八、鼠伤寒沙门氏菌回复突变试验
Ames试验
• 突变型菌株的某些特征有可能会在贮存过程中丢失或变异，所以 在Ames试验前必须对所有菌株进行基因型鉴定、自发回变数鉴 定及对鉴别性致突变物的反应鉴定。鉴定合格后才能用于试验， 否则应重新挑选菌种。
• Ames试验的方法分为点试验法、平板掺入法及预培养平板掺入
法。
B
8
应用
• 例如：用Ames试验检测食品添加剂、化妆品等的致突变性，由此推测其致癌
B
5
Ames试验原理
B
S9是什么
6
• 因为许多外源化学物是间接诱变剂，需经过代谢活化转变为亲电
子的终致突变物才能与DNA反应，引起突变。鼠伤寒沙门氏菌缺
乏哺乳动物的代谢酶，微量检测直接及间接诱变剂，在进行
Ames试验时，应分别进行不加及加代谢活化系统的检测。而在
生物体内参与代谢活化的主要酶系是混合功能氧化酶系，所以，
• 为使受试物在体外测试中受到同活体类似
的代谢活化作用，在试验中采用将哺乳动
物的肝细胞微粒体（微粒体酶）及受氢系
统一并加入培养基中，进一步提高实验方
法的灵敏度。
B
4
• 标准试验菌株（配套菌株）：有四种 • TA98 、TA97：检测移码突变 • TA100：检测碱基置换突变 • TA102：对醛、过氧化物及DNA交联剂较敏感 • 只要在一种试验菌株得到阳性结果，即认为受试物是致突变物。 • 只有在四种试验菌株得到阴性结果，才认为受试物是非致突变物。
• 该法适用于测试混合物，反映多种污染物的综合效应。是应用最
广泛的检测基因突变的体外试验。
B
3
实验原理
• 鼠伤寒沙门氏菌（Salmonella typhimurium）的组氨酸营养缺陷型（his－）菌 株，在含微量组氨酸的培养基中，除极少数自发回复突变的细胞外，一般只 能分裂几次，形成在显微镜下才能见到的微菌落。受诱变剂作用后，大量细 胞发生回复突变成野生型微生物，自行合成组氨酸，发育成肉眼可见的菌落。 据此来检定受试物是否具有致突变作用。
471472细菌回复突变试验
471 472 细菌回复突变试验（Bacterial Reverse Mutation Test）1受试物必备受试物的化学鉴定纯度（杂质）溶解特性pH（必要时）稳定性（包括受试物在赋形剂中的稳定性）熔点／沸点2 试验目的2.1目的和意义细菌回复突变试验利用鼠伤寒沙门氏菌和大肠杆菌需要某种氨基酸的菌株来检测点突变，涉及DNA的一个或几个碱基对的置换，插入或缺失。
此试验的原理是检测试验菌株已存在突变的回复，细菌恢复合成必需氨基酸的能力。
通过在缺乏受试菌株所需氨基酸的培养基上的生长来检测回复突变的细菌。
点突变是很多人类遗传病的原因，有很多证据表明在人类和试验动物肿瘤形成涉及体细胞癌基因和肿瘤抑制基因的点突变。
细菌回复突变试验是快速的、费用较低和较易进行的试验。
试验菌株具有一些使其对检测突变更为敏感的特征，如回复突变部位的反应性DNA 序列，增强细菌对大分子的通透性，DNA修复系统缺失或DNA易误修复过程增强。
试验菌株的特异性可为诱发突变的种类提供某些有用的信息。
2.2定义回复突变试验（reverse mutation test）：利用鼠伤寒沙门氏菌和大肠杆菌检测需要某种氨基酸的菌株（分别为组氨酸或色氨酸）成为不需要外源性供应氨基酸的菌株的突变。
碱基置换型致突变物（base pair substitution mutagens）：引起DNA中碱基改变的因子。
在回复突变试验此改变可能发生在细菌基因组的原突变部位或另一个部位。
移码型致突变物（frameshift mutagens）：引起DNA中一个或多个碱基对增加或缺失，故改变RNA的读码框。
3测试原理细菌回复突变试验是利用原核生物（细菌）作指示生物的体外遗传毒理学试验，遗传学终点为基因突变。
（1）在有或无外源性代谢活化系统条件下，细菌悬浮液暴露于受试物。
在平板掺入法，细菌悬浮液与顶层琼脂混合，再立即铺至最低培养基上。
在预保温法，处理混合物经预保温后，与顶层琼脂混合，再立即铺至最低培养基上。
鼠伤寒沙门氏菌回复突变试验
五菌株鉴定和保存
四种标准试验菌株必须进行基因型鉴定、自发回变数鉴定及对鉴别性致突变物的反
应鉴定，合格后才能用于致突变试验。
1.菌株基因型鉴定
}I)组氨酸营养缺陷鉴定(组氨酸需求试验):
取两个底层培养基、其中一组于培养基表面涂加0. 1毫升0.
培养基成分或试剂除说明外，应是化学纯，无诱变性。避免重复高温处理，选择适当
保存温度和期限。
2.培养基制备_
C1)营养肉汤培养基
牛肉膏2. 5g
胰陈(或混合蛋白膝)5. 0g
氯化钠2. 5g
磷酸氢二钾(KZHPO}.3H20 ) }. . 3 g
蒸馏水至500mL
加热溶解，调pH至7. 4，分装后0. 103MPa 20min灭菌，4℃保存备用。C2}?营养肉汤琼脂培养基:
迅速混匀，倒在底层培养基上，转动平皿使顶层培养基均匀分布在底层上，平放固化，37艺培养拐介时观察结果。
二，点试法
在攻层培养平皿上写上记号。取已融化并在45℃水浴中保温的顶层培养基一管(2m } )，加
人是试菌菌涛}_ }h-(_pmt }}}}(} }3}r,，、。"} } }}二_;、}1} .,e} \}
肝S9液1. 0 mL
混匀，置冰浴待用。菌株及增菌培养
试验菌株
四
采用四株鼠伤寒沙门氏突变型菌株TA97, TA98, TA100和TA102 o TA97, TA98可检侧
移码型诱变剂:TA100可检测碱基置换型诱变剂;TAZOZ检出移码型和碱基置换型诱变剂。
这4种标准菌株除均有组氨酸突变(his)外还有一些附加突变，可以提高试验菌株对致突
鼠伤寒沙门氏菌试验(Ames试验)文献综述
文献综述：鼠伤寒沙门氏菌试验（Ames试验）摘要：食品安全无论如何怎样强调都不会过分，迅速而准确地检测致癌物质是食品安全问题的重要方面。
美国科学家Dr. Bruce Ames及其同事创立了一种方法，叫鼠伤寒沙门氏菌/哺乳动物微粒体酶试验（Ames试验），它是利用一组组氨酸营养缺陷型菌株加入待测物在有或没有微粒体活化系统条件下，发生回复突变的特征鉴定化学物质的诱变活性，现已成为初步筛选化学物潜在致突变的首选方法。
关键词：鼠伤寒沙门氏菌试验；基本原理；一般步骤；应用及其研究进展；1 前言污染物对人体的潜在危害，引起人们的普遍关注。
世界上已发展了百余种短期快速测试法，检测污染物的遗传毒性效应。
美国科学家Dr. Bruce Ames等经十余年努力，于1975年建立并不断发展完善的沙门氏菌回复突变试验（亦称Ames试验）已被世界各国广为采用。
该法比较快速、简便、敏感、经济，且适用于测试混合物，反映多种污染物的综合效应。
众多学者有的用Ames试验检测食品添加剂、化妆品等的致突变性，由此推测其致癌性；有的用Ames试验检测水源水和饮用水的致突变性（比如，美国派斯净水器就通过了Ames 试验），探索较现行方法更加卫生安全的消毒措施；或检测城市污水和工业废水的致突变性，结合化学分析，追踪污染源，为研究防治对策提供依据；有的检测土壤、污泥、工业废渣堆肥、废物灰烬的致突变性，以防止维系生命的土壤受致突变物污染后，通过农作物危害人类；检测气态污染物的致突变性，防止污染物经由大气，通过呼吸对人体发生潜在危害；用Ames 试验研究化合物结构与致变性的关系，为合成对环境无潜在危害的新化合物提供理论依据；检测农药在微生物降解前后的致突变性，了解农药在施用后代谢过程中对人类有无隐患；还有用Ames试验筛选抗突变物，研究开发新的抗癌药等等[1]。
2 定义2.1 回复突变（Reverse mutation）细菌在化学致突变物作用下由营养缺陷型回变到原养型(prototroph)。
微生物 遗传变异习题
遗传变异一、名词解释1、基因型2、表型3、突变4、突变型5、饰变6、普遍性转导7、转化8、细菌素9、抗生素10、突变率11、光复活作用12、准性生殖13、野生型14、原养型15、营养缺陷型菌株16、完全培养基17、补充培养基18、F+菌株19、F-菌株20、Hfr菌株21、F'菌株22、接合中断法二、填空题1、、和是证明核酸是遗传物质的三个经典实验。
2、细菌的质粒的种类很多，其中接合性质粒如，抗药性质粒如，产细菌素质粒如，诱癌质粒如，诱生不定根的质粒如，执行固氮功能的质粒如，降解性质粒如等。
3、细胞的平均突变率是。
4、选择性突变株可包括、和等，而非选择性突变株则可包括、和等。
5、、、、、和是基因突变的六个特点。
6、基因突变的自发性和不对应性曾有三个著名的实验予以证明，它们是、和。
7、点突变是由于碱基置换而引起的，和是两种具体机制。
8、诱发突变可分为三类，即、和。
9、紫外线对微生物的损伤，主要是产生，主要通过两种方式修复DNA的损伤，即和。
10、、、和是在DNA的切除修复中参与的四种酶；参与光复活作用的酶则仅有一种。
11、若利用紫外线诱变微生物，应在条件下进行操作，并在条件下培养。
12、常见的“三致”是指、和作用，是目前检出某试样是否有“三致”的简便快速高效的试验。
13、艾姆斯试验中用的菌种是，通过回复突变可以检测待测样品中的存在。
14、、和是与筛选营养缺陷型突变株有关的三类培养基。
15、与营养缺陷型有关的菌株有三种：从自然界分离到的任何菌种的原始菌株称为，该菌株经诱变剂处理后所发生的丧失某酶合成能力的菌株称为，若再经回复突变或重组后的菌株称为。
16、、、和是筛选营养缺陷型菌株的四个环节。
17、、、和是四种从混合菌液中检出营养缺陷型菌株方法。
18、普遍转导与局限转导的主要区别在于：第一，普遍转导噬菌体是属于噬菌体，而局限转导噬菌体属于噬菌体；第二，普遍转导噬菌体能转移供体菌的基因，而局限转导噬菌体只能转移供体菌的基因。
医疗器械管理-生物相容性检验要求及试验方法编写示例
生物相容性检验要求及试验方法编写示例北检所-生物相容性检验要求及试验方法编写示例为规范实施GB/T 16886系列等生物相容性评价标准，方便注册产品标准相关章节的编写，我所生物相容性检验室编写了生物相容性部分检验项目要求及试验方法的示例，供相关人员参考。
生物相容性试验要求常用试验项目：1.细胞毒性：细胞相对增殖率应不小于70%。
（采用GB/T16886.5-2017中MTT法时）细胞毒性应不大于X级。
（琼脂扩散法等的要求，企业根据自身产品性质和风险确定其级别的要求）2.皮内反应：试验样品与溶剂对照综合平均记分之差应不大于1.0。
3.迟发型超敏反应：应无迟发型超敏反应。
其它试验项目刺激试验分类：4．原发性皮肤刺激：原发性皮肤刺激指数应不大于0.4。
5．阴道刺激：刺激指数应不大于4（极轻）/8（轻度）。
（企业根据自身产品性质和风险进行要求）6．口腔黏膜刺激：刺激指数应不大于4（极轻）/8（轻度）。
（企业根据自身产品性质和风险进行要求）7. 眼刺激：试验样品不引起眼刺激反应。
全身毒性试验分类：8. 急性全身毒性：应无急性全身毒性反应。
9. 亚急性全身毒性：应无亚急性全身毒性反应。
10. 亚慢性全身毒性：应无亚慢性全身毒性反应。
11. 热原：试验样品应无热原反应。
遗传毒性试验：12. 鼠伤寒沙门氏菌回复突变试验（Ames试验）：诱变应为阴性。
13. 小鼠淋巴瘤细胞基因突变试验：诱变应为阴性。
14. 染色体畸变试验：诱变应为阴性。
15.植入试验：与对照样品相比，应不引起组织学反应或仅引起轻微组织学反应。
（注：植入试验应明确植入部位和周期，如：12周肌肉植入试验）生物相容性试验方法：原则：主要明确浸提介质、浸提比例、浸提温度、浸提时间和所用方法1.细胞毒性：以细胞完全培养基为浸提介质，按照0.2g/mL的比例，（37±1）℃条件下浸提24 h，根据GB/T 16886.5-2017中规定的浸提液法进行试验，结果应符合X.X的要求。
毒理学,名词解释,简答题
1、化学致癌三个阶段特点：引发阶段：不可逆；所引发的“干细胞”在形态学上无法识别；需要通过细胞分裂“固定突变”；剂量-反应关系良好，但很难测定的阈值，无可测定的最大反应；存在自发启动的引发作用(内源性)；对外源性化学物质和其他化学因素敏感；引发剂的强度以经一定的促长阶段后发生的癌前病变来定量。
促长阶段：可逆(基因表达、细胞水平)；促长剂的有效性仅出现在引发作用之后；促长细胞群的存在取决于促长剂的持续存在；内源性促长剂可起“自发”促长作用；剂量-反应显示有可测定的阈值，有可测定的最大效应；对饮食和激素等因素敏感；以能否有效的扩大引发细胞群来确定促长剂的相对强度。
进展阶段：不可逆；核型不稳性性导致细胞基因组结构的形态学改变；有可测定的和/或形态学可描述的细胞基因组的改变；进展的早期阶段，已改变的细胞对环境因素敏感；可见良性和/或恶性肿瘤；促进展剂可使已促长的细胞进入该阶段；可以发生自发的进展作用。
2、影响外源化学物质活性化学物因素：化学结构取代基的影响：取代基的影响、异构体和立体构型、同系物的碳原子数和结构的影响、分子饱和度化合物的联合作用（joint action ）：两种或两种以上毒物同时或先后作用于机体时产生的交互毒性作用。
非交互作用：相加作用、独立作用；交互作用：协同作用、加强作用、拮抗作用3、影响外源化学物毒性因素：化学物因素：化学结构，理化性质，不纯物和外源化学物的稳定性机体因素：物种个体遗传学差异，宿主其它因素对于毒作用敏感影响环境因素：气象条件，季节和昼夜节律动物笼养方式，外源化合物的接触特征和赋形剂化合物联合作用：4、影响外源化学物生物转化的因素化学因素：化学结构影响:取代基不同毒性不同，异构体和立体构型的影响，同系物的碳原子数和结构的影响，理化性质：脂水分配系数，分子量大小，挥发性，气态物质血气非配系数比重，电离度和荷电性、不纯物和外源化学物的稳定性二是机体因素5、安全性评价的四个阶段的试验项目：第一阶段：包括急性毒性试验和局部毒性试验。
Ames实验
Ames实验⼋、⿏伤寒沙门⽒菌／回复突变试验Salmonella Typhimurium / Reverse Mutation Assay1 范围本规范确定了⿏伤寒沙门⽒菌／回复突变试验的基本原则、要求和⽅法。
本规范适⽤于化妆品原料及其产品的基因突变检测。
2 规范性引⽤⽂件OECD Guidelines for Testing of Chemicals (No.471,Adopted:21,July 1997)。
3 定义3.1回复突变（Reverse mutation）细菌在化学致突变物作⽤下由营养缺陷型回变到原养型(prototroph)。
3.2基因突变（Gene mutation）在化学致突变物作⽤下细胞DNA中碱基对的排列顺序发⽣变化。
3.3碱基置换突变（Base substitution mutation）引起DNA链上⼀个或⼏个碱基对的置换。
碱基置换有转换(transition)和颠换(transversion)两种形式。
转换是DNA链上的⼀个嘧啶被另⼀嘧啶所替代，或⼀个嘌呤被另⼀嘌呤所代替。
颠换是DNA链上的⼀个嘧啶被另⼀嘌呤所替代，或⼀个嘌呤被另⼀嘧啶所代替。
3.4 移码突变（Frameshift mutation）引起DNA链上增加或缺失⼀个或多个碱基对。
3.5 ⿏伤寒沙门⽒菌/回复突变试验（Salmonella typhimurium/reverse mutation assay）利⽤⼀组⿏伤寒沙门⽒组氨酸缺陷型试验菌株测定引起沙门⽒菌碱基置换或移码突变的化学物质所诱发的组氨酸缺陷型(his-)→原养型(his+)回复突变的试验⽅法。
3.6 S9经多氯联苯(PCB混合物)或苯巴⽐妥钠和β-萘黄酮结合诱导的⼤⿏制备肝匀浆，在9000g 下离⼼10min后的肝匀浆上清液。
4 原理⿏伤寒沙门⽒组氨酸营养缺陷型菌株不能合成组氨酸，故在缺乏组氨酸的培养基上，仅少数⾃发回复突变的细菌⽣长。
食品安全实验 鼠伤寒沙门氏菌回复突变实验
五,数据处理和结果判断
记录受试物各剂量组,空白对照(自发回变),溶剂 对照以及阳性诱变剂对照的每皿回变菌落数,并求平 均值和标准差. 如果受试物的回变菌落数是溶剂对照回变菌落数的两 倍或两倍以上,并呈剂量-反应关系者,则该受试物 判定为致突变阳性. 受试物经上述四个试验菌株测定后,只要有一个试验 菌株,无论在加S9或未加S9条件下为阳性,均可报 告该受试物对鼠伤寒沙门氏菌为致突变阳性.如果受 试物经四个试验菌株检测后,无论加S9和未加S9均 为阴性,则可报告该受试物为致突变阴性.
三,培养基和试剂
1, 0.5mmol/L组氨酸-0.5mmol/L生物素溶液 2,顶层琼脂培养基
3,底层琼脂培养基 4,营养肉汤培养基 5,盐溶液(1.65mol/L KCl+0.4mol/L MgCl2) 6,0.2mol/L磷酸盐缓冲液(p操作方法
1,增菌培养
取营养肉汤培养基5ml,加入无菌试管中,将主平板或冷冻保存的菌株培 养物接种于营养肉汤培养基内,37℃振荡(100次/min)培养10h.该菌 株培养物应每毫升不少于1～2×109活菌数.
2,平板掺入法
实验时,将含0.5mmol/L组氨酸-0.5mmol/L生物素溶液的顶层琼脂培养 基2.0mL分装于试管中,45℃水浴中保温,然后每管依次加入试验菌株增 菌液0.1mL,受试物溶液0.1mL和S9混合液0.5mL(需代谢活化时),充 分混匀,迅速倾入底层琼脂平板上,转动平板,使之分布均匀.水平放 置待冷凝固化后,倒置于37℃培养箱里孵育48h.记数每皿回变菌落数. 实验中,除设受试物各剂量组外,还应同时设空白对照,溶剂对照,阳 性诱变剂对照和无菌对照.
实验一 鼠伤寒沙门氏菌回复 突变实验
一,目的与要求 1,了解化学毒物致突变性分析的原理及分析要求. 2,掌握回复突变的测试方法. 二,实验原理 鼠伤寒沙门氏组氨酸营养缺陷型菌株不能合成组氨 酸,故在缺乏组氨酸的培养基上,仅少数自发回复突 变的细菌生长.假如有致突变物存在,则营养缺陷型 的细菌回复突变成原养型,因而能生长形成菌落,据 此判断受试物是否为致突变物. 某些致突变物需要代谢活化后才能引起回复突变, 故需加入经诱导剂诱导的大鼠肝制备的S9混合液.
微生物学遗传变异习题
遗传变异一、名词解释1、基因型2、表型3、突变4、突变型5、饰变6、普遍性转导7、转化8、细菌素9、抗生素10、突变率11、光复活作用12、准性生殖13、野生型14、原养型15、营养缺陷型菌株16、完全培养基17、补充培养基18、F+菌株19、F-菌株20、Hfr菌株21、F'菌株22、接合中断法二、填空题1、、和是证明核酸是遗传物质的三个经典实验。
2、细菌的质粒的种类很多，其中接合性质粒如，抗药性质粒如，产细菌素质粒如，诱癌质粒如，诱生不定根的质粒如，执行固氮功能的质粒如，降解性质粒如等。
3、细胞的平均突变率是。
4、选择性突变株可包括、和等，而非选择性突变株则可包括、和等。
5、、、、、和是基因突变的六个特点。
6、基因突变的自发性和不对应性曾有三个著名的实验予以证明，它们是、和。
7、点突变是由于碱基置换而引起的，和是两种具体机制。
8、诱发突变可分为三类，即、和。
9、紫外线对微生物的损伤，主要是产生，主要通过两种方式修复DNA的损伤，即和。
10、、、和是在DNA的切除修复中参与的四种酶；参与光复活作用的酶则仅有一种。
11、若利用紫外线诱变微生物，应在条件下进行操作，并在条件下培养。
12、常见的“三致”是指、和作用，是目前检出某试样是否有“三致”的简便快速高效的试验。
13、艾姆斯试验中用的菌种是，通过回复突变可以检测待测样品中的存在。
14、、和是与筛选营养缺陷型突变株有关的三类培养基。
15、与营养缺陷型有关的菌株有三种：从自然界分离到的任何菌种的原始菌株称为，该菌株经诱变剂处理后所发生的丧失某酶合成能力的菌株称为，若再经回复突变或重组后的菌株称为。
16、、、和是筛选营养缺陷型菌株的四个环节。
17、、、和是四种从混合菌液中检出营养缺陷型菌株方法。
18、普遍转导与局限转导的主要区别在于：第一，普遍转导噬菌体是属于噬菌体，而局限转导噬菌体属于噬菌体；第二，普遍转导噬菌体能转移供体菌的基因，而局限转导噬菌体只能转移供体菌的基因。
化妆品卫生规范
化妆品卫生规范Hygienic Standard for Cosmetics(2002年版)中华人民共和国卫生部二OO二年九月第一部分总则General Principle第二部分毒理学试验方法Methods of Toxicological Test第三部分卫生化学检验方法Methods of Hygienic ChemicalTest for Cosmetics第四部分微生物检验方法Methods of MicrobiologicalExamination for Cosmetics第五部分人体安全性和功效评价检验方法Methods of Safety and Functional Evaluation for Cosmeticson Human Body1范围本规范规定了对化妆品原料以及化妆品最终产品的卫生要求。
本规范适用于中华人民共和国境内销售的化妆品。
2 规范性引用文件欧盟化妆品规程（Dir．76／768／EEC 2000年3月版）（The Cosmetics Directive of the Council European Communities，Dir．76／768／EEC，March,2000）。
3 定义本规范采用下列定义化妆品是以涂抹，喷洒或其它类似方法，施于人体表面任何部位（皮肤、毛发、指甲、口唇、口腔粘膜等），以达到清洁、消除不良气味、护肤、美容和修饰目的的产品。
4 化妆品的一般要求4.1 化妆品不得对施用部位产生明显刺激和损伤。
4.2 化妆品必须使用安全，且无感染性。
5 对产品的要求5.1 化妆品的微生物学质量应符合下列规定5.1.1 眼部化妆品及口唇等粘膜用化妆品以及婴儿和儿童用化妆品菌落总数不得大于500CFU／mL 或500CFU／g。
5.1.2 其他化妆品菌落总数不得大于1000CFU／mL或1000CFU／g。
5.1.3 每克或每毫升产品中不得检出粪大肠菌群、绿脓杆菌和金黄色葡萄球菌。
化学品毒性鉴定技术规范
化学品毒性鉴定技术规范2005年6月目录一、总则 (3)二、试验方法（一）第一阶段试验 (15)1、急性吸入毒性试验 (16)2、急性经皮毒性试验 (20)3、急性经口毒性试验 (23)4、急性眼刺激性/腐蚀性试验 (26)5、皮肤刺激性/腐蚀性试验 (32)6、皮肤变态反应试验（皮肤致敏试验） (36)（二）第二阶段试验 (54)1、鼠伤寒沙门氏菌回复突变试验（Ames试验） (55)2、体外哺乳动物细胞染色体畸变试验 (62)3、体内哺乳动物骨髓细胞染色体畸变试验 (68)4、体内哺乳动物骨髓嗜多染红细胞微核试验 (75)5、哺乳动物精原细胞/初级精母细胞染色体畸变试验，或 (79)精子畸形试验 (87)6、啮齿类动物显性致死试验 (90)7、免疫毒性评价试验方法 (95)8、亚急性吸入（14/28天）毒性试验 (104)9、亚急性经皮（21/28天）毒性试验 (110)10、亚急性经口（28天）毒性试验 (115)（三）第三阶段试验 (121)1、亚慢性吸入毒性试验 (122)2、亚慢性经皮毒性试验 (126)3、亚慢性经口毒性试验 (130)4、致畸试验 (136)5、两代繁殖毒性试验 (142)6、迟发性神经毒性试验 (147)（四）第四阶段试验 (153)1、慢性吸入毒性试验 (154)2、慢性经皮毒性试验 (160)3、慢性经口毒性试验 (166)4、致癌试验，或 (172)慢性毒性/致癌性合并试验 (180)5、毒物代谢动力学试验 (189)6、接触人群调查与观察（参考国内外有关专著或教科书）（五）参考试验 (196)1、皮肤变态反应试验-局部淋巴结法 (197)2、大肠杆菌回复突变试验 (202)3、酵母菌基因突变试验 (210)4、体外哺乳动物细胞正向基因突变试验 (214)5、果蝇伴性隐性致死试验 (220)6、枯草杆菌基因重组试验 (224)7、体外哺乳动物细胞程序外DNA合成（UDS）试验 (232)8、体内哺乳动物外周血细胞微核试验 (238)9、体外哺乳动物姊妹染色单体交换（SCE）试验 (244)10、体内哺乳动物骨髓细胞姊妹染色体交换（SCE）试验 (250)11、繁殖/生长发育毒性筛选试验 (256)12、亚急性毒性合并繁殖/发育毒性筛选试验 (262)13、一代繁殖试验 (269)14、神经毒性筛选组合试验 (274)总则General Principles1 依据根据《中华人民共和国职业病防治法》、《作业场所使用有毒物品劳动保护条例》、《危险化学品安全管理条例》、《职业卫生技术服务机构管理办法》、《化学品毒性鉴定管理规范》制定本规范。
Ames
点试法
掺入法
背景菌生长良好受试物 将受试物0.1ml、菌液0.1ml分别加入 每皿回变菌落数增加一 顶层培养基中，倒入底层培养基中， 倍以上并有剂量-反应 凝固后37℃培养48h观察结果 关系，试验结果具有重 现性即可认为该受试物 为诱变阳性。
毒理学基础实验课
七、溶剂的选择 如果受试物为水溶性，可用灭菌蒸馏水作为溶剂； 如为脂溶性，应选择对试验菌株毒性低且无致突 变性的有机溶剂，常用的有二甲基亚砜（DMSO）、
丙酮、95%乙醇。
一般操作中，为了减少误差和溶剂的影响，常按
每皿使用剂量用同一溶剂配成不同的浓度，固定
加入量为100l。
滤纸片（有结晶紫） 抑菌环
0.1ml菌液
37℃24h
顶层
普通培养基
毒理学基础实验课
3、紫外线敏感特性
原理：具有△uvrB突变的菌株对紫外线敏感，当受到紫外线照射后，不能生长， 而具有野生型切除修复酶的菌株，则能照常生长。 鉴定方法：用灭菌牙签分别将菌株划线接种于普通培养基上，打开平皿盖，用 灭菌黑布盖住一半培养基，用15W紫外灯在距离33cm处照射8s，37℃温箱培养 18h~24h。 结果判断：具有△uvrB突变的菌株对紫外线敏感，经辐射后细菌不生长，而具 有完整的切除修复系统的菌株，则照常生长。
诱导 －最广泛应用的大鼠肝微粒体酶的诱导剂是多氯 联苯（PCB混合物），
－选择健康雄性大鼠体重200g左右，
－一次腹腔注射诱导剂，剂量为500mg/kg体重。
诱导剂溶于玉米油中，浓度为200mg/mL。
6-4 化学致突变物的检测
第四节化学致突变物的检测一、致突变试验(一) 基因突变试验1.鼠伤寒沙门氏菌回复突变试验又称Ames试验，检测受试物诱发鼠伤寒沙门氏菌组氨酸营养缺陷型突变株(his-)回复突变成野生型(his+)的能力。
试验菌株都有组氨酸突变(his-)，不能自行合成组氨酸，在不含组氨酸的最低营养平皿上不能生长，回复突变成野生型后能自行合成组氨酸，可在最低营养平皿上生长成可见菌落。
计数最低营养平皿上的回变菌落数来判定受试物是否有致突变性。
标准试验菌株有四种：TA97和TA98检测移码突变、TA100检测硷基置换突变、TA102对醛、过氧化物及DNA交联剂较敏感。
这四个试验菌株除了含有his-突变，还有一些附加突变，以提高敏感性。
试验方法有点试验(预试验)和掺入试验(标准试验)两种。
在掺入试验中，受试物最高剂量为5mg/皿或出现毒性及沉降的剂量，至少有五个剂量点，并有阴性(溶剂)对照和阳性对照。
将受试物、试验菌株培养物和S9混合液加到顶层培养基中，混匀后铺在最低营养平皿上，37℃培养48小时，计数可见菌落数。
判断阳性结果的标准是，如每皿回变菌落数为阴性对照的每皿回变菌落数的两倍以上，并有剂量－反应关系，即认为此受试物为鼠伤寒沙门氏菌的致突变物。
S9混合液是用多氯联苯诱导的大鼠肝匀浆9000Xg上清液(S9)加上NADP及葡萄糖－6－磷酸等辅助因子，作为代谢活化系统。
如不加S9混合液得到阳性结果，说明受试物是直接致突变物；加S9混合液才得到阳性结果，说明该受试物是间接致突变物。
只要在一种试验菌株得到阳性结果，即认为受试物是致突变物；仅当四种试验菌株均得到阴性结果，才认为受试物是非致突变物。
2.哺乳动物细胞基因突变试验哺乳动物体外培养细胞的基因正向突变试验常用的测试系统有小鼠淋巴瘤L5178Y细胞，中国仓鼠肺V79细胞和卵巢CHO细胞的三个基因位点的突变，即次黄嘌呤磷酸核糖转移酶(HGPRT)、胸苷激酶(TK)及Na+／K+ATP酶(OUA)位点。
Ames试验
应用
• 例如：用Ames试验检测食品添加剂、化妆品等的致突变性，由此推测其致癌
性；用Ames试验检测水源水和饮用水的致突变性，探索较现行方法更加卫生
安全的消毒措施；检测城市污水和工业废水的致突变性，结合化学分析，追踪
污染源，为研究防治对策提供依据；检测土壤、污泥、工业废渣堆肥、废物灰 烬的致突变性，以防止维系生命的土壤受致突变物污染后，通过农作物危害人 类；检测气态污染物的致突变性，防止污染物经由大气，通过呼吸对人体发生 潜在危害；检测农药在微生物降解前后的致突变性，了解农药在施用后代谢过
• 只要在一种试验菌株得到阳性结果，即认为受试物是致突变物。
• 只有在四种试验菌株得到阴性结果，才认为受试物是非致突变物。
S9是什么
Ames试验原理
• 因为许多外源化学物是间接诱变剂，需经过代谢活化转变为亲电子的终致突
变物才能与DNA反应，引起突变。鼠伤寒沙门氏菌缺乏哺乳动物的代谢酶， 微量检测直接及间接诱变剂，在进行Ames试验时，应分别进行不加及加代 谢活化系统的检测。而在生物体内参与代谢活化的主要酶系是混合功能氧化 酶系，所以，在Ames试验中加入的代谢活化系统应主要是混合功能氧化酶
鼠伤寒沙门氏菌微粒体酶试验法
Ames试验
杨灿
• 概述 • 实验原理 • 应用 • 缺点
目录
• Ames试验，全称污染物致突变性检测，也称为鼠伤寒沙门氏菌回复突变试 验。 • 它是一种利用微生物进行基因突变的体外致突变实验法。利用一种突变型微 生物菌株与被检化学物质接触，如果该化学物具有致突变性，则可使突变性 微生物发生回复突变，重新成为野生型微生物。 • 该法适用于测试混合物，反映多种污染物的综合效应。是应用最广泛的检测 基因突变的体外试验。
毒理学题库
毒物;在一定条件下以较小的剂量进入机体，能干扰正常的生理功能或生化过程，引起暂时或永久性的病理改变，甚至危及生命的物质称为毒物。
1．简述毒理学研究的3R原则，各有什么要求？3R”即替代（Replacement）、减少（Reduction）和优化（Refinement）三个英文单词的字头。
1.替代是指使用没有知觉的实验材料代替活体动物，或使用低等动物替代高等动物进行试验，并获得相同实验效果的科学方法。
2.减少是指在科学研究中，在动物实验时，使用较少量的动物获取同样多的试验数据或使用一定数量的动物能获得更多的试验数据的科学方法，减少的目的不仅仅是降低成本，而是在用最小的动物达到所需要的目的，同时也是对动物的一种保护。
3.优化是指在必须使用动物进行有关实验时，要尽量减少非人道程序对动物的影响范围和程度，可通过改进和完善实验程序，避免减少或减轻给动物造成的疼痛和不安，或为动物提供适宜的生活条件，已保证动物的健康和康乐，保证动物实验结果可靠性和提高实验动物福利的科学方法，总之，替代、减少、优化是彼此独立而又相互联系，是使人们要更好地科学利用和合理保护动物一种科学方法和学科。
3R原则的提出和应用，是在不影响实验要求和实验结果的基础上，如果违背了科学研究的目的，过分的强调3R原则，反对使用动物进行实验，3R原则也就失去了它的价值和意义。
2如何理解毒理学是科学与艺术的统一？●毒理学的科学性体现在: 现象的观察与数据的收集;●毒理学的艺术性体现在: 利用数据外推，预测人群与动物暴露的可能结果。
●二者是相互联系的。
科学性是艺术性的基础，艺术性可以对科学性进行解释。
3理学科学的未来发展趋势是什么？毒目前的发展趋势：➢ 1、从高度综合到高度分化➢ 2、从整体动物试验到替代试验➢ 3、从阈剂量到基准剂量➢ 4、从结构活性关系到定量结构活性关系➢ 5、从危险度评价到危险度管理4按照外源化学物的用途及分布范围，可将毒物分为哪几类？1．工业毒物生产原料、辅剂、中间体、副产品、杂质、成品等2．食品添加剂糖精、香精、食用色素、防腐剂等3．日用化学品化妆品、清洁与洗涤用品、防虫杀虫用品等4．农用化学物化肥、杀虫剂、除草剂、植物生长调节剂、保鲜剂等5．医用毒物各种剂型的药物、消杀剂、造影剂等6．环境污染物存在于废气、废水、废渣中的各种化学物质7．生物性毒物动物毒素、植物毒素、细菌毒素(白喉杆菌)、霉菌毒素等8．军事毒物芥子气等战争毒剂9．放射性核素具有放射能力的元素5简述毒理学主要研究方法及其优缺点？⏹毒理学采取的主要研究方法❖体内试验(in vivo test)；❖体外试验(in vitro test)；❖人体观察；❖流行病学调查。
Ames实验
❑ Ames试验
应用 1．斑点试验只局限于能在琼脂上扩散的化学物 质，大多数多环芳烃和难溶于水的化学物质均 不适宜用此法。此法敏感性较差，主要是一种 定性试验，适用于快速筛选大量受试化合物。 2．平板掺入试验可定量测试样品致突变性的强 弱。此法较斑点试验敏感，获阳性结果所需的 剂量较低。点试获阳性结果的浓度用于掺入试 验（每皿0.1ml），往往出现抑（杀）菌作用。 3．致变作用迟缓或有抑菌作用的试样，培养时 间延长至72h。
Ames试验
Ames试验，即污染物致突变性检测，也称 为鼠伤寒沙门氏菌回复突变试验 污染物对人体的潜在危害，引起人们的普 遍关注。世界上已发展了百余种短期快速 测试法，检测污染物的遗传毒性效应。 B.N.Ames等经十余年努力，于1975年建立 并不断发展完善的沙门氏菌回复突变试验 （亦称Ames试验）已被世界各国广为采用。
鼠伤寒沙门氏菌 野生型（his＋）
正向突变
回复突变
鼠伤寒沙门氏菌 突变型（his－） 试验菌种 (his-) S9
受试物 试验菌种 (his-) S9
Ames试验原理
❑ Ames试验 结果判断:
➢ 只要在一种试验菌株得到阳性结果，即认为
受试物是致突变物
➢ 仅当四种试验菌株均得到阴性结果，才认为 受试物是非致突变物
❑ Ames试验
❖原理：检测受试物诱发鼠伤寒沙门氏菌组氨酸营 养缺陷型突变株(his-)回复突变成野生型(his+)的能 力。即组氨酸突变菌(his-) 在不含组氨酸的最低营 养平皿上不能生长；回复突变成野生型(his+)，可 在不含组氨酸的最低营养平皿上生长。 ❖是应用最广泛的检测基因突变的体外试验。
❖加S9 混合液才得到阳性结果，说明该受试物
农药登记毒理学细菌回复突变
农药登记毒理学细菌回复突变范围GB/T 15670的本部分规定了细菌回复突变试验的基本原则、方法和要求。
本部分适用于为农药登记而进行的细菌回复突变试验。
2术语和定义下列术语和定义适用于本文件。
2.1回复突变试验reverse mutation test利用一组鼠伤寒沙门氏菌和/或大肠杆菌检测引起细菌碱基置换或移码突变的化学物质所诱发的需要某种氨基酸的菌株（分别为组氨酸或色氨酸）成为不需要外源性供应氨基酸的菌株的突变，即是由营养缺陷型回变到野生型。
2.2碱基置换型致突变物base pair substitution mutagens引起DNA分子中一个或多个碱基对置换的物质。
在回复突变试验，此改变可能发生在细菌基因组的原突变部位或另一个部位。
2.3移码型致突变物frameshift mutagens引起DNA分子增加或丢失一个或多个碱基对的物质。
3试验目的检测受试物的诱变性，预测其遗传危害和潜在致癌作用的可能性。
4试验概述细菌回复突变试验利用鼠伤寒沙门氏菌和大肠杆菌来检测点突变，涉及DNA的一个或几个碱基对的置换、插入或缺失。
原理是通过观察试验菌株在缺乏所需要氨基酸的培养基上的生长情况，检测试验菌株是否恢复合成必需氨基酸的能力，评价受试物诱发突变的能力。
5培养基和试剂注：培养基成分或试剂至少应是化学纯，无诱变性。
避免重复高温处理，选择适当保存温度和期限，如肉汤保存于4℃不超过6个月，其他详见下述各培养基及溶液说明。
5.1营养肉汤培养基牛肉浸膏5g氯化钠 5 g胰胨10 g磷酸氢二钾(K2HPO4-3H2O) 2.6 g加蒸馏水至1000 mL加热溶解，调节pH至7.4,分装后0.103 Mpa, 20 min灭菌，保存期不超过6个月。
5.2营养肉汤琼脂培养基琼脂粉 1.5 g加营养肉汤培养基至100 mL加热溶解，调节pH至7.4，0.103 Mpa，20 min灭菌。
5.3底层培养基(即最低营养培养基)5.3.1Vogel-Bonner (V-B)培养基柠檬酸(C6H8O7-H2O) 2.0 g磷酸氢二钾(K2HpO4) 10.0 g磷酸氢铵钠(NaNH4HPO4-4H2O) 3.5 g硫酸镁(MgSO4-7H2O) 0.2 g加蒸馏水至200 mL逐个将化学物在少量蒸馏水中单独溶解后，硫酸镁水溶液在最后缓慢加入，加蒸馏水至200 mL。
ames试验实验方法
ames试验实验方法
Ames试验是一种检测化学物质是否存在致突变作用的试验，其全称是污染物致突变性检测试验。
以下是Ames试验的实验方法：
1. 准备细菌：选用具有回复突变特性的鼠伤寒沙门氏菌，通常使用组氨酸缺陷型或乳糖发酵缺陷型等菌株。
2. 制备平板：将细菌培养至一定数量，将其均匀涂布在不含抗生素的基本培养基上，制成细菌平板。
3. 添加诱变剂：将待测物质加入细菌平板，使诱变剂与细菌作用一定时间。
4. 培养细菌：将细菌平板在37℃培养一定时间，使细菌进行增殖。
5. 挑选突变菌落：观察细菌平板，挑选出与背景菌落不同的突变菌落。
6. 验证突变：通过生化反应或基因测序等方法，验证突变菌落中的基因是否发生了突变。
以上是Ames试验的实验步骤，建议查阅专业书籍或咨询专业人士获取更多信息。
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八、鼠伤寒沙门氏菌／回复突变试验Salmonella Typhimurium / Reverse Mutation Assay1 范围本规范确定了鼠伤寒沙门氏菌／回复突变试验的基本原则、要求和方法。
本规范适用于化妆品原料及其产品的基因突变检测。
2 规范性引用文件OECD Guidelines for Testing of Chemicals (No.471,Adopted:21,July 1997)。
3 定义3.1回复突变（Reverse mutation）细菌在化学致突变物作用下由营养缺陷型回变到原养型(prototroph)。
3.2基因突变（Gene mutation）在化学致突变物作用下细胞DNA中碱基对的排列顺序发生变化。
3.3碱基置换突变（Base substitution mutation）引起DNA链上一个或几个碱基对的置换。
碱基置换有转换(transition)和颠换(transversion)两种形式。
转换是DNA链上的一个嘧啶被另一嘧啶所替代，或一个嘌呤被另一嘌呤所代替。
颠换是DNA链上的一个嘧啶被另一嘌呤所替代，或一个嘌呤被另一嘧啶所代替。
3.4 移码突变（Frameshift mutation）引起DNA链上增加或缺失一个或多个碱基对。
3.5 鼠伤寒沙门氏菌/回复突变试验（Salmonella typhimurium/reverse mutation assay）利用一组鼠伤寒沙门氏组氨酸缺陷型试验菌株测定引起沙门氏菌碱基置换或移码突变的化学物质所诱发的组氨酸缺陷型(his-)→原养型(his+)回复突变的试验方法。
3.6 S9经多氯联苯(PCB混合物)或苯巴比妥钠和β-萘黄酮结合诱导的大鼠制备肝匀浆，在9000g下离心10min后的肝匀浆上清液。
4 原理鼠伤寒沙门氏组氨酸营养缺陷型菌株不能合成组氨酸，故在缺乏组氨酸的培养基上，仅少数自发回复突变的细菌生长。
假如有致突变物存在，则营养缺陷型的细菌回复突变成原养型，因而能生长形成菌落，据此判断受试物是否为致突变物。
某些致突变物需要代谢活化后才能引起回复突变，故需加入经诱导剂诱导的大鼠肝制备的S9混合液。
5 仪器和设备培养箱、恒温水浴、振荡水浴摇床、压力蒸汽消毒器、干热烤箱、低温冰箱(-80℃) 或液氮生物容器、普通冰箱、天平(精密度0.1g和0.0001g)、混匀振荡器、匀浆器、菌落计数器、低温高速离心机，玻璃器皿等。
6 培养基和试剂6.1 0.5mmol/L组氨酸-0.5mmol/L生物素溶液成分：L-组氨酸(MW 155) 78mgD-生物素(MW 244) 122mg加蒸馏水至1000mL配制：将上述成分加热，以溶解生物素，然后在0.068MPa下高压灭菌20min。
贮于4℃冰箱。
6.2 顶层琼脂培养基成分：琼脂粉 1.2g氯化钠 1.0g加蒸馏水至200mL配制：上述成分混合后，于0.103MPa下高压灭菌30min。
实验时，加入0.5mmol/L组氨酸—0.5mmol/L 生物素溶液20mL。
6.3 V ogel-Bonner (V-B) 培养基E成分：枸椽酸(C6H8O7·H2O) 100g磷酸氢二钾(K2HPO4) 500g磷酸氢铵钠(NaNH4HPO4·4H2O) 175g硫酸镁(MgSO4·7H2O) 10g加蒸馏水至1000mL配制：先将前三种成分加热溶解后，再将溶解的硫酸镁缓缓倒入容量瓶中，加蒸馏水至1000mL。
于0.103MPa下高压灭菌30min。
储于4℃冰箱。
6.4 20%葡萄糖溶液成分：葡萄糖200g加蒸馏水至1000mL配制：加少量蒸馏水加温溶解葡萄糖，再加蒸馏水至1000mL。
于0.068MPa下高压灭菌20min。
储于4℃冰箱。
6.5 底层琼脂培养基成分：琼脂粉7.5g蒸馏水480mLV-B培养基E 10mL20%葡萄糖溶液10mL配制：首先将前两种成分于0.103MPa下高压灭菌30min后，再加入后两种成分，充分混匀倒底层平板。
按每皿25mL制备平板，冷凝固化后倒置于37℃培养箱中24h，备用。
6.6 营养肉汤培养基成分：牛肉膏 2.5g胰胨 5.0g磷酸氢二钾(K2HPO4) 1.0g加蒸馏水至500mL配制：将上述成分混合后，于0.103MPa下高压灭菌30min。
储于4℃冰箱。
6.7 盐溶液(1.65mol/L KCl+0.4mol/L MgCl2)成分：氯化钾(KCl) 61.5g氯化镁(MgCl2·6H2O) 40.7g加蒸馏水至500mL配制：在水中溶解上述成分后，于0.103MPa下高压灭菌30min。
储于4℃冰箱。
6.8 0.2mol/L磷酸盐缓冲液(pH7.4)成分：磷酸二氢钠(NaH2PO4·2H2O) 2.965g磷酸氢二钠(Na2HPO4·12H2O) 29.015g加蒸馏水至500mL配制：溶解上述成分后，于0.103MPa下高压灭菌30min。
储于4℃冰箱。
6.9 S9混合液成分每毫升S9混合液肝S9 100μl盐溶液20μl灭菌蒸馏水380μl0.2mol/L磷酸盐缓冲液500μl辅酶II(NADP) 4μmol6-磷酸葡萄糖(G-6-P) 5μmol配制：将辅酶II和6-磷酸葡萄糖置于灭菌三角瓶内称重，然后按上述相反的次序加入各种成分，使肝S9加到已有缓冲液的溶液中。
该混合液必须临用现配，并保存于冰水浴中。
实验结束，剩余S9混合液应该丢弃。
6.10菌株鉴定用和特殊用途试剂6.10.1组氨酸—生物素平板成分：琼脂粉15g蒸馏水944mL(V-B)培养基E 20mL20%葡萄糖20mL灭菌盐酸组氨酸水溶液(0.5g/100mL) 10mL灭菌0.5mmol/L生物素溶液6mL配制：高压灭菌琼脂和水后，将灭菌20%葡萄糖，V-B培养基和组氨酸溶液加进热的琼脂溶液中。
待溶液稍为冷却后，加入灭菌生物素，混匀，浇制平板。
6.10.2 氨苄青霉素平板和氨苄青霉素/四环素平板成分：琼脂粉15g蒸馏水940mL(V-B)盐溶液20mL20%葡萄糖20mL灭菌盐酸组氨酸溶液（0.5g/100mL）10mL灭菌0.5mmol/L生物素溶液6mL氨苄青霉素溶液(8mg/mL于0.02mol/LNaOH中) 3.15mL四环素溶液(8mg/mL于0.02mol/L HCl中) 0.25mL配制：琼脂和水高压灭菌20min，将无菌的葡萄糖、VB盐溶液和组氨酸—生物素溶液加进热的溶液中去，混匀。
冷却至大约50℃，无菌条件下加入四环素溶液和/或氨苄青霉素溶液。
应该在倾注琼脂平板后几天内，制备主平板。
6.10.3 营养琼脂平板成份：琼脂粉7.5g营养肉汤培养基500mL配制：于0.103MPa下高压灭菌30min后倾注平板。
7 试验菌株及其生物学特性鉴定7.1 试验菌株采用TA97、TA98、TA100和TA102一组标准测试菌株。
7.2生物学特性鉴定新获得的或长期保存的菌种，在试验前必须进行菌株的生物特性鉴定。
菌株鉴定的判断标准，如表1所示。
表1 试验菌株鉴定的判断标准7.2.1组氨酸缺陷原理：组氨酸缺陷型试验菌株本身不能合成组氨酸，只能在补充组氨酸的培养基上生长，而在缺乏组氨酸的培养基上，则不能生长。
鉴定方法：将测试菌株增菌液分别于含组氨酸培养基平板和无组氨酸平板上划线，于37℃下培养24h 后观察结果。
结果判断：组氨酸缺陷型菌株在含组氨酸平板上生长，而在无组氨酸平板上则不能生长。
7.2.2 脂多糖屏障缺损原理：具有深粗糙（rfa）的菌株，其表面一层脂多糖屏障缺损，因此一些大分子物质如结晶紫能穿透菌膜进入菌体，从而抑制其生长，而野生型菌株则不受其影响。
鉴定方法：吸取待测菌株增菌液0.1mL于营养琼脂平板上划线，然后将浸湿的0.1%结晶紫溶液滤纸条与划线处交叉放置。
37℃下培养24h后观察结果。
结果判断：假若待测菌在滤纸条与划线交叉处出现一透明菌带，说明该待测菌株具有rfa突变。
7.2.3 氨苄青霉素抗性原理：含R因子的试验菌株对氨苄青霉素有抗性。
因为R因子不太稳定，容易丢失，故用氨苄青霉素确定该质粒存在与否。
鉴定方法：吸取待测菌株增菌液0.1mL，在氨苄青霉素平板上划线，37℃下培养24h后观察结果。
结果判断；假若测试菌在氨苄青霉素平板上生长，说明该测试菌具有抗氨苄青霉素作用，表示含R因子，否则，表示测试菌不含R因子或R因子丢失。
7.2.4 紫外线敏感性原理：具有△uvrB突变的菌株对紫外线敏感，当受到紫外线照射后，不能生长，而具有野生型切除修复酶的菌株，则能照常生长。
鉴定方法：吸取待测菌株增菌液0.1mL于营养琼脂平板上划线，用黑纸盖住平板的一半，置紫外灯下照射（15W，距离33cm）8秒钟。
置37℃下孵育24h后观察结果。
结果判断：具有△uvrB突变的菌株对紫外线敏感，经辐射后细菌不生长，而具有完整的切除修复系统的菌株，则照常生长。
7.2.5 四环素抗性原理：具有pAQI的菌株对四环素有抗性。
鉴定方法：吸取待测菌株增菌液0.1mL于氨苄青霉素/四环素平板上划线，置37℃下孵育24h后观察结果。
结果判断：假若测试菌照常在氨苄青霉素/四环素平板上生长，表明该测试菌株对氨苄青霉素和四环素两者有抗性，具有pAQI质粒，否则，说明测试菌株不含pAQI质粒。
7.2.6 自发回变原理：每种试验菌株都以一定的频率自发地产生回变，称为自发回变。
这种自发回变是每种试验菌株的一项特性。
鉴定方法：将待测菌株增菌液0.1mL加到2mL含组氨酸—生物素的顶层琼脂培养基的试管内，混匀后铺到于底层琼脂平板上，待琼脂固化后，置37℃培养箱中孵育48h后记数每皿回变菌落数。
结果判断：每种标准测试菌株的自发回变菌落数应符合表1要求。
经体外代谢活化后的自发回变菌落数，要比直接作用下的略高。
7.2.7 回变特性—诊断性试验原理：每种试验菌株对诊断性诱变剂回变作用的性质以及S9混合液的效应不一。
鉴定方法：按照平板掺入试验的操作步骤进行。
将受试物换成诊断性诱变剂。
结果判断：标准菌株对某些诊断性诱变剂特有的回变结果参见表2。
表2 测试菌株的回变性诱变剂剂量( g) S9TA97 TA98 TA100 TA102柔毛霉素叠氮化钠ICR—191链霉黑素丝裂霉素C2,4,7-三硝基-9-芴酮4-硝基-O-次苯二胺4-硝基喹啉-N-氧化物甲基磺酸甲酯2-氨基芴苯并（a）芘6.01.51.00.250.50.20200.51.0101.0---------++124761640inhinh8377216052817417423373123363inhinh82441599292236194143473000185inhinh40079842202730302693759218822302772162876586261255注：inh表示抑菌。