细胞工程课程论文-单克隆抗体对肿瘤的治疗研究进展

单克隆抗体对肿瘤的治疗研究进展摘要：1975年Kohler和Milstein报告用B淋巴细胞杂交瘤技术制备单克隆抗体：单克隆抗体的特异性高，性质均一，易于大量生产、通过细胞丁程。

可以在体外定向地制备各种各样的单克隆抗体，这在抗体生产中是具有划时代意义的进展；而特别重要的是单克隆抗体对相应抗原具有高度的特异性以及抗体分子的均质性，可大大降低在体内与正常组织的交叉反应，为利用抗体治疗疾病，特别是治疗肿瘤带来了新的希望，当时有人称之为“魔弹”，期望单克隆抗体可以靶向攻击致病细胞或病原体而不产生毒副作用。

近20年来，单克隆抗体在疾病诊断方面得到广泛应用。

尽管在疾病治疗方面尽管遇到不少障碍，仍取得突破性的进展。

关键词：单克隆抗体；肿瘤；现状；诊断；治疗一、单克隆抗体含义及特点动物脾脏有上百万种不同的B淋巴细胞系，具有不同基因不同的B淋巴细胞合成不同的抗体。

当机体受抗原刺激时，抗原分子上的许多决定簇分别激活各个具有不同基因的B细胞。

被激活的B细胞分裂增殖形成效应B细胞（浆细胞）和记忆B细胞，大量的浆细胞克隆合成和分泌大量的抗体分子分布到血液、体液中。

如果能选出一个制造一种专一抗体的浆细胞进行培养，就可得到由单细胞经分裂增殖而形成细胞系，这一细胞系的每一个细胞均具有相同的特性且高度均一。

由这一细胞系分泌的抗体由于为同一细胞克隆产生，抗体分子的均一性极高，活性，亚类，亲和力均相同。

由于在筛选融合细胞时，系由一个细胞集落(即克隆)增殖而来，故称为单克隆。

单克隆细胞将合成针对一种抗原决定簇的抗体，称为单克隆抗体。

单克隆抗体主要特点有：①由于来源于单克隆细胞，所分泌的抗体分子在结构上高度均一，甚至在氨基酸序列及空间构型上均相同；②由于抗体识别的是抗原分子上单一抗原位区，且所有抗体分子均相同，由此，单克隆抗体具有高度特异性；二产生该抗体的为一无性细胞系，且可长期传代并保存，为此可持续稳定的生产同一性质的抗体。

二、单克隆抗体的制备杂交瘤细胞系建立以后，可根据需要大量制备单克隆抗体、目前用于制备的方法主要有两种，一种是动物体内法，为国内外实验室所广泛应用；另一种是体外培养法，是目前工业化生产常采用的方法。

（一）、动物体内诱生法此种方法操作简便、经济。

目前制备一般用途，如研究和诊断用单克隆抗体，多采用此种方法。

将杂交瘤细胞注射于同—品系的动物腹腔，诱生产生腹水，而在腹水中即含有高滴度的所需要的单克隆抗体，一般情况下，腹水中的特异性单克隆抗体的浓度在2-5mg/ml之间，通常比培养法高100-1000倍，对于一般用途的单抗制备是首选的方法。

同品系的动物腹腔注射降植烷或液体石蜡，0.5ml/只处理动物，一周以后动物腹腔注射5-10x10^5个细胞，约1-2周后可见动物腹部明显增大，即可用注射器由腹腔抽取腹水，一般情况下每只小鼠可采集3-5ml腹水，腹水经离心去细胞后，即得所需的单抗腹水。

采用这种方法制备单克隆抗体，需注意选择与杂交瘤同品系的动物，另可选择同品系动物与其他同种动物品系杂交一代制备，可提高每只动物产生腹水的量；此外在选择动物时，应注意动物微生物感染情况，应尽可能选择SPF动物，尤其是对用于体内目的的单克隆抗体。

另外，用这种方法制备的腹水，尚含有一些非特异性的抗体，在使用时应根据不同的需要采用相应的纯化方法。

（二）、体外培养法动物细胞培养技术的发展非常迅速，越来越多地用于单克隆抗体的生产，尤其是用于人类防病治病的单克隆抗体的工业化生产。

由于是体外生产，生产工艺易控制，对保证产品质量尤为重要。

目前常用的体外培养方式有两种，一种是悬浮培养，另一种是细胞固定化培养系统。

可根据杂交瘤细胞贴壁依赖性来选择不同的培养方式。

1、悬浮培养法这种培养法是在微生物发酵基础上发展起来的，但又不同于微生物发酵。

由于动物细胞无细胞壁，易损伤，细胞培养营养要求高，无菌操作要求严格。

目前国际上已有生产用于动物细胞培养的生物反应器，其培养方式多种多样，可根据需要选择。

这种培养法与常规的静置培养相比，增加细胞生长的空间，使单位体积内的细胞数量增多，抗体产量也增高。

此外，由于采用的生物反应器，各种条件均可自动化操作和监控，便于对整个生产过程监控，目前国际上上市的单克隆抗体多采用此种方法，国内也有多家在研究开发，但尚未见有产品问世。

2、固定化培养这种方法主要用于贴壁性能较强的杂交瘤细胞，主要是以小的固体颗粒作为细胞生长的载体，细胞固定在载体表面上生长，通过搅拌使其均匀地悬浮在培养液巾，细胞在载体表面长成单层，这种培养为单层培养与悬浮培养相结合的一种培养方式。

因此，这种培养由于使用微载体作为细胞生长的载体，其单位体积的表面积大，并可通过提高微载体的浓度而增大面积。

单位体积内培养的细胞较普通悬浮培养的细胞的数量更多且操作监控也较简便，很适合用于当前细胞工程产品的大量生产。

三、单克隆抗体药物种类单抗药物种类有鼠源单克隆抗体、人鼠嵌合单克隆抗体、人源化单克隆抗体、全人源单克隆抗体。

1、鼠源单抗：鼠分泌的抗体，其所有序列都是鼠的，注射人体易产生人抗鼠反应（即HAMA 反应）。

最初的上市的单抗药物大多是鼠源性的，鉴于副反应较大，目前已经很少使用。

但是由于鼠源单抗代谢快，适用于像利卡汀这样偶联放射性性物质的药物。

2、嵌合单抗：利用DNA重组技术把鼠单抗的轻链、重链可变区基因插入含有人抗体的恒定区域的表达载体中，并转入合适的宿主表达出来的抗体。

这样抗体即具有识别抗原的特异性，又减少了抗体的人抗鼠反应。

3、人源化单抗：就是通过测定鼠源抗体的序列，截取其决定簇互补区的序列移植到人抗体的编码框中表达，并经过一定的亲和力测试和筛选，最终选出仍然具有特异性识别能力的单抗。

可以最大限度的减少抗体的人抗鼠反应，而且特异性、亲和力不变，应用性较强，已经成为主流技术。

但是实现人源化具有一定的技术难度，是国内企业努力克服的技术难点。

4、全人源单抗：目前主要是通过转基因小鼠以及噬菌体展示文库制备的抗体，其重链和轻链都是来源于人，因此副作用更小，免疫亲和力基本保持不变，是未来的主流技术。

目前已经获批生产的有7个，其中雅培的阿达木单抗humira是剑桥抗体技术中心的噬菌体展示技术制备而来，EvaluatePharma曾预测到2016年，Humira的销售额将超越罗氏公司的抗癌药物Avastin，成为世界上最赚钱的药物。

四、单克隆抗体在肿瘤病理学中的应用抗体根据结构可以分为可变区以及恒定区。

可变区可以特异性的识别抗原，能够将抗体靶向目标蛋白。

恒定区可以参与免疫调节。

结构决定功能，目前的抗体药物也是基于这两个功能设计。

所以相对于一般的传统药物，单抗具有非常明显的“精准性”，如果说传统的化药治疗是一种“地毯式”式的排查治疗，那么单抗药物就是“导弹”式的靶向治疗，能够减少了正常细胞的受损，减少副作用的同时还增强了药物疗效，所以目前在癌症领域得到广泛应用。

单克隆抗体的特异性强，可将抗原抗体反应的特异性大大提高，减少了可能的交叉反应，使试验结果可信度更大。

单克隆抗体的均一性和生物活性单一性使抗原抗体反应结果便于质量控制，利于标准化和规范化。

（一）、肿瘤治疗现状肿瘤是一种严重威胁人类健康的基因性疾病，是体细胞后天获得性DNA 的改变导致细胞无节制地增殖，且这种增殖不断地侵袭周围正常组织所致。

近年来，肿瘤的治疗已成为众多医学工作者研究的热点，其中单克隆抗体靶向疗法治疗肿瘤显示出了良好的前景。

其研究重点主要集中在将抗体与化学药物、酶、放射性核素、毒素和生物诱导剂等耦联后直接杀伤肿瘤或者利用抗体促进肿瘤细胞凋亡和抑制肿瘤血管生成等方面。

目前，国际上与肿瘤治疗相关的抗体研究主要集中在将抗体与耦联物作用后直接杀伤肿瘤细胞，利用抗体促进肿瘤细胞凋亡和抑制肿瘤血管生成等方面。

（二）、单克隆抗体在诊断肿瘤中的应用1．淋巴样恶性病在对白血病及淋巴瘤分类时，单克隆抗体很有用。

这些试剂可将T和B细胞白血病清楚地分开，同时也能显示恶变T细胞的分化。

婴儿T细胞白血病代表着胸腺早期分化阶段(大多数急性淋巴母细胞白血病只与OKTl0反应，或与OKT9及OKTl0反应)，而皮肤T细胞淋巴瘤，代表着具有更加成熟表型(OKT4)T细胞的恶变。

用单克隆抗体通常可将急性淋巴母细胞白血病(ALL)分成T细胞白血病(OKTll+，OKIal-，CALLA-，BA-1-)以及与之相对的普通型白血病(OKTl工—，OKIal+，CALLA+，BA-i+)。

(CALLA是白血病相关抗原，见于ALL及某些慢性髓细胞白血病(CMl)病人。

BA-1是一个单克隆抗体，它与主要分布在人B细胞系的决定簇反应。

当这类B细胞最终分化成浆细胞时，此决定簇便丢失。

)目前，对非何杰金氏淋巴瘤分型的初步工作显示，除表面免疫球蛋白(SIgG+)外，还有一些具有OKT9+，10+，OKIal-表型的大细胞性组织细胞淋巴瘤。

鉴于OKT9及OKTl0抗原是非细胞系特异抗原，浆细胞又缺乏DR抗原，上述资料表明这些肿瘤是已失去DR抗原的B淋巴细胞克隆的扩展，这些B细胞已处于向浆细胞分化的阶段。

为了解在淋巴细胞分化中这种不寻常表型的意义和频率，需做进一步研究。

2．非淋巴样恶病肿瘤病人免疫调节状态是需要进一步探索的领域，因动物和人的材料都表明恶变可能与免疫抑制状态有关。

此外，用于肿瘤的很多治疗方式如X线照射和细胞毒药物，其本身便可以有免疫抑制作用。

已从肺癌、乳腺癌，及与治疗牛皮癣时所使用补骨质素或紫外线照射治疗(PUVA)有关皮肤癌中获得了一些初步资料。

对肺癌病人的任何分析，必需适当地分析吸烟的影响，因为吸烟本身引起包括淋巴细胞增殖在内的白细胞增殖。

有很重吸烟史的病人常伴有OKT4／OKT8比例降低。

患有原发性鳞状细胞癌的病人有些变化可能与他们很重的吸烟史有关。

患有原发性腺癌病人表现有OKT8+细胞降低。

与吸烟史无关的一些最明显改变见于肺中有继发性转移灶的病人(原发肿瘤可以有多种类型)。

由于OKT8+细胞比例增加，这类病人的OK-Ti／OKT8比例降低。

这样，每种肺癌用单克隆抗体计数T细胞时，都有明显的特征。

特别是转移癌病例，具有OKT4／OKT8低比值的情况，都伴有免疫抑制状态。

但尚未查清的是免疫抑制先于肿瘤转移，抑或如同动物实验所示，转移肿瘤本身诱导免疫抑制。

对乳腺癌研究的初步结果表明，一些刚刚诊断出来尚未治疗的病人，随病期不同表现不一。

局限的病变表现有正常T细胞，以及OKT4，OKT8细胞比例正常，而初诊时便发现肿瘤扩散的病人，表现有OKT4／OKT8比例下降，表明有免疫抑制状态。

未治疗的牛皮癣病人OKT4／OKT8比例正常，而经长疗程紫外线照射(PUVA)治疗病人比例降低。

紫外线照射看来暂时降低OKT4水平，这种降低对治疗后所观察到的改变的免疫状态(免疫抑制效应)可能起一定作用。