酶的化学修饰
酶分子的化学修饰
酶分子的化学修饰
酶分子化学修饰就是在分子水平上 对酶进行改造，以达到改构和改性的目 的。在体外将酶分子通过人工的方法与 一些化学物质，特别是一些有生物相容 性的物质进行共价连接，从而改变酶的 结构和性质。这些化学物质称为修饰试 剂，酶化学修饰主要用于基础酶学的研 究和疾病治疗。
酶化学修饰的应用领域
例如用聚乙二醇共价修饰超氧化物歧化 酶（SOD），不仅可以降低或消除酶的抗 原性，而且提高了抗蛋白酶的能力，延 长了半衰期，从而提高了药效。
PEG是线性大分子，具有良好的生物相容 性和水溶性，在体内无毒性、无残留、 无免疫原性，并可消除酶分子的抗原性， 被广泛用于酶的修饰。
PEG末端活化后可以与酶产生交联，使酶 分子被覆盖上一层疏松的亲水外壳，导 致动力学发生改变，从而产生许多有用 的性质，如可以在广泛的pH范围内溶解、 不被离子交换剂吸附，电泳迁移率下降 等。
加酶液
E E E
S
P
图：反相胶团的结构和酶的分布
二、酶分子的内部修饰 （一）非催化活性基团的修饰：通过对 非催化残基的修饰可以改变酶的动力学 性质，改变酶对特殊底物的亲和力；
（二）酶蛋白主链的修饰：主要是靠酶 法进行修饰，用蛋白酶对主联进行部分 水解，可以改变酶的催化特性。
（三）催化活性基团的修饰：通过选择 性修饰催化活性氨基酸的侧链来实现氨 基酸残基的取代，使一种氨基酸侧链转 化为另一种氨基酸侧链，这种方法又称 为化学突变法。
46
40 20 50 0
64
90 99 95 80
二、抗原性：修饰酶的抗原性与修饰剂 有关，目前比较公认的是PEP和人血清白 蛋白在消除酶分子抗原性方面效果较好。
修饰酶的抗原性变化
酶
胰蛋白酶 过氧化氢酶 Arg 酶
04酶分子的化学修饰
猪肝尿酸酶 糜蛋白酶 吲哚-3 -链烷羟化酶 猪肝尿酸酶 产沅假丝酵母尿酸酶
修饰剂
白蛋白 肝 素 聚丙烯酸 PEG PEG
天然酶
10.5 8.0 3.5 8.2 8.2
修饰酶
7.4 - 8.5
9.0 5.0 - 5.5 9.0 8.8
作业题：
1、名词解释：酶分子修饰 2、酶分子的化学修饰方法有哪些？ 3、酶肽链的大分子共价修饰的修饰剂和修 饰反应有哪些？ 4、分析说明修饰酶的性质。
一、被修饰酶的性质 （一）酶的稳定性：包括热稳定性、酸碱稳定性，
作用温度以及pH，酶蛋白解离时的电化学性质， 抑制剂的性质等。
（二）酶活性中心的状况：包括酶分子活性中心
的组成，如参与活性中心的氨基酸残基、辅因子 等。酶分子的形状、大小以及寡聚酶的亚基组成。
（三）酶侧链基团的性质与反应性 1、对巯基的化学修饰： 常用的修饰试剂有烷化剂、汞试剂和Ellman试剂等。 2、氨基的化学修饰： 常用的修饰试剂友乙酸酐、2，4，6-三硝基苯磺酸、 2，4-二硝基氟苯、烷基化时剂、丹磺酰氯(DNS)和 苯异硫氰酸酯（ PITC)等。 3、羧基的化学修饰： 水溶性羰二亚胺或氨化反应、硼氟化三甲锌盐反应、 甲醇-盐酸酯化反应等。 4、咪唑基的修饰反应： 焦碳酸二乙酯反应、碘代反应、碘化反应等。
（三）酶蛋白修饰反应的主要类型 酯化及相关反应 烷基化反应 氧化还原反应 芳香环取代反应 溴化氰裂解反应
第三节 酶蛋白肽链的大分子修饰
一、聚乙二醇及其修饰反应：聚乙二醇（PEG）是线 性大分子，具有良好的生物相容性和水溶性，在体 内无毒性、无残留、无免疫原性，并可消除酶分子 的抗原性，被广泛用于酶的修饰。 聚乙二醇末端活化后可以与酶产生交联，使酶分子 被覆盖上一层疏松的亲水外壳，导致动力学发生改 变，从而产生许多有用的性质，如可以在广泛的 pH范围内溶解、不被离子交换剂吸附，电泳迁移 率下降等。 主要的修饰方法有：叠氮法、琥珀酸酐法、三氯均 嗪法、羰二亚胺法、重氮法。
酶分子的化学修饰
2、定点突变和化学修饰结合技术
利用定点突变法来改变酶的底物专一性，开发出 了新型的酶制剂。将定点突变所得酶进行化学修饰， 得到一些新颖的酶制剂。利用定点突变技术在酶的关 键活性位点引入一个氨基酸残基，然后利用化学修饰 法对突变的氨基酸残基进行修饰，引入一个小分子化 合物，得到一种化学修饰突变酶。
枯草杆菌蛋白酶化学修饰突变过程
1、交联技术
酶的人工交联可在一条多肽链内形成，是一种作 用于分子间或分子内部的交联方式，能提高酶的稳定 性，防止酶在不良环境中失活。 Fernandez 等提出了一种新颖的分子内交联方式。 实验表明这种方式在酶主要的氨基基团上，戊二醛 （GLU）对其进行了交联修饰（修饰度45% ~ 55%）， 然后把修饰酶在pH 9 和20C 的条件下老化30 min。在 这段时间内酶的活性虽然有所损失，但是稳定性提高 了3 倍。
实验结果分析： 反应pH对PA-PPL活性的影响—— 修饰酶PA-PPL的水解活性明显高于原酶PPL， 且PPL在修饰前后，最适pH范围未发生明显变 化，均为7.0-8.0。
实验结果分析： 反应温度对PA-PPL活性的影响——
在试验温度范围内，修饰酶PA-PPL的水解活性明显高 于原酶PPL，但二者的最适反应温度相同，都为 40℃ ．
刘宏芳,侯瑶,赵新淮;大豆蛋白限制性酶解修饰与产品的溶解性和保 水性变化[J];东北农业大学学报;2009-01,40(1):97-103. 田国贺,郭佳宓,吕团伟等；聚乙二醇对菠萝蛋白酶的化学修饰[J]； 生物技术；2006-02,16(1):35-38.
二、原理、修饰剂及反应
1、化学修饰原理
1）增强酶天然构象的稳定性与耐热性
修饰剂分子存在多个反应基团，可与酶 形成多点交联。使酶的天然构象产生 “刚性”结构。
酶的化学修饰
第五章酶分子的化学修饰主要内容：●酶的活性中心●酶化学修饰的目的●酶化学修饰的原理●酶化学修饰的设计●酶化学修饰的应用第一节酶的活性中心（active site）一、活性中心的概念P12酶的必需基团(essential group): 与酶活性有关的基团酶的活性中心(active center): 由必需基团构成的与酶催化活性有关的特定区域.酶的必需集团在一级结构上并不互相毗邻，往往分散在氨基酸系列中，甚至分布在不同肽链上。
当肽链盘曲、折叠形成空间结构时，互相隔离的必需基团彼此靠近，集中在酶分子表面而形成具有三维结构的特定区域。
该区域能与底物结合并发挥催化作用，故称酶的活性中心(active center)活性部位（active site）。
对于结合酶来说，辅酶或辅基参与酶活性中心的组成。
活性中心的重要化学基团——7种氨基酸出现的频率最高：Lys、Asp、Glu、Cys、His、Tyr和Ser（兰天果拌猪肉丝）。
某些功能基团（氨基、羧基、巯基、羟基和咪唑基）是酶的必需基团。
图释左图：丝氨酸的羟基、半胱氨酸的巯基、组氨酸的咪唑基右图：天冬氨酸和谷氨酸的羧基、赖氨酸的氨基、酪氨酸和丝氨酸的羟基。
二、活性中心的共性P12(1)活性部位只占酶分子很小的一部分（1-2%）。
(2)活性部位是一个三维实体(entity)(3)活性中心位于酶分子表面的疏水性裂缝中。
(4)活性中心构象不是固定不变的（诱导契合）(5)酶与底物通过盐键、氢键、范德华力和疏水作用等次级键结合。
1．The active site takes up a relatively small part of the total volume of an enzyme.左图：肌球蛋白模型。
只显示出α-碳原子，红的为血红素，绿的是两种关键的组氨酸残基。
右图：来自胞质热激蛋白的ATP酶片段的结构图。
ADP（红的）位于两个结构域（黄和蓝的）之间的裂缝中。
05-酶的化学修饰
（二）酶蛋白主链的修饰 ——主要是靠酶法进行修饰，用 蛋白酶对主联进行部分水解，可 以改变酶的催化特性。
（三）催化活性基团的修饰 ——通过选择性修饰催化活性氨 基酸的侧链来实现氨基酸残基的 取代，使一种氨基酸侧链转化为 另一种氨基酸侧链，这种方法又 称为化学突变法。
（四）肽链伸展后的修饰 ——酶蛋白经过脲、盐酸胍处理， 使肽链充分伸展，对酶分子内部 的疏水基团进行修饰，然后在适 当条件下，重新进行折叠。
（三）酶的大分子修饰作用 ——非共价修饰 ——共价修饰
1、大分子非共价修饰
——利用一些大分子试剂通过与酶非共价相互 作用，对酶进行有效的保护 ——例如聚乙二醇、右旋糖苷等通过氢键固定 于酶分子的表面，同时又有效地与外部水相连， 从而保护酶的活力；一些多元醇、多糖、多聚 氨基酸、多胺等能通过调节酶的微环境来保护 酶活力；另外一些蛋白质可以通过相互作用， 排除分子表面的水分子，降低介电常数，使酶 的稳定性增加。
在基础酶学研究上
探测酶活性必需氨基酸的性质和数目 酶蛋白一级结构的测定
酶蛋白的结构变化与运动
酶蛋白部分区域的构象状态 酶的作用机理与催化反应历程 酶分子的拓扑学以及寡聚酶的亚基结合状态 酶的固定化技术 酶纯度的分析与检测
在疾病治疗上
—克服酶在体内的不稳定性
—消除或降低酶的抗原性 —有助于酶分子到达并集中于病灶细胞 在工业上的应用
第五章
酶分子的化学修饰
酶分子化学修饰
——在分子水平上对酶进行改造，以达 到改变结构和改性的目的。在体外将酶 分子通过人工的方法与一些化学物质， 特别是一些有生物相容性的物质进行共 价连接，从而改变酶的结构和性质。这 些化学物质称为修饰试剂，酶化学修饰 主要用于基础酶学的研究和疾病治疗。
酶的化学修饰
酶的化学修饰
聂继龙
酶化学修饰的概念：通过主链的 切割剪接和侧链基团的化学修饰 对蛋白酶进行分子改造，以改变 其理化性质及生物活性。这种用 化学方法对酶分子施行种种手术 的方法称为“酶分子的化学修 饰”。
广义上讲:凡涉及共价键或部分共价 键的形成或破坏的转变都可以看作 是酶的化学修饰。从狭义上讲：酶 的化学修饰在较温和的条件下，以 可控制的方式使一种酶同某些化学 试剂起特异反应，从而引起单个氨 基酸残基或其功能基团发生共价的 化学修饰。
7、对组织分布能力的改变 一些酶经化学修士后，对组织的 分布能力有所改变能在血液中被 靶器官选择性的吸收
酶化学修饰的应用 （1）酶结构与功能的研究 可以通过修饰剂对酶的作用，以及 修饰的部位来判断酶的结构 (2）在医学方面的应用，主要是治 疗和诊断方面的应用。 （3）在工业方面的应用 主要是提高产量，减少成本，而且 将少对环境的污染。
5、肽链的延伸：为了有效的修 饰酶分子的内部区域，可以先用 脲或盐酸胍处理，使酶分子的肽 链充分伸展，这就提供了化学修 饰酶分子内部疏水基团的可能性。 然后让修饰酶的伸展肽链在适当 条件下，重新折叠成某种具有催 化活力的酶。
通过定点突变的化学修饰。通过 一些可控制的方法在酶或蛋白质 特殊的位点引入特定分子来修饰 酶或蛋白质，结合定点突变引入 一种非天然氨基酸侧链来进行化 学修饰，从而得到一些新颖的酶 制剂。
酶的化学修饰的目的：人为的改变 天然酶的一些性质，创造天然酶不 具有的某些优良性质甚至创造新的 活性，来扩大酶的应用领域促进生 物技术的发展。概括起来有三点：1、 提高生物活性。2、增强不良环境中 的稳定性。3、针对特异反应，降低 生物识别能力。
化学修饰的方法： 1，酶的表面修饰，（1）大分子修 饰，可溶性大分子，如聚乙二醇， 聚乙烯比咯烷酮，聚丙烯酰胺、葡 聚糖、环糊精、肝素等。一般聚乙 二醇的分子量在500~2000应用最 广。聚乙二醇是两亲性分子，化学 修饰时多采用单甲氧基聚乙二醇。
酶分子的化学修饰方法具体实例
酶分子的化学修饰方法1.酶的表面修饰2.酶分子的内部修饰3.与辅因子相关的修饰4.金属酶的金属取代1.1酶的表面修饰1.1.1化学固定化例如:①固定在电荷载体上，由于介质中的质子靠近载体，并与载体上的电荷发生作用，使酶的最适pH向碱性(阴离子载体)或向酸性(阳离子载体)方向偏移。
这样，在生产工艺中需几个酶协同作用时，由于固定化可使不同酶的最适pH彼此靠近。
②将糖化酶固定在阴离子载体上，其最适pH由4.5升到6.5，与D-木糖异构酶的最适PH(7.5)靠近，这样，可简化高果糖浆生产工艺。
如果载体与底物带相同电荷，固定化后反应系统Km值增加；带相反电荷，Km值降低。
当酶与载体连接点达到一定数目时，可增加酶分子构象稳定性，防止其构象伸展而失活。
1.1.2 酶的小分子修饰作用例如:③将α—胰凝乳蛋白酶表面的氨基修饰成亲水性更强的NH2COOH并达到一定程度时，酶的热稳定性在60℃时，提高了1000倍，温度更高时稳定化效应更强烈。
这个稳定的酶能经受灭菌的极端条件而不失活.1.1.3酶的大分子修饰例如:④聚乙二醇连到脂肪酶、胰凝乳蛋白酶上所得产物溶于有机溶剂，在有机溶剂存在下能够有效地起作用。
嗜热菌蛋白酶在水介质中通常催化肽链裂解，但用聚乙二醇共价修饰后，其催化活性显著改变，在有机溶剂中催化肽键合成，已用于制造合成甜味剂。
1.1.4 分子间交联例如:⑤戊二醛将胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶交联在一起。
这种杂化酶的优点是，胰凝乳蛋白酶的自溶作用降低，也使其反应器体积减少。
将胰蛋白酶与碱性磷酸脂酶交联而形成的杂化酶，可作为部分代谢途径的模型，则有可能在体内将它们输送到同一部位而提高药效。
1.2酶分子的内部修饰1.2.1非催化活性基团的修饰例如: ①将胰凝乳蛋白酶的Met192氧化成亚砜，则使该酶对含芳香族或大体积脂肪族取代基的专一性底物的束缚口袋有关．也说明底物的非反应部分束缚在酶的催化作用中有重要作用。
1.2.2酶蛋白主链修饰例如: ②用蛋白酶对ATP酶有限水解，切除其十几个残基后，酶活力提高了5.5倍。
酶的化学修饰法
酶的化学修饰方法通过对酶蛋白分子的主链进行“切割”、“剪切”以及在侧链上进行化学修饰来达到改造酶分子的目的。
这种应用化学方法对酶分子施行种种“手术”的技术称为酶化学修饰。
PEG化修饰聚乙二醇或甲基聚乙二醇有一系列不同分子量分布的产品(常用的分子量分布在5000 ~ 10000之间) , 无毒副作用, 无免疫原性, 具有良好的生物相容性。
1977 年 Abuchowski等[1]率先用 PEG修饰牛血蛋白BSA, 发现 PEG化的BSA保持了蛋白质的原有活性, 在体内的半衰期大大延长, 且无免疫原性。
其后人们利用PEG化技术先后对大量的蛋白和酶制剂进行了修饰。
PEG必须经活化才能用于脂肪酶的化学修饰。
活化的方法如图1所示.图1聚乙二醇(polyethylene glycol, PEG)是一种pH中性, 无毒, 水溶性较高的亲水聚合物,其重复单元为氧乙烯基, 端基为两个羟基, 呈线性或支化链状结构[2]. PEG聚合物是迄今为止已知聚合物中蛋白和细胞吸收水平最低的聚合物[3]。
姚文兵等[4] 用三光气和羟基琥珀酰亚胺对mPEG5000进行活化, 再对人干扰素α-2b进行了修饰研究, 反应方程式如Eq. 1所示.Goodson等[5]通过重组技术把Cys残基引入白介素(rIL-2)的非活性单糖基化位点, 采用马来酰亚胺活化的PEG (PEG-maleimide)对其进行修饰, 反应方程式如Eq. 2所示.[1]Abuchowski A, Van Es T, Palczuk C N, e t al . Ef f e ct of covalent at tach mentof polyethylene glycol on immun ogenicity and circulating life of bovine liver catalase [ J ] . J . Biol .Chem. , 1977 , 252: 3578- 3581.[2]Bailon, P.; Berthold, W.Pharm. Sci.Technol. Today 1998, 1, 352.[3]Hooftman, G.; Herman, S.; Schacht, E. J. Bioact. Compat. Polym. 1996, 11, 135.[4]Yao, W. B.; Lin, B. R.; Shen, Z. L.; Wu, W. T. Chin. J. Biochem. Pharm. 2001, 22, 289 (in Chinese).(姚文兵, 林碧蓉, 沈子龙, 吴梧桐, 中国生化药物杂志, 2001, 22, 289.)[5]Goodson, R. J.; Katre, N. V. Bio/technology 1990, 8, 343.。
酶的化学修饰
第四节 酶的亲和修饰
• 亲和标记：
• 又称专一性的不可逆抑制主要指的是修饰 剂具有与底物相类似的结构，对酶活性部 位具有高度的亲和性，能对活性部位的氨 基酸残基进行共价标记。
• 亲和试剂作为底物类似物应具有的条件： 1）在酶不可逆失活以前，亲和试剂要与酶形 成可逆的复合物 2）没有反应性的竞争性的配体存在 3）试剂的体积不能过大，防止空间障碍的产 生 4）修饰产物稳定，有利于分析
• 酶的化学修饰（chemical modification）： 酶的化学修饰（chemical modification）： • 通过化学基团的引入或除去，使蛋白质共价
结构发生改变。
• 酶选择性化学修饰： • 描述肽链侧链基团被化学试剂专一性地修饰。 描述肽链侧链基团被化学试剂专一性地修饰。
二、酶化学修饰的目的
第三章 酶的化学修饰
酶作为生物催化剂，其高效性和专 一性是其他催化剂无法比拟的，但是天 然酶的半衰期短，不稳定性等问题限制 了它的应用，如何延长半衰期，提高酶 的稳定性，降低抗原性等越来越引起人 们的关注了。酶的化学修饰是可以从分 子的水平上来改造酶，弥补天然酶缺陷 的一种重要的手段。
一、酶化学修饰的概念
1. 研究酶的结构与功能的关系。（50年代末） 研究酶的结构与功能的关系。（50年代末） 2. 人为改变天然酶的某些性质，扩大酶的应用范 围。（70年代末之后） 围。（70年代末之后） 1）提高酶的生物活性（酶活力）。 2）增强酶的稳定性（热稳定性、体内半衰期）。 3）消除抗原性（针对特异性反应降低生物识别能 力）。 4）产生新的催化能力。
②化学修饰数据的分析
•
化学修饰的时间进程分析 根据获得的 时间进程曲线，可以了解修饰残基的性质 和数目、修饰残基与蛋白质生物活性之间 的关系等，实际是通过测定蛋白质的失活 速度常数的测定。大多实验中，修饰剂远 远多于被修饰的残基，可认为是假一级反 应，然后用残余活力的对数对时间作图， 得出失活常数。
酶的化学修饰
酶的化学修饰第一节酶的分子修饰一、酶的化学修饰原因1、稳定性2、酶反应的最适条件3、酶的专一性4、米式常数过大5、临床应用的特殊要求6、酶种类的限制改变酶特性有两种主要的方法：1)通过分子修饰的方法来改变已分离出来的天然酶的活性。
2)通过基因工程方法改变编码酶分子的基因而达到改造酶的目的。
二、酶分子修饰通过各种方法使酶分子的结构发生某些改变，从而改变酶的某些特性和功能的技术过程称为酶分子修饰。
即在体外将酶分子通过人工的方法与一些化学基团（物质），特别是具有生物相容性的物质，进行共价连接，从而改变酶的结构和性质。
三、酶分子修饰的意义⏹提高酶的活力⏹增强酶的稳定性⏹降低或消除酶的抗原性⏹研究和了解酶分子中主链、侧链、组成单位、金属离子和各种物理因素对酶分子空间构象的影响化学修饰效果举例用纤维蛋白的专一性单克隆抗体修饰尿激酶，使其溶血栓性提高了100倍。
用乙醛酸修饰胰凝乳蛋白酶的表面氨基，形成亲水性的α－NHCH2COOH后，该酶对60℃热处理的稳定性增高了1000倍。
超氧化物歧化酶(SOD)、L-谷氨酰胺酶、L-天门冬酰胺酶、尿酸酶等用PEG(聚乙二醇)修饰后，完全消除了酶的抗原性和免疫原性，减慢了它们在动物血液循环中被清除的速度，酶的活力可以保存15％-45％。
四、酶化学修饰的基本原理1、如何增强酶天然构象的稳定性与耐热性修饰剂分子存在多个反应基团，可与酶形成多点交联。
使酶的天然构象产生“刚性”结构。
2、如何保护酶活性部位与抗抑制剂大分子修饰剂与酶结合后，产生的空间障碍或静电斥力阻挡抑制剂，“遮盖”了酶的活性部位。
3、如何维持酶功能结构的完整性与抗蛋白水解酶酶化学修饰后通过两种途径抗蛋白水解酶：A 大分子修饰剂产生空间障碍阻挡蛋白水解酶接近酶分子。
“遮盖”酶分子上敏感键免遭破坏。
B 酶分子上许多敏感基团交联上修饰剂后，减少了受蛋白水解酶破坏的可能性。
4、如何消除酶的抗原性酶蛋白氨基酸组成的抗原决定簇，与修饰剂形成了共价键。
酶的化学修饰
的保持时间。
＋ HCl
• 焦碳酸二乙酯（DPC)和碘代乙酸， DPC对 抗凝血、抗血栓、降血脂活性，修饰溶栓酶类增加疗效。
+ HI
+
2－羟基－5－硝基苄溴（HNBB)和4－硝基
组氨酸残基有较好的专一性，240nm。 交联剂是具有两个反应活性部位的双功能基团在相隔较近的两个氨基酸残基之间，或酶与其它分子之间发生交联反应。
修饰试剂应具备以下特征:
①选择性地与一个氨基酸残基反应; ②酶蛋白不变性; ③标记的残基在肽中稳定 ④反应的程度能用简单的技术测定。
2、反应条件的选择
①不造成蛋白质的不可逆变性。 ②有利于专一性修饰蛋白质。
3. 反应的专一性
①利用蛋白质分子中某些基团的特殊性。 例：二异丙基氟磷酸酯(DFP)能与胰凝乳蛋白
E－SH + R－S－S－R
E－S－S－R
+ R－SH
E－SH + E－S－S－R
E－S－S－E
+ R－SH
与—SH进行二硫键交换后，—SH被修饰，试剂 的另一半以单体放出。
常用的二硫键交换试剂： DTNB， 5, 5’-dithio-bis-(2-Nitrobenzoate)
二硫二吡啶，4, 4’-dithiodipyridine （或2, 2’-dithiodipyridine）
酶的化学修饰
概念
酶的化学修饰（Chemical modification） 化学手段将某些原子或化学基团结合到酶 分子上，或将酶分子中某基团改变，改变 酶的催化性质及一些生理生化性质。
易实现，作用快，成本
例如：
1、用乙醛酸修饰胰凝乳蛋白酶的表面氨基， 对60°C热处理的稳定性增高了1000倍。
第六章 酶分子化学修饰
三、研究酶活性中心的方法
1.物理学方法： 用X射线衍射法直接检测底物或其
类似物与酶形成的中间复合物（包括酶
和底物）的相对位臵。
2.化学修饰法：根据所用修饰试剂不同，分为
1)非专一性化学修饰
用非专一性的修饰试剂与氨基酸侧链基团作用。
若某基团被修饰后：
酶活性不变——该基团可能不是酶的必需基团
酶活性降低或丧失——该基团可能是酶的必需基团
Trp
吲哚基
N-溴代琥珀酰亚胺
但解释修饰效果须十分小心，因为： ①任何一种修饰剂不是绝对专一的。 ②有些修饰剂引起蛋白质构象变化——失活，
（二）小分子修饰 （酶蛋白侧链基团修饰）
•定义：通过选择性的试剂或亲和标记试剂与酶分
子侧链上特定的功能基团发生化学反应。
•侧链基团：组成蛋白质氨基酸残基上的功能团。
主要有：氨基、羧基、胍基、巯基、酚基、咪唑基。
•侧链基团修饰剂：采用的各种小分子化合物。
20种不同氨基酸的侧链基团中只有极性氨基 酸的侧链易被修饰，它们一般具有亲核性。
•酶的化学修饰（chemical modification）： 通过化学基团的引入或除去，使蛋白质共价 结构发生改变。 •酶选择性化学修饰：
描述肽链侧链基团被化学试剂专一性地修饰。
二、酶化学修饰的目的
1. 研究酶的结构与功能的关系。（50年代末） 2. 人为改变天然酶的某些性质，扩大酶的应用 范围。（70年代末之后）
二、活性中心的共性
(1)活性部位只占酶分子很小的一部分（1-2%）。 (2)活性部位是一个三维实体。 (3)活性中心构象不是固定不变的（诱导契合）。 (4)活性中心位于酶分子表面的疏水性裂缝中。 (5)酶与底物通过盐键、氢键、范德华力和疏水 作用等次级键结合。
酶的化学修饰名词解释
酶的化学修饰名词解释
在生物化学中，酶是一类能够加速化学反应速率的蛋白质，它们起到了催化剂的作用。
酶的化学修饰，指通过化学手段对酶的部分或全部氨基酸残基进行改变，以改变酶的活性、稳定性或选择性。
常见的酶的化学修饰包括：
•磷酸化：在酶的氨基酸残基上添加磷酸基团，调控酶的活性和细胞信号传递。
•糖基化：在酶的氨基酸残基上添加糖基团，参与酶的稳定性和识别特异性。
•乙酰化：在酶的氨基酸残基上添加乙酰基团，影响酶的催化效率。
•甲基化：在酶的氨基酸残基上添加甲基基团，参与基因表达调控。
酶的化学修饰对于生物体的正常功能发挥至关重要，也是研究生物化学和药物开发领域的重要方向之一。
第三章第三节酶化学修饰
B. 酶分子上许多敏感基团交联上修饰剂后， 减少了受蛋白水解酶破坏的可能性。
第三章第三节酶化学修饰
4）、如何消除酶的抗原性及稳定酶的微环境 A. 酶蛋白氨基酸组成的抗原决定簇，与修饰剂形成 了共价键。
破坏了抗原决定簇——抗原性降低乃至消除 “遮盖”了抗原决定簇——阻碍抗原、抗体结合 B. 大分子修饰剂本身是多聚电荷体，能在酶分子表 面形成“缓冲外壳”，抵御外界环境的极性变化，维 持酶活性部位微环境相对稳定。
第三章第三节酶化学修饰
三、原理
利用化学修饰剂所具有的各种基团的特性， 直接或间接地经过一定的活化过程与酶分子的 某种氨基酸残基发生化学反应，从而对酶分子 的结构进行改造。
第三章第三节酶化学修饰
四、修饰的一般程序
修饰反应 酸化 稀释
洗涤
过滤 干燥
阳离子交换
第三章第三节酶化学修饰
Байду номын сангаас、化学修饰方法
第三章第三节酶化学修饰
4、肽链的有限水解
酶原的激活，就是一种肽链的有限水解， 即肽链的水解在限定的肽键上进行，酶分子的 活性中心没有受到损伤，只是激活了酶的活性 或降低了酶分子的抗原性。
第三章第三节酶化学修饰
5、氨基酸置换修饰
氨基酸置换修饰
将肽链上的某一个氨基酸换成另一个氨基酸，引起
酶蛋白空间构象的改变，从而改变酶的某些特性和功能的
第三章第三节酶化学修饰
１）ＰＥＧ的修饰（常采用单甲氧基MPEG的 衍生物）
第三章第三节酶化学修饰
第三章第三节酶化学修饰
２）、右旋糖酐（可作代血浆用）及右旋糖酐 硫酸酯的修饰
酶化学修饰
b 酶共价连接于载体上的固定化，原则上 可以增加酶分子的构象稳定性，防止酶构 象伸展而失活。但酶与载体的连接点必须 达到一定数目，才能使酶构象坚固稳定。
c 固定化能改变酶对底物的亲和力。如果载 体和底物带相反电荷的话，米氏常数（Km） 将降低；带相同电荷时， Km将增加。
一、化学修饰在酶的结构与功能 研究中的应用
3. 测定酶分子中某种氨基酸的数量 当需要测定某一种氨基酸的数量时，就
可以定量的化学修饰方法，如用三硝基 苯磺酸测定氨基。
二、化学修饰酶在医学和 生物技术中的应用
作为生物催化剂的酶存在的问题： 酶是生物催化剂，它具有底物专一性强、
催化效率高和反应条件温和等显著特点， 但是与化学催化剂相比较,又有很多缺点
酶化学修饰
酶的表面化学修饰
大分子修饰 小分子修饰 交联修饰 固定化修饰
分子内部修饰 结合定点突变的化学修饰
1 酶的表面化学修饰
（1）大分子修饰 用可溶性大分子，如聚乙二醇、右旋糖
苷、肝素等，通过共价键连接于酶分子的 表面，形成一层覆盖层。要根据酶分子的 结构和修饰剂的特性选择适宜的水溶性大 分子。
第三章 酶蛋白的化学 修饰
第六节 酶化学修饰的应用
酶分子修饰的目的：
研究和了解酶分子中主链、侧链、组成单位、金 属离子和各种物理因素对酶分子空间构象的影响
提高酶的活力 增强酶的稳定性 降低或消除酶的抗原性
酶化学修饰的应用
化学修饰在酶的结构与功能研究中的应用 化学修饰酶在医学和生物技术中的应用 蛋白质化学修饰的局限性
肽链延伸后的修饰
用脲、盐酸胍或其他办法处理酶，使肽 链延伸，对内部疏水基团就行修饰，修饰 后重新折叠成具有催化活力构象。
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酶化学修饰的基本原理
3．抗蛋白水解酶 酶分子的基本结构是蛋白质，所以易受蛋
白酶的攻击而遭破坏。蛋白酶一般是作用于某 些特定氨基酸残基之间的酰胺键，修饰这些氨 基酸残基，可以阻止蛋白酶对这些酰胺键的攻 击。另外，交联于酶分子上的大分子修饰剂能 产生空间障碍，阻止蛋白酶接近攻击点，起到 “遮盖”敏感键的作用。
三、酶化学修饰方法的设计
酶化学修饰的基本原则都是充分利用修 饰剂所具有的各类化学基团的特性，直接或 经过一定的活化过程后与酶分子上的某种氨 基酸残基产生化学反应。
设计酶化学修饰方法时 的注意事项
a. 对修饰剂的要求 在选择修饰剂时一般要求修饰剂有较大的分子
量，良好的生物相容性和水溶性，修饰剂分子表面 有较多的反应活性基团，与氨基酸残基形成的共价 键稳定，容易鉴定 。
酶改造的两个水平
基因水平：有目的的改变基因中的核苷酸顺序， 从而改变酶的氨基酸顺序，以期获得化学结构更 为合理的酶蛋白。这是蛋白质工程的研究内容。
蛋白质水平：人们用化学法或酶法对已合的酶 的结构进行改造，一方面是切除部分肽链和置换 某些氨基酸，另一方面是使酶分子中的某些氨基 酸残基与一些化学试剂反应，加上一些特定的基 团，即酶的化学修饰。由于后一方面技术较为简 单，容易见效，所以这方面的工作做得最多。
高碘酸氧化法
由于反应产物A不稳定，所以用四氢硼钠还原成稳定产物B。用四氢硼钠还原 的反应比较激烈，对酶活性影响较大，因此可在酶与右旋糖酐之间加一个手臂来 减少酶的失活，如加一个联苯胺。
四、修饰剂及修饰反应
1．糖及糖的衍生物
（1）右旋糖酐及右旋糖酐硫酸酯 右旋糖酐是由α -葡萄糖通过α -1,6-糖苷键形
成的高分子多糖，具有较好的水溶性和生物相容性， 可用作代血浆。右旋糖酐硫酸酯是右旋糖酐分子中 的羟基与硫酸成酯而得。多糖链上的双羟基结构经 活化后可与酶分子上的自由氨基结合。双羟基的活 化除溴化氰法外，还有高碘酸氧化法。高碘酸能通 过氧化邻双羟基结构而将葡萄糖环打开，形成的高 活性醛基与酶分子上的氨基反应，使右旋糖酐和酶 共价结合。
酶化学修饰的基本原理
2．抗抑制剂 酶活性抑制剂是通过直接结合于酶的活性
部位来阻止酶与底物的结合，或是结合于酶的 其它部位后，影响了酶活性部位将底物转变成 产物。因此，阻止抑制剂与酶的结合是防止酶 活性被抑制的关键。酶经过化学修饰交联上大 分子修饰剂后，大分子修饰剂产生的空间障碍 或静电斥力就可能有效地阻挡抑制剂与酶的结 合，使酶抗抑制剂的能力增强。
酶化学修饰的基本原理
4．降低酶的抗原性 酶分子中有些氨基酸残基组成了抗原决定簇
，当外源蛋白进入人体后就会诱发产生抗体，抗 原抗体反应不仅会使酶失活，而且会对人体造成 伤害和危险。通过化学修饰，有些组成抗原决定 簇的基团与修饰剂形成了共价键，破坏了抗原决 定簇的结构，使酶分子的抗原性降低甚至消除。 大分子修饰剂也有“遮盖”抗原决定簇和阻止抗 原抗体结合的作用。
酶化学修饰的基本原理
5．稳定酶的微环境 由于酶分子各基团的极性和带电荷的不同，
以及各基团间相互作用的结果，使酶分子的局部 形成了一种微环境。这种微环境可以是极性的， 也可以是非极性的，但都直接影响着酶活性部位 氨基酸残基的电离状态，酶微环境的改变会对酶 的催化功能产生直接的影响。
酶经过化学修饰后，除能稳定酶的构象外， 还由于大分子修饰剂本身就是多聚电荷体，可在 酶分子表面形成一层“缓冲外壳”，在一定程度 上保护酶的微环境，使酶能在更广泛的条件下发 挥作用。
二、酶化学修饰的基本原理
1．提高酶的热稳定性 高度有序的天然构象是酶表现活性的必要条件，
天然构象是在酶分子内各种次级键（氢键、离子键、 范德华力）的作用下维持的。当温度升高时，有些次 级键遭到了破坏，原先平衡的力失去了平衡，导致分 子的构象发生变化，并可能产生一些新的次级键，形 成有序度降低的新构象，使酶变性失活。通过酶与化 学修饰剂的反应，有可能使酶的天然构象产生“刚性 ”，不易发生变化，同时减少分子内基团的热振动， 从而增强了酶的热稳定性。
酶应用的缺点
d. 临床应用的特殊要求：当前临床应用的大多数 酶来自动物、植物和微生物，对人体来说这些酶 都是外源蛋白质，它们具有抗原性，有可能引起 人体的过敏反应。这不但影响临床上的连续使用， 还可能导致生命危险。另外，酶进入人体后也常 会因一些蛋白酶、抑制剂或抗体的作用而失去活 性，特别是当酶进入人体后不能迅速到达或集中 于病灶时，这种情况尤为明显。
一、为什么要对酶进行 化学修饰
虽然酶催化化学反应有专一性强、效率高、 条件温和等优点，但也有一些严重的缺点，正 是这些缺点使得酶的应用受到很大的限制，酶 的用途还不够广泛，大规模使用酶的工业生产 还很少。
酶应用的缺点
a. 稳定性：酶是由细胞产生的生物活性大分子， 一旦离开细胞这个特殊的环境，常常显得不够稳 定，容易变性失活。
b. 催化反应时的条件：一般酶反应是在pH基本 接近中性，温度接近室温的水溶液中进行的。但 在工业应用上，由于底物和产物带来的影响，反 应时的pH常常不在中性范围内。温度升高有利 于提高反应速度，但酶失活也加快。当底物不溶 于水时，酶难以发挥作用。
酶应用的缺点
c. 酶的主要动力学性质不适应：米氏常数(Km) 值过大时，反应不能在低底物浓度下高速进行。 由于人体内各种代谢物质的浓度通常较低，Km 值过大的酶用于临床检测和治疗时，往往不能 得到良好的效果。有些底物或产物对酶活性有 抑制作用，也会影响酶反应的速度。
b. 对酶性质的了解 应了解被修饰酶的活性部位情况，活性部位由
哪些氨基酸残基组成。酶的稳定条件，酶反应的最 适条件，有哪些侧链基团可供修饰，及这些基团的 化学性质和反应活泼性等。
设计酶化学修饰方法时 的注意事项
c. 修饰反应条件的选择 修饰反应一般总是尽可能在酶稳定的条件下
进行，尽量少破坏酶活性功能的必需基团，得到 高的修饰率和高的酶活回收率。应做无修饰剂的 对照 。因此，选择反应条件时要注意酶与修饰 剂分子的比例，反应体系的溶剂性质、盐浓度和 pH，反应温度和反应时间。修饰反应的最适条 件一般要经大量的试验才能确定。