昆虫乙酰胆碱酯酶基因研究进展

昆虫乙酰胆碱酯酶基因研究进展1

林同，李立娜

华南农业大学林学院，510642

E-mail：lintong@

摘要：昆虫乙酰胆碱酯酶是有机磷杀虫剂和氨基甲酸酯类杀虫剂的作用靶标，乙酰胆碱酯酶基因突变可导致乙酰胆碱酯酶对杀虫剂不敏感而是昆虫产生抗药性。黑腹果蝇和家蝇等昆虫只有一个乙酰胆碱酯酶基因，但冈比亚按蚊等昆虫乙酰胆碱酯酶基因有两个或多个拷贝。本文还综述了昆虫乙酰胆碱酯酶基因的结构和表达调控等。

关键词：乙酰胆碱酯酶基因；基因点突变；抗药性；基因拷贝

乙酰胆碱酯酶（AChE）是在神经系统中的一种主要的酶，能通过催化神经传递介质胆碱酯酶的水解而终止神经冲动。AChE是有机磷酸酯类(OP)和氨基甲酸酯类杀虫剂的主要靶标[1]，数量和性质的改变会使昆虫对杀虫剂产生抗性[2，3]。

1. 昆虫乙酰胆碱酯酶基因的结构与表达调控

人们已经研究了20多种昆虫乙酰胆碱酯酶生化特性[4]，并对一些昆虫乙酰胆碱酯酶基因(Ace)结构进行了分子分析，这些昆虫包括黑腹果蝇（Drosophila melanogaster）[5]、印度按蚊（Anopheles stephensi）[6]、埃及伊蚊（Aedes aegypti）[7]、马铃薯叶甲（Leptinotarsa decemlineata）[8]、、家蝇（Musca domestica）[9]、尖音库蚊（Culex pipiens）[10]、黑尾夜蝉（Nephotettix cincticeps）[11]、铜绿蝇（Lucilia cuprina）[12]、麦二叉蚜（Schizaphis graminum）[13]、油橄榄果实蝇（Bactrocera oleae） [14]、棉蚜（Aphis gossypii）[15]和冈比亚按蚊（A. gambiae）[16]等。

铜绿蝇AChE序列和其他双翅目昆虫的高度同源，尤其是和家蝇和黑腹果蝇。铜绿蝇序列与家蝇的AChE有92.4%的氨基酸相似性，与黑腹果蝇的有85.3%氨基酸相似性，近似于按蚊和伊蚊之间的相似性[6，7]。

麦二叉蚜完整的cDNA序列有3283bp,其中包含2028 bp的开放阅读框（ORF），起始密码子（蛋氨酸）在257 bp处。终止密码子TGA在2285–2287bp处，后面是976 bp非翻译区，其中包括23 bp poly(A) 尾。在3＇非翻译区poly(A) 尾上游15 bp处有一个典型的AATAAA 信号。在非编码区（222–223 bp位置）和编码区(1775–1776 bp位置)各有一个Eco R I位点，在C末端非编码区(3181–3182位置)有 Hind III位点[13]。

黑腹果蝇[17]和斯氏按蚊(A. stephensi) [6] AChE基因有9个内含子。埃及伊蚊乙酰胆碱酯酶基因5＇非翻译区前导序列中有一个很长的内含子（19kb）,其大小及位置和果蝇乙酰胆碱酯酶基因5＇非翻译区前导序列中的第一个内含子相似[18]；在开放阅读框内的内含子和外显子有很强的保守性[6，17]，但第一和第二个内含子（分别是19kb和大于7kb）比印度按蚊乙酰胆碱酯酶基因的内含子（55-105bp）长[6]。

埃及伊蚊乙酰胆碱酯酶基因转录起始位点上游40bp处没有类似于TATA的序列，其启动子和多数脊椎动物的乙酰胆碱酯酶基因一样没有TATA盒[18，19]。但果蝇乙酰胆碱酯酶基因中含有TATA盒[17]。在人类这样没有 TATA盒的乙酰胆碱酯酶基因中，去除转录起始元件几乎会去掉启动子的活性，这表明转录起始元件在没有 TATA盒的乙酰胆碱酯酶基因的驱动表达中起重要作用。埃及伊蚊乙酰胆碱酯酶基因转录起始位点上游有五个调控元件。-496至

1本课题得到广东省自然科学基金（04300488）和华南农业大学校长科学基金（2004k051）资助

-491处是GATA-3转录因子，-127至-121间的序列与AP-1因子部分同源，-43至-33序列与果蝇二羟基苯丙氨酸脱羧酶（DDC）基因（Ddc）的调控元件部分同源，方向相反；-23至-17与Sp-1转录因子相对应；-18至-13序列是一个在果蝇乙酰胆碱酯酶基因中发现的类似于GAGA的基序。Ddc元件调控DDC在中枢神经系统的表达[20], GATA-3在鸡脑和T细胞特异性基因表达中起调控作用[21]。Ddc元件和GATA-3元件支持埃及伊蚊乙酰胆碱酯酶基因在神经系统中的表达。但SP-1不参与组织特异性基因的表达[22]。在果蝇早期发育中，GAGA基序对乙酰胆碱酯酶基因增强子功能起重要作用[22]，这就意味着GAGA基序对埃及伊蚊乙酰胆碱酯酶基因也起调控作用。

黑腹果蝇乙酰胆碱酯酶基因的一个显著的特点是5＇端非翻译区(1086 nt)非常长[17]。相比之下，埃及伊蚊乙酰胆碱酯酶基因的5＇前导序列较短，只有560 bp。但铜绿蝇乙酰胆碱酯酶基因5＇端非翻译区至少有1904 nt，比果蝇的还长很多[12]。铜绿蝇Ace基因有4085 bp，其ORF编码708个氨基酸的多肽，黑腹果蝇Ace基因编码649个氨基酸。果蝇的乙酰胆碱酯酶信号肽有38个氨基酸，成熟蛋白质开始于缬氨酸[21]。信号序列和成熟蛋白切割位点在甘氨酸 (97)异亮氨酸（98)之间，该处铜绿蝇和果蝇的乙酰胆碱酯酶序列高度保守，具有信号肽切割位点的特点。黑腹果蝇Ace基因在ORF上游有两个翻译起始序列ATG，但第一个ATG与有效翻译起始的保守序列更匹配。由第一个ATG起始的ORF在杆状病毒中的表达产物是有功能的乙酰胆碱酯酶，第二个ATG位于异亮氨酸（98位，成熟信号肽的N末端）下游第7个氨基酸，由此ATG起始的ORF的表达产物没有酶的活性。铜绿蝇AChE成熟信号肽有97个氨基酸，比其他昆虫的要长[12]。和果蝇一样，埃及伊蚊乙酰胆碱酯酶基因在翻译起始以前也有多个ATG密码子，这表明在到达主要的开放阅读框之前，埃及伊蚊乙酰胆碱酯酶基因的翻译就已经起始于每个ATG密码子后的小的开放阅读框，这些上游的ATG影响基因的翻译[23]。

在埃及伊蚊成虫中，乙酰胆碱酯酶基因有两个大的转录本（大于10kb）和一个小转录本（4 kb），这种有多个转录本的情况和在果蝇蛹中观察的情况很相似，在果蝇中也有一系列大的和小的（3-4 kb）乙酰胆碱酯酶基因mRNA分子[5]。在昆虫神经性表达基因中，出现的转录本是正常的，但这些大的转录本可能是RNA 部分剪接的结果，即在mRNA中仍然保留着内含子。

2. 昆虫乙酰胆碱酯酶基因与抗药性

昆虫抗药性的分子机制都可归于代谢方面，或通过基因增强表达，或通过基因调控，或由于杀虫剂目标分子结构的改变而使昆虫获得抗性[24]。

乙酰胆碱酯酶是一种丝氨酸水解酶，该酶通过催化神经系统中神经传递物质乙酰胆碱的水解而终止神经冲动。有机磷杀虫剂，以乙酰胆碱酯酶为靶标，通过酶活性位点的丝氨酸羟基磷酸化而不可逆地抑制酶的活性，使乙酰胆碱的分解受阻，导致在神经突触和高度兴奋的中枢神经体统中乙酰胆碱浓度的积聚，使突触后神经持续冲动，神经系统的敏感性降低，最终导致生物体的死亡。AChE基因的突变使酶的结构发生改变，导致AChE对有机磷农药和氨基甲酸盐类农药敏感性下降[14，25，26，27]。在昆虫中，不敏感的AChE是昆虫对有机磷酸酯类和氨基甲酸酯类杀虫剂产生抗性的普遍机制[28]。

2.1昆虫乙酰胆碱酯酶基因的增强表达

AChE活性的增强和数量的增加导致了昆虫对有机磷农药和氨基甲酸盐类农药产生抗性[29]。果蝇中枢神经系统中乙酰胆碱酯酶基因表达的增强和该虫对杀虫剂敏感性的降低正相关。在麦二叉蚜对有机磷的抗性中，AChE活性的增强起主要作用。AChE活性的增强是由于乙酰胆碱酯酶基因表达的增强[29]。

2.2 昆虫乙酰胆碱酯酶的不敏感性和乙酰胆碱酯酶基因点突变

Fournier 等[2] 指出果蝇种类的抗药性与乙酰胆碱酯酶过量表达有关，但更多人认为伴