动物细胞工程制药
动物细胞工程制药
有该细胞系的历史资料 有该细胞特性的资料，要求100代以上传代稳定 无细菌、真菌、支原体和各种病毒
动物细胞产品质量要求——工程细胞
3.5.4 动物细胞产品质量要求——纯化工艺
生产厂房条件必须符合国家GMP规定 细胞培养尽量少用或不用小牛血清，要使用无热原水和无离子超净水 操作环境、柱体、洗脱液等的温度尽可能保持4度左右 所有器材、载体都需经无菌、无热源处理 应记录产品纯度、提纯倍数和回收率
3.5 动物细胞产品的纯化方法和质量要求
3.5.1 动物细胞产品纯化
工程细胞表达的产品与其它复杂成分混在一起，分离纯化难度大； 由于产品要用于人，对产品纯度要求高； 产物产量低，生物活性不稳定，增加纯化工艺的难度和复杂性； 细胞产品多样性，必须根据每一产品特点，研发专用的分离纯化技术。
3.5.2 常用纯化方法
生产用细胞库（MWCB）或称工作细胞库（WCB）
3.2 动物细胞培养的基本方法
细胞分离：离心分离和消化分离 细胞计数：自动细胞计数器计数、血球计数版计数、结晶紫染色细胞核计数法、MTT染色计数法。 细胞传代：悬浮细胞传代、贴壁细胞传代 细胞冻纯：采用液氮低温冻存法 细胞复苏：要求快融。
3.3 动物细胞大量培养的方法和操作方式
杂质检测：1）宿主细胞残余蛋白小于1/1000；2）残余DNA量小于100pg；3）血清残余小于100ppm；4）其他物质；5）细菌、病毒和支原体检测阴性；6）热源检测。 稳定性 临床前安全性和有效性评价 临床实验的安全性和有效性评价
3.6 动物细胞制药前景与展望
采用更强的启动子和增强子 更好的利用扩增系统或寻找高表达位点 采用或改造更好的宿主细胞
生物制药技术-第三章-动物细胞工程制药(6,7,8)
3,灌流式操作
O 该方式是当细胞和培养基一起加入反应器后，在细
O O
O
O
胞增长和产物形成过程中，不断地将部分条件培养 基取出，同时不断地补充新鲜培养基。它与半连续 式操作不同之处在于取出部分条件培养基时，绝大 部分细胞仍保留在反应器内，而半连续式培养则同 时也取出部分细胞。该操作方式是近代用动物细胞 培养生产各种药品中最受推崇的方式。它的优点是: ①细胞可处在较稳定的良好环境中，营养条件较好， 有害代谢废物浓度较低。 ②可极大地提高细胞密度般都可达 107~108个/ml，从 而极大地提高了产品产量。 ③产品在罐内停留时间缩短，可及时收留在低温 下 保存，有利于产品质量的提高。 ④培养基的比消耗率较低.加之产量质量的提高，生 产成本明显降低。
2.半连续式操作
O 该方式是当细胞和培养基一起加入反应器后，
在细胞增长和产物形成过程中，每间隔一段 时间，取出部分培养物，或单纯是条件培养 基，或连同细胞、载体一起，然后补充同样 数量的新鲜培养基，或另加新鲜载体继续培 养。该操作方式在动物细胞培养和药品生产 中被广泛采用，它的 优点是操作简便，生产 效率高，可长时期进行生产，重复收获产品， 而且可使细胞密度和产品产量 一直保持在较 高的水平。
O 生产疫苗中早期一般多采用转瓶大量
培养原代鸡胚或肾细胞。近代有些生 物制品的生产仍在采用这种方法，为 减少劳动强度，采用了计算机自动控 制的方法。另一种被普遍采用的贴壁 培养方法是固定床式生物反应器，但 由于该反应器中传质和传氧常会出现 梯度式不均一现象，故放大常受到限 制。 O 贴壁培养与悬浮培养的另一个不同之 处是在传代或扩太培养时常常需要用 酶将其从基质上消化下来，分离成单 个细胞后再进行培养。
3. 贴壁-悬浮培养，或称假悬浮培养
动物细胞工程在医药生产中的应用
动物细胞工程在医药生产中的应用生物技术的飞速发展，为医药生产带来了一次革命性的变革。
动物细胞工程是一种基于细胞的生物技术，通过基因重组技术，对动物细胞进行改造，使它们能够表达制造高质量蛋白的基因。
这种技术已经被广泛应用于医药生产领域，可以生产出高质量、高效、低成本、安全的生物药。
本文将对动物细胞工程在医药生产中的应用进行探讨。
1. 动物细胞工程的概念动物细胞工程是基于细胞的生物技术，主要应用于生产蛋白类药物。
它利用基因工程技术，对动物细胞进行改造，使其能够表达和分泌特定蛋白。
这样，就可以利用这些细胞生产高质量、高效、低成本的生物药。
2. 动物细胞工程的优势与传统化学合成制药方法相比，动物细胞工程具有以下优势：（1）生产高质量、高效的药物动物细胞工程可以确保药物的高质量和高效性。
相比之下，传统的制药方法往往会伴随着药物品质不稳定、副作用大等问题。
（2）低制药成本动物细胞工程可以大量生产药物，成本低，能够产生更好的经济效益。
（3）适应性广泛动物细胞工程适应性广泛，能够生产多种类型的生物药，包括重组人类蛋白、单克隆抗体、疫苗等。
（4）安全性高动物细胞工程生产的生物药一般都是高度纯化的，病原微生物污染的风险小。
3. （1）生产重组人类蛋白动物细胞工程已经成功地用于生产一些重要的重组人类蛋白，例如：人类干扰素、人类EPO、人类生长激素等。
这些蛋白已被证明在治疗人类健康问题方面具有重要作用。
（2）生产单克隆抗体单克隆抗体已经用于治疗多种疾病，如肿瘤、关节炎、多发性硬化等。
通过基因工程技术，可以大量生产单克隆抗体。
动物细胞工程生产的单克隆抗体具有更好的能够生产的稳定性和效能，自然更加被人们所接受。
（3）疫苗动物细胞工程还用于生产各种类型的疫苗，包括病毒疫苗、癌症疫苗和细菌疫苗。
这些疫苗大部分都是通过基因工程技术生产，对提高药品效力和安全性有重要作用。
4. 动物细胞工程的局限性虽然动物细胞工程在医药生产中具有诸多优势，但仍然存在一些局限性，例如：（1）系统复杂、技术门槛高动物细胞工程涉及到的技术非常复杂，需要多种技术的综合应用。
动物细胞工程制药
动物细胞工程制药导语动物细胞工程制药是一种利用动物细胞进行生物制药的技术。
该技术已经取得了显著的进展，并在医药领域发挥着重要作用。
本文将介绍动物细胞工程制药的原理、应用和前景。
一、动物细胞工程制药的原理动物细胞工程制药是利用动物细胞系统表达和生产药物的一种技术。
其主要原理包括以下几个步骤：1.动物细胞培养：首先需要选择合适的动物细胞系，并进行培养。
常见的动物细胞系包括CHO细胞、HEK293细胞等。
细胞培养的条件包括培养基、培养温度、培养时间等。
2.基因克隆和转染：将药物的基因通过基因克隆技术导入到动物细胞中，使其具有产生目标药物的能力。
转染的方式包括质粒转染、病毒转染等。
3.细胞培养和增殖：转染后的细胞需要在培养条件下进行生长和增殖。
通常会添加适当的生长因子和培养基来促进细胞的生长。
4.产物分离和提纯：最后，通过适当的方法分离和提纯目标药物，可以使用离心、超滤、层析等技术进行分离纯化。
二、动物细胞工程制药的应用动物细胞工程制药已经广泛应用于医药领域，为药物的研发和生产提供了重要的技术支持。
其主要应用包括以下几个方面：1.蛋白质药物生产：利用动物细胞工程制药技术可以生产多种重要的蛋白质药物，如抗体、细胞因子等。
这些蛋白质药物在治疗癌症、免疫性疾病等方面具有重要作用。
2.疫苗生产：动物细胞工程制药技术也可以用于疫苗的生产。
通过导入相应的病原体基因到动物细胞中，使其产生病原体相关的抗原，从而制备疫苗。
3.基因治疗：动物细胞工程制药技术还可以用于基因治疗。
通过将目标基因导入到患者的细胞中，实现对基因相关疾病的治疗。
4.抗病毒药物：某些动物细胞工程技术还可以用于抗病毒药物的生产。
通过将抗病毒基因导入到动物细胞中，使其产生抗病毒蛋白，从而对抗病毒感染。
三、动物细胞工程制药的前景随着基因工程和生物技术的不断发展，动物细胞工程制药在未来的前景十分广阔。
以下是动物细胞工程制药的一些未来发展趋势：1.技术的进一步成熟：随着技术的不断发展，动物细胞工程制药技术将变得更加成熟，能够更准确、高效地生产药物。
第3章 动物细胞工程制药
防止HIV传播，但至今未进入临床研究，原因也是生产 量不够 。
➢ 还有很多药物不仅发展中国家用不上，即便是发达国家
也难以使用，估计有80%的血友病患者无药可用，主要 是生产能力不足。
➢ 生产能力不足也导致其价格不菲。
6 我国动物细胞工程制药的目标
单克隆抗 体技术
诊断流感病毒类 型和狂犬病治疗
抗体与药物结合，能定位杀 灭肿瘤细胞，避免和减少对 正常细胞的伤害，大大减少 抗癌药物的不良反应。
生物导弹
通过大量的细胞培 养获得细胞产品
鹿茸细胞
动物细 胞培养
病毒抗原的制备和疫 苗的生产
带状疱疹 水痘 传染 性肝炎疫苗
➢ 目前全世界生物技术药物中使用动物细胞工程
依赖性、接触抑制性及功能全能性： ⑤ 培养过程产物分布于细胞内外，反应过程成本较高，但产品价格昂贵； ⑥ 大规模培养时，不可照用微生物反应的经验；
⑦ 原代培养细胞一般繁殖50代即退化死亡。
动物细胞培养的应用
疫苗 人 动物
单克隆抗体 免疫调节剂 酶 激素
动物细胞培养的产物 小儿麻痹症疫苗、狂犬疫苗、风疹疫苗、脑炎疫 苗、疱疹疫苗等
细胞 COS CHO BHK MDCK MRC-5 Namalwa Vero WI-38
来源 非洲绿猴肾细胞 中国仓鼠卵巢细胞 仓鼠肾细胞 狗肾细胞 人胚肺组织细胞 淋巴母细胞样细胞 猴肾脏成纤维细胞 胚肺组织细胞
用途 小规模量单抗 表达重组蛋白 生产畜用疫苗 生产畜用疫苗 产生人用疫苗 生产a-干扰素 生产人用制品 生产人用疫苗
2．纯化蛋白 利用单抗对抗原（目的蛋白）的特异性结合性质，制备蛋白纯化柱。
3．医学诊断 用于疾病的诊断，包括癌症、肝炎病毒、SARS病毒、细菌及血吸虫 等数百种疾病的诊断；
《动物细胞工程制药》课件
利用动物细胞生产生长因子和蛋白质药物案例
总结词
利用动物细胞生产生长因子和蛋白质药物是动物细胞工程制药领域的另一个重要应用。
详细描述
生长因子是一类能够刺激细胞生长和增殖的蛋白质，可以用于治疗某些疾病，如烧伤、 溃疡等。例如，碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）是一种重要的生长因子，可以通过 动物细胞培养技术生产。此外，许多蛋白质药物也是通过动物细胞培养技术生产的，如
关键突破
未来展望
随着技术的不断进步和应用领域的拓 展，动物细胞工程制药将有望成为未 来药物生产的主流技术，为人类健康 事业做出更大的贡献。
进入21世纪后，随着基因工程技术的 发展和成熟，动物细胞工程制药取得 了关键性突破，实现了大规模生产。
01
动物细胞工程制药 技术
动物细胞培养技术
动物细胞培养技术是指将动物细胞置于适宜的培养条件下，使其在体外生长繁殖的 技术。
培养基是动物细胞培养的核心要素，为细胞提供必要的营养物质、生长因子和激素 等。
动物细胞培养技术可用于生产疫苗、单克隆抗体等生物药物，以及进行药物筛选和 毒理学研究等。
动物细胞基因编辑技术
动物细胞基因编辑技术是指通过基因 工程技术对动物细胞的基因进行精确 的改造和修饰。
动物细胞基因编辑技术可用于研究基 因功能、疾病治疗和生物育种等领域 。
目前最常用的基因编辑技术是 CRISPR-Cas9系统，它能够高效地实 现对特定基因的敲除、敲入和点突变 等操作。
动物细胞大规模培养技术
动物细胞大规模培养技术是指通 过一定的生物反应器系统，实现 动物细胞在体外的大规模培养和
扩增。
生物反应器是动物细胞大规模培 养的核心设备，根据不同的培养 条件和应用需求，可选择不同类
工程动物细胞培养制药工艺过程
工程动物细胞培养制药工艺过程工程动物细胞培养制药工艺过程是一种利用动物细胞培养技术来生产各种药物的方法。
该过程通常包括以下几个步骤：1. 动物细胞的选取和培养基的准备：首先，需要选择合适的动物细胞作为生产细胞株。
通常使用哺乳动物细胞，如CHO细胞等。
然后需要准备培养基，培养基中包含了生长和繁殖细胞所需的营养物质、生长因子和其他必要的成分。
2. 细胞的扩增和传代：将选取好的动物细胞接种在培养基中，通过提供适当的温度、pH和氧气浓度等环境条件，使细胞可以持续增殖和扩增。
当细胞达到一定的密度时，需要将其传代到新的培养器中，以维持细胞的生长状态。
3. 细胞的表达和分泌：在培养过程中，可以向培养基中添加适当的诱导剂，促使细胞表达和分泌所需的药物。
细胞内的基因表达会产生药物的前体分子，然后通过细胞分泌系统将其释放到培养基中。
此外，细胞内的代谢途径也会参与药物的合成和修饰。
4. 收集和纯化药物：当细胞分泌出药物后，需要对培养基进行采集和处理。
这通常包括离心和过滤等步骤，以去除细胞碎片和其他杂质。
然后可以通过柱层析、电泳或其他分离技术对药物进行纯化，以得到纯度较高的药物样品。
5. 进一步的处理和制剂制备：在得到纯化的药物后，可以进行进一步的处理和制剂制备。
这包括稳定性研究、配方优化和药物制剂的制备等。
最终，通过临床试验和质量控制等步骤，可以得到最终用于临床应用的制药产品。
总结而言，工程动物细胞培养制药工艺过程是一个复杂的生产过程，需要合理设计培养条件、监控细胞生长和药物表达等关键参数。
同时，也需要严格的质量控制和合规操作，以确保药物的质量和安全性。
这一过程在现代制药工业中扮演着重要的角色，为生产高质量的药物提供了可靠的方法。
工程动物细胞培养制药工艺过程是一种利用动物细胞培养技术来生产各种药物的方法，广泛应用于药品研发和制造领域。
它比传统的化学合成方法更安全、高效，并能够生产出高质量的药物。
在工程动物细胞培养制药工艺中，动物细胞株的选取是至关重要的一步。
动物细胞工程制药
动物细胞技术需要进一步研究和开发的工作：
(1) 动物细胞基因工程技术和杂交技术。 (2) (3) (4) (5) 新型细胞培养反应器及其培养技术。 无血清、低蛋白或无蛋白培养基。 新型微载体研制技术及微囊化技术。 产物分离纯化技术。
§4.2 动物细胞的形态和生理特点
一、动物细胞的形态
适应功能,形态各异。 离体培养细胞分两类： 贴壁细胞 悬浮细胞
BHK-21 （baby hamster kidney） :从生
长1天的地鼠幼鼠肾脏中分离的;成纤维样
细胞,核型为2n=44,异倍体;培养基为DMEM 加7%胎牛血清。用于增殖病毒，包括多瘤 病毒、口蹄疫病毒、狂犬病毒等并制作疫 苗，现已用于工程细胞构建。 重组凝血因子Ⅷ。
Vero：从正常成年非洲绿猴肾脏
第四章 动物细胞工程制药
Hale Waihona Puke 主要内容1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8.
9.
概述 动物细胞的形态和生理特性 生产用动物细胞 动物细胞的培养条件和培养基 动物细胞培养方法和操作方式 动物细胞生物反应器 动物细胞产品的纯化方法和质量要求 动物细胞产品的制造实例 动物细胞制药的前景与展望
原核细胞与真核细胞区别
一、培养基的基本要求
1. 营养成分
维生素：
主要是辅酶、辅基，必不可少。生物素、叶酸、烟酰胺 、泛酸、吡哆醇、核黄素、硫胺素、维生素B12 都是培养基 常有的成分。 无机离子与微量元素: 细胞生长除需要钠、钾、钙、镁、氮、磷等基本元素 ，还需要微量元素，如铁、锌、硒、铜、锰、钼、钒等。
一、培养基的基本要求
对理化因素敏感， 如：渗透压、pH、离子浓度、
剪切力、微量元素等。
生化药物制备第三章、动物细胞工程制药
1
超滤系统
通过超滤膜过滤去除杂质， 浓缩目标产物。
离心机
进一步分离纯化细胞和细胞 器。
冻干机
用于制备干粉制剂，保护药 物活性成分。
制剂生产设备
01
灌装机
将药液灌装到安瓿、西林瓶等包装 容器中。
贴标机
在包装容器上贴上标签，标明药品 信息。
03
02
封口机
对灌装好的包装容器进行封口，保 证密封性。
针对所选细胞系，筛选和优化培养基 成分，以满足细胞生长和产物表达的 需求。
细胞培养条件控制
对细胞培养过程中的温度、pH值、 溶解氧等关键参数进行严格控制，确 保细胞正常生长和增殖。
细胞扩增技术
采用适当的细胞扩增技术，如微载体 培养、流加培养等，实现细胞的大规 模扩增。
中游工艺：目标产物分离纯化
收获与预处理
随着精准医疗的发展，动物细胞 工程制药将更加注重个性化治疗
药物的研发和生产。
03
监管政策日益严格
面对不断加强的药品监管政策， 企业需要加强质量管理体系建设
，确保产品质量和安全。
02
新技术不断涌现
基因编辑、细胞重编程等新技术 将为动物细胞工程制药带来更多
创新机遇。
04
国际合作与竞争并存
加强国际合作，学习借鉴国际先 进经验和技术，同时积极应对国
05 动物细胞工程制药设备与 设施
细胞培养设备
生物反应器
用于大规模培养动物细胞，提 供恒定的温度、pH值、溶解 氧等条件。
离心机
用于细胞分离、沉淀和洗 涤等操作。
培养箱
提供细胞生长所需的恒温、 恒湿、无菌环境。
显微镜
观察细胞生长状态和形态 变化。
3.动物细胞工程制药汇总
IgG、IgM、IgA等
免疫调节剂 酶 激素
β -细胞生长因子、INT、白细胞活化因子、血清 胸腺因子、IL、胸腺素、巨噬细胞毒力因子等
uPA、Asn酶、胶原酶、P450、纤维蛋白溶酶原激 活剂、胃蛋白酶、胰蛋白酶、Tyr脱羟酶等
（二）基因工程细胞系的构建 在生产中采用更多的、更有前景的是融合细胞，和
采用基因工程手段构建的各种工程细胞 基因工程细胞系：用基因工程技术或细胞融合技术
对宿主细胞的遗传物质进行修饰改造或重组，获得 具有稳定遗传的独特性状的细胞系 分杂种细胞(hybrid cell)和重组细胞 (reconstituted cell)
现在CCL已被广泛用于人用治疗性药物的生产，但 仍不是理想的生产细胞系。
3. 转化细胞系(transformant cell) 通过某个转化过程形成的，失去正常细胞的特点。
由于染色体的断裂变成异倍体，获得无限增殖的 能力 自发的：正常细胞中自发的转化形成有无限生
命力的细胞系；多发生于啮齿类细胞动物 人为转化：采用某些病毒SV40或某些化学试剂 从动物肿瘤组织中建立的细胞系
转化细胞为永生化细胞，无限细胞系，连续细胞 系
转化细胞具有无限生命力，倍增时间短，对培养 条件和生长因子等要求低，更适于大规模工业化 生产
在生物制药中，可通过改造宿主细胞特性，如延 长细胞周期, 提高工程细胞原始表达水平等来提高 药物的产量。
Namalwa、CHO、BHK-21、Vero细胞。
如：HAV、HBV、麻疹病毒、I型和II型HSV、EBV，狂 犬病毒等抗原基因，经基因重组后而制成的牛痘苗病毒
第三章动物细胞工程制药
•2 细胞工程的研究范畴
•动物细胞与组织培养 •植物细胞与组织培养 •细胞融合 •细胞核移植 •染色体工程 •胚胎工程 •干细胞与组织工程 •转基因生物与生物反应器
•4
名词解释 细胞工程
思考题
填空
——是一切动、植物生命体的基本组成单位 。
•5
第二节 动物细胞的形态和生理特
征
一、动物细胞的形态
•22
一、动物细胞的培养条件
1.器材的清洗和消毒
（1）器材的清洗（了解）
玻璃器皿的清洗
浸泡
刷洗
浸酸
冲洗
•23
•常用培养器皿及清洗 • 橡胶制品清洗 • 新的橡胶制品洗涤方法：0.5mol/L NaOH 煮沸 15 分钟，流 水冲洗，0.5mol/L HCl 煮沸 15 分钟，流水冲洗，自来水煮沸 2 次，蒸馏水煮沸 20 分钟，50℃ 烤干备用。 •塑料制品的清洗 •塑料制品特点：质软、易出现划痕；耐腐蚀能力强、但不耐热。 清洗程序：使用器皿后立即用清水清洗，浸于自来水中过夜，用
优点：操作简单，无化学毒性，融合同步，融合率 高，可在显微镜下观察全过程。
决定因素：电场强度、脉冲宽度、温度、缓冲液的 性质（PH、I和渗透压）
5.重组工程细胞系 可采用基因工程的手段构建各种工程细胞。
•17
四、细胞库的建立
生产用的工程细胞必须建立两个细胞库： ⒈原始细胞库（master cell bank,MCB) ⒉生产用细胞库(manufacturer working cell bank,MWCB)
特点：①细胞分裂不受细胞密度影响，无接触抑
制现象，性状不规则
②具有无限生命力，倍增时间短
③对培养条件、生长因子要求低
生物制药第三章动物细胞工程制药
⽣物制药第三章动物细胞⼯程制药⽣物制药第三章动物细胞⼯程制药第⼀节概述第⼆节动物细胞的形态和⽣理特点第三节⽣产⽤动物细胞的要求和获得第四节动物细胞的培养条件和培养基第五节动物细胞培养的⽅法和操作⽅式第六节动物细胞⽣物反应器及其检测控制系统第七节动物细胞制药的前景和展望1665年英国物理学家虎克Hooke⽤⾃制的显微镜发现了细胞实际上是死细胞留下的细胞壁1673年荷兰科学家列⽂虎克才真正观察到了细胞-细菌1838年德国的植物学家Schleiden 观察到植物细胞1839年动物学家Schwann 观察到动物细胞。
??从此认为细胞是⼀切动植物体结构和功能的基本单元并创⽴了细胞学说。
第⼀节第⼀节概概述述??1885年德国⼈Roux⽤⽣理盐⽔培养鸡胚组织。
??1897年德国⽣理学者Loeb证明从⾎液和结缔组织中分离到的细胞可以在⾎清和⾎浆中存活。
??1903年Jolly观察到蝾螈细胞可以进⾏体外分裂。
??1907年Harrison 在凹玻⽚的淋巴液内⽆菌条件下培养了离体的蛙胚神经组织。
将组织或细胞从机体取出在体外模拟机体体内⽣理条件进⾏培养使之⽣存和⽣长已有近百年历史了。
第⼀节第⼀节概概述述随着细胞⽣物学、分⼦⽣物学、⽣物化学和基因⼯程等⼀系列学科和技术的发展逐渐形成了细胞⼯程学。
以细胞为单位按⼈们的意志应⽤⽣物学、分⼦⽣物学等理论和技术有⽬的地进⾏精⼼操作使细胞的某些遗传特性发⽣改变从⽽达到改良或产⽣新品种的⽬的以及使细胞增加或重新获得产⽣某种特定产物的能⼒从⽽在离体条件下进⾏⼤量培养、增殖并提取出对⼈类有⽤的产品。
动物细胞药物疫苗、淋巴因⼦、纤维蛋⽩溶酶原激活剂、单克隆抗体………细胞⼯程包括真核细胞的基因重组、导⼊、扩增和表达的理论和技术细胞融合的理论和技术细胞器特别是细胞核移植的理论和技术染⾊体改造的理论图际踝蚨参锏睦砺酆图际跸赴罅颗嘌睦砺酆图际跻约敖泄夭锾崛〈炕睦砺酆图际酢细胞膜:由⼀层⽣物膜组成是细胞与周围环境的分隔。
生物技术制药_03-动物细胞工程制药-9.25
动物细胞工程制药
动物细胞培养技术
动物细胞培养基和添加剂 —— 血清
血清的成分：没有完全明确
蛋白质：白蛋白、球蛋白、转运铁蛋白等
激素：主要是细胞因子类，如生长因子等
代谢物、营养物、无机盐 抑制物
血清营养丰富，极易染菌、染毒 血清批次之间性质有差别，质量不稳定 成本高昂，且对产物分离有一定影响
操作过程（贴壁细胞）： 1.弃使用过的细胞培养基
（二）细胞的传代(subculture)：从原培养容器中分离细胞
2.清洗：使用PBS平衡盐溶液清洗细胞。
3.消化：加入消化液(trypsin)到长着细胞的一面。 孵育 在5-15分钟，仔细监测细胞分离过程，避免细胞受损伤。
4.吹打：当细胞变圆、离开培养皿底部时， 加入培养基， 通过移液管在细胞表面反复吹打分散细胞。计数并再次 培养细胞。
保持一定的营养，细胞仍可存活一段时间，但细胞密 度不再增加。 一旦细胞转化为异倍体后，该现象消失，细胞可多层 生长，细胞密度可大大增加。
动物细胞工程制药
接触抑制
动物细胞工程制药
动物细胞培养所需仪器设备
动物细胞培养器具
动物细胞工程制药
动物细胞培养所需仪器设备
实验室要求
（A）和缓冲间相连，缓冲间内备消毒服装和鞋，口罩等， 入内换上。 （B）室内空气不流通，有适当的光线，清洁，干燥。 （C）侧部可设传递窗，用于物品传递。 （D）有消毒用紫外线灯
动物细胞工程制药
细胞系的选择
几个概念
细胞系（cell line）
由原代培养经传代培养纯化，获得的能在体外生存的细胞群体
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• （2）MRC-5：特性和用途与WI-38相似，
1966年来源于14周正常男性，对多种人的病 毒敏感，用于疫苗的生产。
• （3）CHO-K1：1957年从中国地鼠卵巢中分
离的一株上皮样细胞。在培养时需加入脯氨
酸。核型为2n=20~22。目前广泛用于构建工 程细胞的是一株缺乏二氢叶酸还原酶的营养 缺陷突变株CHO-dhfr-，它常用的培养基为 DMEM培养基，加0.1 mol/L次黄嘌呤和
产品中DNA残留量。
• 1、原代细胞：是直接取自动物组织、器官，
经过粉碎、消化而获得的细胞悬液。一般1g
组织约有109个细胞。 鸡胚细胞、原代兔肾或鼠肾细胞、淋巴细胞 费钱费劳力
• 2、二倍体细胞系：原代细胞经过传代、筛选、
克隆，从而从多种细胞成分的组织中挑选并 纯化出某种具有一定特征的细胞株。
• 随机的，无法人为控制，同时融合率较低。
（2）PEG诱导融合
• 当二种不同的动物细胞混合物中存在PEG时，就会产生细胞聚 集作用。在除去PEG的过程中，即产生细胞融合现象。 • 所用的PEG分子量在1000-6000之间，一般浓度为40-50%，在 37℃下作用2-3分钟，其促融效果最佳。 • PEG促融合的作用机理不清，其促融作用也具有随机性，无法 人为控制。
细胞的分化（或特化）
形态分化在离体培养同样也存在。 离体培养的细胞分为两类： 贴壁依赖型（anchorage-dependent）和 非贴壁依赖型（anchorage-independent），前 者可简称为贴壁细胞，后者可简称为悬浮细胞。
动物细胞 结构图
• 1、贴壁细胞
特点：支持物 两种形态，即成纤维样细胞型或上皮样细胞型。前 旋涡状或火焰状走行；后者主要来源于外胚层和内
动物细胞工程制药
张忠山
生命科学学院
• • • • • • •
一、概述 二、动物细胞的形态和生理特点 三、生产用动物细胞的要求和获得 四、动物细胞的培养条件和培养基 五、动物细胞培养的方法和操作方式 六、动物细胞生物反应器及其检测控制系统 七、动物细胞制药的前景和展望
第一节 概述
• （1）发现细胞和细胞学说创立。1665年英
S 期：DNA的合成，一般为6~8小时
• G2期：DNA量加倍，RNA合成和染色体螺旋
化，持续时间短，一般为2~5h。 • M期：一般持续时间很短，仅0.5~1h。相当于 有丝分裂的中后期和末期，主要是染色体的 变化、分裂，并形成子细胞。
• 细胞分裂代数与培养中的代数及相互关系。
• 2、细胞生长需贴附于基质，并有接触抑制现 象 • 大多数正常二倍体（dipoid）细胞的生长都需 要一定的基质（如玻璃，塑料等）上贴附， 伸展后才能生长增殖，其机制可能与电荷、 钙镁离子的作用以及许多贴附因子有关。
10%胎牛血清。目前已经被广泛用于高效表达外
来蛋白制品。
四、基因工程细胞的构建和筛选
• 原代细胞、二倍体细胞系和转化细胞系三者在生
产中都有使用，但在生产中采用更多的、更有前 景的是融合细胞及采用基因工程手段构建的各种
工程细胞。当前被用以构建工程细胞的动物细胞
有CHO-dhfr-、BHK-21、Namalwa、Vero、 SP2/0和Sf-9等细胞。 • 那么如何获得动物工程细胞呢？
合的方法，从有抗羊红细胞活性的BALB/c小鼠 的脾细胞和骨髓瘤细胞系P3X63Ag8融合的杂交 瘤SP2/HL-Ag亚克隆中分离得到。它不分泌任 何免疫球蛋白抗体链，能耐受8-氮鸟嘌呤（8-
azaguanine）20g/ml，但在含HAT选择培养基
中不能存活。通常用的培养基为DMEM培养基， 添加10%胎牛血清。
促融因素
（1）病毒诱导融合 （2）PEG诱导融合 （3）电场诱导融合 （4）其它诱导融合
（1）病毒诱导融合
• 仙台病毒、流感病毒、新城疫鸡瘟病毒、疱 疹病毒等 • 当二种不同的动物细胞混合物中存在大量病 毒时，病毒或其组分会在细胞间起粘连作用 而使细胞聚集成团，细胞膜上的蛋白质和脂 质双分子层产生重排、进而结合成一个整体。
• （8）Sf-9：1983年从亲代IPLB-SF21 AE中克隆 形成。亲代细胞则在1977年从秋粘虫
（Spodoptera frugiperda)的蛹卵组织中分离获得。
它对苜宿尺蠖核型多角体病毒（Autographa
california MNPV）和其他杆状病毒（Baculovirus）
高度敏感。通常用的培养基为Grace培养基，添 加3.3g/L 水解乳蛋白和3.3g/L酵母浸液，以及
三、常用生产用动物细胞的特性
• （1）WI-38：1961年来源于女性高加索人正常
胚肺组织的二倍体细胞系，核型2n=46。该细 胞是成纤维细胞，能产生胶原，培养基用BME （Eagle’s basal medium）加小牛血清，pH控 制在7.2，同工酶为G6PD B型。细胞的倍增时
间为24h，有限寿命为50代，上世纪60年代被
第三节 生产用动物细胞的要 求和获得
• 一、生产用动物细胞的要求
• 二、生产动物细胞的获得
• 三、常用生产用动物细胞的特性 • 四、基因工程细胞的构建和筛选 • 五、细胞库的筛选
传代细胞的要求
• 正常原代细胞 二倍体细胞 无限制
• 癌细胞生产药物需谨慎！
一、生产用动物细胞的要求
• （1）原代正常组织分离的细胞 • （2）二倍体细胞，即使是传代细胞 • （3）传代细胞用于生产 • （4）按照FDA对细胞株的要求，控制最终
1、真核细胞基因表达 载体的构建
• 目前一般使用的载体有两类：一是病毒载体， 如牛痘病毒、腺病毒和逆转录病毒和杆状病
毒等。牛痘病毒已被广泛地用来构建成多价
疫苗，腺病毒和逆转录病毒载体正被试用用 于基因治疗中，而杆状病毒载体-昆虫细胞 系统已被成功地用于300多种外源基因的高 效表达。
• 用杆状病毒做载体有许多优点：
（3）电场诱导融合
• 将二种细胞混合物经过10-100V/cm的低强度非均匀交变电 场作用时，细胞之间就会发生紧密接触，形成稳定的串珠状 偶极子排列。在此基础上再对细胞实施瞬间高强度电脉冲就 会发生膜击穿，不同细胞间通过膜脂质分子重排就能实现融 合，形成一个双核或者多核的细胞。 • 一般来说，击穿电压为0.5-10KV/cm，作用时间为30-50微 秒。 • 电场诱导融合不损伤细胞，具有可人为操作的控制的特性， 融合率较高。
• （4）细胞工程制药成为现代制药技术中常用的手段。
应用领域
• 生产药品：作为宿主细胞表达生产原核细胞
所不能生产的药用蛋白。 • 基础研究的细胞材料：细胞模型 • 种子细胞：为组织修复与器官再生提供种子 细胞。
第二节 动物细胞的 形态和特点
• 一、动物细胞的形态
• 二、动物细胞的生理特点
一、动物细胞的形态
4、动物细胞对周围环境比较敏感 无细胞壁保护，因而外界的物理化学因素很容易 产生影响。 5、动物细胞培养基的要求高 8种以上的维生素、多种无机盐和微量元素、作为
与细菌和植物细胞不同，其需要12种必需氨基酸、 主要碳原的葡萄糖以及多种细胞生长因子和贴附因
子，而且不同种类要求又有变化。
• 6、动物细胞蛋白合成途径和修饰功能与细菌不 同 • 场所：游离的核糖体以及粗面内质网上的核糖体， 前者合成的蛋白质都用于细胞质基质内，后者上
Burkitt淋巴瘤的病人体中，后在瑞典构建的一
株人的类淋巴母细胞，高细胞有2.8%的高倍 体率，多数细胞有12~14条标记染色体，单条
X染色体，无Y染色体。通常用的培养基为
RPMI 1640，添加7%胎牛血清。用于大规模 生产-干扰素。
• （7）SP2/0-Ag14：该细胞是1978年中通过融
国物理学家Hooke通过自制的显微镜观察切
成薄片的软木时看到死细胞的细胞壁。 • （2）组织培养或细胞培养。1885年德国生 理盐水培养鸡胚组织，至1907年，细胞体外 培养宣布进入一个新时代。
• （3）细胞工程学时代。对细胞进行人工改造及培养 以使其为人类服务的时代，包括真核细胞的基因重组、
导入、扩增和表达的理论和技术，细胞融合的理论和 技术，细胞器特别是细胞核移植的理论和技术，染色 体改造的理论和技术，转基因动、植物的理论和技术， 细胞大量培养的理论和技术，以及产物分离纯化的理 论和技术。
（1）该病毒基因组是双链DNA，容易进行重组。
（2）插入7~8kb的DNA不影响正常病毒粒子的
形成。
（3）多角体蛋白和病毒粒子的形成无直接关系， 因此用外源基因更换多角体蛋白基因，仍能形 成有感染力的病毒粒子。
（4）多角体蛋白基因有非常强的启动子，产生 的蛋白质可占全部蛋白质的20~30%。 （5）用光学显微镜可看到多角体，容易以此为 标记物来挑选阳性克隆。 （6）如果用家蚕杆状病毒，还可在蚕体直接表 达外源基因。
者主要来源于中胚层组织的细胞，生长时呈放射状、
胚层组织的细胞，生长时彼此紧密连接成单层细胞
片。
• 2、悬浮细胞
这类细胞的生长不依赖支持物表面，可在培养
液中呈悬浮状态生长，如血液的淋巴细胞和用以生
产干扰素的Namalwa细胞等，细胞呈圆形。
• 3、兼性贴壁细胞
兼具上述两种生长方式的细胞，称为兼性贴
• （5）Vero：1962年来源于正常的成年非洲绿
猴肾。是贴壁依赖的成纤维细胞，2n=60，高
倍体率为1.7%，可持续地进行培养。通常用的 培养基为199培养基，添加5%胎牛血清。该细
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胞可支持多种病毒的增殖，包括脊髓灰质炎、
狂犬病病毒，已被批准用于人体。
• （6）Namalwa：1972年来源于肯尼亚患有
0.01m mol/L胸苷，以及10%小牛血清。
• （4）BHK-21：1961年从5只无性别的生长1天 的地鼠幼鼠的肾脏中分离的。现在广泛采用的