被醇解
2、酶的特异性发生变化
对于一个给定的酶来说，选择性被看成是酶的 固有特性，要改变其选择性，就要改变酶分子 自身，比如通过定点突变。只要酶是在水中发 挥作用，或者说当反应介质固定不变时，这一 概念就是正确的。但当酶催化过程是在有机溶 剂中进行时，当从一个溶剂中换到另一种溶剂 中时，酶的各种选择性都会发生深刻的变化。
酶以冻干粉或固定化酶的形式悬浮于有机溶剂 中，在悬浮状态下进行反应。
水不互溶性有机溶剂通常是烷烃类、芳香族化 合物、卤代烃、醚等。
2、水互溶有机溶剂单相体系
是指由水和与水互溶的有机助溶剂（10~20%） 组成的反应体系，酶、底物、产物均能溶解于 该体系中。 主要适用于在单一水溶液中溶解度很低、反应 速度也很慢的亲脂性底物的生物转化。

猪胰脂肪酶催化三丁酸甘油酯转酯反应 过程中反应速度与水浓度之间的关系
水含量对酶的选择性的影响
Aw对酶的立体选择性也有影响。如皱褶假丝 酵母脂肪酶在有机溶剂正己烷中催化2-溴丙酸 酯生产R或S- 2-溴丙酸正丁酯。随着溶剂中水 含量的逐渐增加，酶的对映选择性显著增强。
三、水活度（activity of water）
由于CO2的临界温度比较低(304.1K),临界压力也不高
(7.38MPa),且无毒,无臭,无公害，所以在实际操作中 常使用CO2超临界流体。
四、非水相酶催化的主要研究内容
非水介质中酶学基本理论研究，包括酶学性质、 影响非水介质中酶催化的主要因素以及酶作用 动力学； 通过对酶在非水介质中结构与功能的研究，阐 明非水介质中酶的催化机制，建立和完善非水 酶学的基本理论
常使用的水不溶性溶剂有烃、醚、酯等。一般应用于强 疏水性的底物，如甾体类、脂类和烯烃类生物转化。
通过选择适当的有机溶剂以及适度的水相调节（如pH、 盐浓度）可以控制反应物在两相中的分配，进而缓解匀 相系统中底物或产物的抑制。
4、胶束和反相胶束体系
反相胶束体系是含有表面活性剂与少量水的有 机溶剂系统。 当体系中水浓度高于有机溶剂时，形成胶束的 极性端朝向外侧，有机溶剂被包在胶束内部， 称为正相胶束。当体系中水浓度低于有机溶剂 时，形成胶束的极性端朝向胶束中部，而非极 性端朝向胶束外侧，水被包在胶束的内部，称 为反相胶束。
第三节 有机溶剂对有机 介质中酶催化的影响
不同的酶所需求的必需水的量差别较大。如
每分子胰凝乳蛋白酶只需50分子的水，每分
子多酚氧化酶却需要350个水分子。
二、水对酶催化反应速度的影响
水使酶具有一定的柔性
无水时酶为绝对刚性，是没有活性的。有少 量水则柔性增加，活性恢复，水分增加到一定程 度后继续增加对活性的提高没有促进。 典型的非水酶体系中水含量通常＜0.1%，但 其微小差距会导致酶催化活力的较大改变。水影 响蛋白质结构的完整性、活性位点的极性和稳定 性。
（一）有机介质的酶催化
指酶在含有一定水的有机溶剂中进行催化反应。
1、水不互溶有机溶剂单相体系（微水有机介质 体系） 2、水互溶有机溶剂单相体系 3、水- 有机溶剂两相系统；
4、胶束和反相胶束体系
1、水不互溶有机溶剂单相体系 （微水有机介质体系）
是指用水不互溶有机溶剂（含量>98%）取代几 乎所有的水，微量水一部分为酶分子的结合水， 才能保证其空间构象和催化活性。
非水相生物催化
Enzymatic catalysis in Non-aqueous system
第一节 非水酶学概述（比较重要）
第二节 非水介质中酶的结构与性质（比较重要）
第三节 水对有机介质中酶催化的影响
第一节 非水酶学概述
传统观念认为酶只能在水溶液中发挥作用，而 一旦和有机溶剂接触则失去活性。有关酶的催 化理论是基于酶在水溶液中的催化反应建立起 来的。 但对于大多数有机化合物来说，水并不是一种 适宜的溶剂。许多有机化合物底物在水介质中 难溶或不溶。
第三节 水对有机介质中酶催化的影响
一、必需水- 水对酶分子空间构象的影响
维持酶分子完整空间构象所必需的最低水含 量称为必需水。 酶分子只有在空间构象完整的状态下，才具 有催化功能。在无水的条件下，酶的空间构象被 破坏，酶将变性失活。必需水是酶在非水介质中 进行催化反应所必需的，它会直接影响酶的催化 活性和选择性。
如猪胰脂酶、核糖核酸酶和α-凝乳蛋白酶在无水溶剂 中100°时的半衰期为数小时，在水中几秒钟内就完 全失活。如果 提高有机溶剂的含水量，酶的半衰期也 急剧地下降。因此，可以说疏水溶剂对酶基本上时惰 性的，与酶没有显著的相互作用。此外，水溶液引起 酶失活的另一个普遍原因——蛋白酶解，在有机溶剂 中也不可能发生。
在非水溶剂中酶所需的水能给予酶分子在构象
上有足够的柔性而使其具有催化活性。 酶分子的“紧密”和“开启”；两种状态处于 一个动态平衡，表现出一定柔性。 不同介质中酶活性中心的完整性相差不大，但 酶活力却相差4个数量级。因此认为酶分子的 动态变化很可能是主要因素。
刚性与柔性的动态平衡
紧密状态：取决于蛋白质分子内的氢键 溶液中水分子与蛋白质分子之间所形成的氢键 使蛋白质分子内氢键受到一定程度的破坏，蛋 白质结构变动松散，呈一种“开启”状态。
Po：相同条件下纯水的蒸汽压
水活度与溶剂极性大小无关，故采用水活度作参 数更确切。
三、水活度（activity of water）
2、水活度与酶的活性
酶活性与反应体系的Aw直接相关，如米黑 毛霉脂肪酶在Aw=0.55时，在不同极性的 溶剂中都表现出最高的酶活性，其中在正 己烷溶剂中活性最强，有机溶剂中过多的 水或过少的水都会影响酶活性。 水对非水相酶活力有影响，对立体选择性 有一定的调节作用。