第六章 核酸序列分析

微卫星DNA（Microsatellite DNA）又称短串联重复或简单重复序列，
微卫星筛选流程筛选
从有关数据库（GenBank, EMBL 等）或文章中查询 构建基因组 筛选SSR位点 使用近缘种的引物
获得引物
PCR扩增
（基于PCR与限制性酶切技术结合的DNA标记） ④AFLP（amplified fragments length polymorphism）标记：扩增
1:3~4)。
少一个-OH
双脱氧核苷三磷酸
互补链合成过程
如果在DNA的合成反应中，除了加入 4种正常的脱氧核
苷三磷酸（dNTP）外，再加入一种少量的2’,3’-ddNTP，那 么多核苷酸链的延伸将与偶然发生但却十分特异的链终止展 开竞争，所以反应产物是一系列的长短不一的核苷酸链。
在 4 组 独 立 的 DNA 合 成 反 应 中 ， 分 别 加 入 4 种 不 同 的
段，测序获得SNP位点信息，适于调查未知SNP位点和连续分
布（1kb以内）的SNP位点信息。 • 直接测序法进行SNP分析
•
PCR-限制性酶切：如果某个SNP位点恰好是限制性酶切位点，
则通过PCR酶切再结合电泳分析不失为一种简单经济的区分方 法，适于单个的SNP位点分析。
PCR-SSCP：

单链构象多态性检测（Single-Strand Conformation Polymorphism，SSCP）是一种基于DNA构象差别来检测
二、DNA序列测定
即核酸DNA分子一级结构的测定，是现代分子生物学一项 重要的技术。 1963年，Sanger和Thompson等人第一次完成胰岛素51个 氨基酸的序列测定。70年代后期，Sanger和Maxam----Gilbert 等人又建立了核酸序列测定的方法，Sanger双脱氧末端终止法 和Maxam----Gilbert化学裂解法将核酸序列测定技术推进到 “直读”阶段，使核酸序列测定变得远比蛋白质氨基酸序列测 定容易，这样人们可以通过核酸序列和遗传密码推导出蛋白质 氨基酸的序列。
（基于PCR的DNA标记：特异引物PCR标记）
③SSR（simple sequence repeats)标记:简单重复序列多态性。
最先是1泛存在于各类真核生物的基因组中。 微卫星DNA是由一段DNA简单重复模块串联组成的长达几十个核苷 酸的重复序列，重复单位为数个核苷酸长度的序列，重复次数从几次到 几十次不等，重复总长度一般小于100个碱基对。目前广泛研究和应用的 微卫星重复单位为2～4个核苷酸。 单一型：ATATATATATATATATATATATAT 复合型：ATATATCACACACACACACAC 间断型：ATATATCA ATATATCA ATATATA
Maxam-Gilbert化学裂解法
化学裂解法是Maxam和Gilbert等人1977年创建的，用来 测定DNA序列。化学法是用化学试剂在A、G、C、T处特定地 裂解DNA片段，产生一簇各种长度的短链（等差数列 n=1）， 经过PAGE和放射自显影后，可以直接读出DNA的顺序。 某些试剂能修饰或破坏DNA链上特定核苷酸的碱基进而使 N-糖苷键断裂，暴露出的糖环以β-消除反应，在3’和5’位上断

DNA长度多态性分析
（基于DNA-DNA杂交的DNA标记） ① RFLP标记 (restriction fragment length polymorphism)： DNA某一位点上的变异有可能引起该位点特异性的限制性内切 酶识别位点的改变，包括原有位点的消失或出现新的酶切位点，致 使酶切片段长度随之发生变化。这种变化引起的多态现象即为限制
Maxam & Gilbert DNA化学降解法
杂交法SBH（Sequencing by hybridization）
• 如果一段较短的DNA探针能与较长的DNA片段杂交，并形 成完全的双链结构，我们就推测在靶DNA上存在着相应的 互补序列，这就是DNA杂交测序法的基本原理。如果将一 种12-mer的靶DNA与完全随机合成的8-mer寡核苷酸控针混 合杂交，在总数为48=65536种8-mer的控针群体中，仅有？ 种探针会与靶DNA杂交，形成完全互补的双链分子。
片段长度多态性。通过对基因组DNA酶切片段的选择性扩增来检测 DNA酶切片段长度的多态性。AFLP揭示的DNA多态性是酶切位点和其 后的选择性碱基的变异。AFLP 原理 AFLP技术的优点是该技术结合了RFLP的稳定性和PCR技术 的高效性，又同时克服了RFLP带型少，信息量小以及RAPD标记 对条件比较敏感的缺点。
其他DNA全自动分析仪：
310型全自动遗传分析仪
ABI Prism® 3100遗传分析仪
3700型全自动遗传分析仪
安玛西亚DNA序列分析系统型号： MegaBACE 500/1000/4000
DNA自动测序与手工测序的不同点
1、标记物不同：手工测序采用放射性核素标记，而自动测序采
用4种荧光染料分别标记ddNTP或标记引物
一为疾病的诊断。通过
RFLP技术，并与正常人的 RFLP测定结果比对，能够
确定某种疾病状态下特有的
RFLP特异性疾病标记。 因此，通过特异性疾病 标记的分析，能够对某种疾 病进行分子诊断。
RFLP应用举例：地中海贫血
• 地中海贫血是一种常染色体遗传性溶血性贫血，是世界上最常见和发生率 最高中的一种单基因遗传病。
12-mer的靶DNA序列：
AGCCTAGCTGAA
探运 针用 八 聚 体 靶DNA的互补序列
微型高密度寡核苷酸点阵的制备
DNA测序自动化和大规模测序
• 特点 • 原理同末端终止法
• 标记物为荧光染料
• 激光扫描自动测序 • 结果清晰、准确、分辨率高 • 测序速度快 200bp/h
第一步：加入复制终止剂
裂磷酸二酯键。使戊糖脱落，用于嘌呤环的试剂是硫酸二甲酯，
而联氨可用于肼解嘧啶环。4种核苷酸的特异裂解和鉴别方法 如下：
碱基特异性修饰及裂解
反应体系 G G+A
碱基修饰试剂 碱基修饰反应 主链氢吡啶
断裂点 G G和 A
C+T
C
肼
肼（加盐）

单核苷酸多态性，主要是指基因组水平上由单个核苷酸的变异 所引起的DNA顺序多态性。它是人类可遗传变异中最常见的 一种，占所有已知，多态性的90％以上。估计人类基因组中有 300万个，平均1个SNP/500-1000个碱基。

SNP既可存在于基因顺序内，也可存在一基因以外的非编码顺 序中。存在于编码顺序中的SNP虽然较少，但其在遗传疾病研 究中却具有重要意义。相当一部分SNP直接或间接地与个体间 的表型差异、人类对疾病的易感性和抵抗能力有关，因此，对 SNP的研究越来越受到人们的关注。
• 地中海贫血是由于珠蛋白肽链合成障碍所致，出现一种或几种珠蛋白肽链 数量不足或完全缺乏，从而造成这种珠蛋白链参与的血红蛋白合成量的减 少。其中α珠蛋白链合成受抑者，叫做“α地中海贫血”；β珠蛋白链合成 受抑者，叫做“β地中海贫血”。 • 在α-基因的突变中，以缺失型突变最为常见。α-基因的另一突变即为点突 变，β-基因的突变以点突变为主，亦有碱基的插入和缺失。
点突变的方法。相同长度的单链DNA，如果碱基序列不同，
形成的构象就不同。

DNA片段呈复杂的空间折叠构象，主要是由其内部碱基配
对等分子内相互作用力来维持的，当有一个碱基发生改变
时，会或多或少地影响其空间构象，使构象发生改变。

空间构象有差异的单链DNA分子在聚丙烯酰胺凝胶中受排 阻大小不同，这样就形成了单链构象多态性。
第二步：荧光检测
分析仪器的新发展：
377型遗传分析仪
377 型DNA 全自动测序仪采用经典的聚丙烯酰胺凝胶的电泳方式, 结合美国应用生物系统公司专利的四色荧光标记, 激光检测, 一个泳道检 测的方法, 具有测序结果准确性好, 精度高, 操作简便快速等特点, 已成为 全球应用最多最广泛的全自动DNA 测序仪之一。
（单核苷酸多态性的DNA标记）
⑤SNP（single nucleotide polymorphism）标记:
单核苷酸多态性。不同个体基因组DNA序列同一位置上的 单个核苷酸的差别。其比较的不是DNA的片段长度，而是相同 序列长度里的单个碱基的差别。
SNP检测方法
•
PCR-测序法：最经典的方法，通过PCR扩增包含SNP位点的片
第六章 核酸序列分析
一、核酸多态性分析
尽管在种内或种族内绝大部分的基因组序列是 保守的，但所有基因组中都天然存在有多态性区域，
可以用来鉴别每个个体。
个体遗传物质DNA的多态性 个体呈现出多态现象
DNA多态现象以孟德尔共显性遗传方式传递

长度多态性 位点多态性
长度多态性：数目可变的串联重复序列(variable number of tandem repeat，VNTR)多态性
性片段长度多态性。
对RFLP的检测主要是用Southern杂交的方法进行，即利 用限制酶酶解及凝胶电泳分离不同生物体的DNA分子，然后 用经标记的特异DNA探针与之杂交，通过发射自显影或非同
位素显色技术来揭示DNA的多态性。
电泳 DNA样品限制酶酶解
Southern blot
返回
RFLP技术重要应用之
ddNTP ，结果将生成 4组核苷酸链，它们将分别（随机）终 止于每一个A，每一个G，每一个C，每一个T的位置上。对 这4组核苷酸链进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，就可读出序列。
Sanger双脱氧测
序方法示意图
http://v.youku.co m/v_show/id_X MjUxOTA2MjA0 .html
• 地贫的产前诊断目前一般采用限制性长度多态性（RFLP）方法进行。
②RAPD（random amplified polymorphic DNA） 标记：
随机扩增多态 性DNA，用随机短 引物（人工合成的 六核苷酸）进行 DNA的PCR扩增。 所扩增的DNA区段 是事先未知的，具 有随机性和任意性， 因此随机引物PCR 标记技术可用于对 任何未知基因组的 研究。
嘧啶开环
胞嘧啶开环
六氢吡啶
六氢吡啶
C和 T
C
化学裂解法测序的原理
1、用放射性核素标记待测DNA一侧末端
2、将标记DNA分为G、A+G、C+T、C 4个反应体系
3、用不同的化学试剂处理不同反应体系，随机断裂DNA片 段某种碱基中的任何一个，产生一组一端为放射线标记 的末端，另一端为不同大小的DNA片段的混合物 4、电泳分离，放射自显影得到互相错落的梯形图谱，即可 读出DNA序列
• 与 PCR反应类似。
• 反应体系中包含：模板 DNA,
Taq酶, dNTPs, ddNTPs和测 序引物；
• 反应过程：
变性－复性－延伸－终止
Sanger双脱氧终止法
• ddNTPs 是反应终止剂
可以当作正常碱基参与 复制
一旦链入DNA中，其后
就不能再继续连接。
• 反应体系中dNTPs的浓
度远高于ddNTPs(一般
2、加样方式不同：手工测序，一个样品的4个测序反应物分别 在不同泳道进行，而自动测序可在一个泳道内电泳
3、检测手段不同：手工测序采用放射自显影，从4种寡聚核苷
酸的梯子形图谱中读出DNA序列，而自动测序则采用激光扫 描器同步扫描，计算机进行阅读和编辑
测序的基本过程
不管是上述哪一种方法，测序基本过程如下： 1、制备待测DNA序列模板； 2、酶促或化学反应将其转变“等差数列”（n=1）； 3、PAGE； 4、读序。

Jefferys(1985年)等用Southern杂交的方法检测到人类基因组 中存在一类多态现象。 主要表现为等位片段(基因)内在的串联重复核苷酸单元的拷 贝数不同，从而使得等位片段(基因)的长度呈现多态性。这 类多态现象因此被称为数目可变串联重复多态性。

位点多态性：单核苷酸多态性 (single nucleotide polymorphism，SNP)
经典方法
Sanger双脱氧链终止法 (Sanger和Coulson1977) Maxam-Gilbert DNA化学降解法 (Maxam 和Gilbert,1977)
杂交测序法
质谱法 单分子测序法 原子探针显微镜测序法 流式细胞仪测序法
新技术方法
大规模平行实测法、
DNA 芯片法
Sanger双脱氧终止法