蛋白酶和淀粉酶产生菌的筛选及酶学性质分析研究

33.26 22.29 143.45 45.25 19.6
注“: -”表示没有酶活
从表 2 中可以看出，L16 在 48 h 产淀粉酶酶活 性较高可达 143.45 U/mL，但蛋白酶活性较低，并且 在重复试验中，酶活力不太稳定。L15 号菌株蛋白酶 酶活较高，淀粉酶活力较低，但在重复试验中酶活力 较稳定。综合考虑，选择 L15 号菌株作为出发菌株， 对其进行细菌学鉴定、产酶曲线和酶学性质的初步 研究。 2.3 L15 菌株的特性 形态特征是菌落为乳白色， 不透明，菌落中间圆泡状突起且表面光滑，边沿不整 齐，呈锯齿状。镜检观察为直杆状，芽孢端生或近中 生，形状椭圆。革兰氏染色及 V- P 反应均呈阳性，接 触酶反应阳性，厌氧条件下不生长，葡萄糖发酵产酸 阳性，酪素水解、淀粉水解、柠檬酸盐试验均呈阳 性，同时都耐受 7 %NaCl 。 2.4 培养时间对 L15 号菌产蛋白酶和淀粉酶酶活 力 的影响 将 L15 号 菌 株 按 1.3.4 的 方 法 操 作 ，以 时间为横坐标，以酶活为纵坐标作图，得出该菌株的 产酶活力随时间变化的曲线。由图 1 可以看出，该菌 株产蛋白酶的酶活力在 12 h 时较低，12 h 以后酶活 迅速升高，到 48 h 时酶活最高为 221.57 U/ mL，72 h 以后迅速下降；而淀粉酶的酶活力在 48 h 时以后迅 速上升，在 96 h 时酶活达到最高为 54.06 U/ mL。 2.5 不同温度处理对蛋白酶和淀粉酶酶活力的影响
0.4 mmol/L I2- KI 溶液显色，620 nm 下测光密度。1 个 酶活力单位定义为 5 min 内水解 l mg 淀粉的酶量。 A（U/mL）＝ D ×（R0- R）/R0× 100。 其中，A 为酶活，R0 为底物加碘液的光吸收值，R 为 反应物加碘液的光吸收值，D 为酶的稀释倍数。 1.5 细菌的特性研究 参照文献[10]中的操作方法 对菌株的形态及生理生化特性进行研究。 1.6 统计分析 利用 SAS 6.12 数据处理软件对所 有的试验数据进行统计分析，借助最小显著极差法 对组间数据进行差异显著性检验。
随着饲料工业的迅猛发展，蛋白酶及淀粉酶在 饲料工业中的应用研究也越来越多。而且大多数研 究 结 果 证 明 [5,6]，在 饲 料 中 添 加 以 蛋 白 酶 和 淀 粉 酶 为 主 要 成 分 的 酶 制 剂 都 具 有 显 著 强 化 消 化 的 功 能 、提 高饲料利用率、促进生长、提高动物的生产性能等功 效。虽然已有许多微生物在酶制剂的生产中得到了 广泛的应用，但筛选产酶活力高且酶学性质好的研 究工作从来就没有停止过。本研究从瘤胃内容物中 分离和筛选出优良的高产蛋白酶和淀粉酶的菌株， 为其在饲料生产中的应用奠定基础。
动 物 生 产 ·Anima l P roduction
2009 年 第 45 卷 第 21期
蛋白酶和淀粉酶产生菌的筛选
及酶学性质分析研究
王朋朋，常 娟，王 平，左瑞雨，尹清强 * （河南农业大学牧医工程学院，河南郑州 450002）
摘 要：从牛瘤胃液中筛选出一株性状优良、产蛋白酶和淀粉酶活力较高的菌株，经初步鉴定为枯草芽孢杆菌。
圈，淀粉酶水解圈的直径（D2）和菌落直径（d）及比值 （D2 /d），如表 1 所示。
表 1 产蛋白酶和淀粉酶菌株的初筛
菌株号
D/mm D1/mm D2/mm
D1/d
D2/d
L1
2
4.5
-
2.25
-
L2
4
7
-
1.75
-
L3
3
4.5
-
1.5
-
L4
3
4.5
-
1.5
-
L5
1.5
4
-
2.67
-
L6
1
7
-
7
-
—— —— ———— —— ———— —— —— —— —— —— —— — 收稿日期：2008- 10- 12；修回日期：2009- 05- 12 作者简介：王朋朋（1985-），男，河南商丘人，在读硕士研究生 * 通讯作者
1 材料与方法
1.1 材料 1.1.1 菌株 从河南农业大学教学实习基地奶牛 场的牛瘤胃中分离获得。 1.1.2 仪 器 设 备 BCM- 1000 型 生 物 净 化 工 作 台 （苏州净化 设备有限公 司）；可 见 分 光 光 度 计 WFJ 7200 型（龙尼柯公司）；水浴恒温振荡器、水浴锅（江 苏 金 坛 中 大 仪 器 厂）；高 速 离 心 机（上 海 安 亭 科 学 仪 器厂）；WH- 3 型微型旋涡混合仪 （上海沪西分析仪 器厂）。 1.2 培养基 1.2.1 斜面培养基 牛肉膏 5 g、蛋白胨 10 g、NaCl 5 g、琼脂粉 20 g、蒸馏水 1 000 mL，在 121℃下高压 灭菌 15 min。 1.2.2 透明圈培养基 酪蛋白 10 g、蛋白胨 5 g、酵 母 2.5 g、可溶性淀粉 10 g 、KH2PO4 0.3 g、MgSO4·7H2O 0.5 g、NaCl 1 g、琼 脂 粉 20 g、蒸 馏 水 1000 mL，在 121℃下高压灭菌 15 min。 1.2.3 液体摇瓶培养基 牛肉膏 5 g、蛋白胨 5 g、 酵母 2.5 g、KH2PO40.3 g、MgSO4·7H2O 0.5 g、NaCl 1 g、 可溶性淀粉 5 g、蒸馏水 1 000 mL 在 121℃下高压灭 菌 15 min。 1.3 试验方法 1.3.1 样品采集、菌株的分离与筛选 在无菌条件 下 采 集 瘤 胃 内 容 物 ，将 采 集 的 样 品（瘤 胃 内 容 物）采 用梯度稀释法涂布于固体平板培养基上进行初筛， 37℃恒温培养，挑选出能在培养基上产生明显透明
L7
2
3
-
1.5
-
L8
1
1.4
-
1.4
-
L9
6
12
-
2
-
L10
1.5
2.5
-
1.67
-
L11
1.5
3
-
2
-
L12
6
21
-
3.5
-
L13
1.5
4.5
-
3
-
L14
2
6
6.2
3
3.1
L15
3
12
7.5
4
2.5
L16
3
4
13
1.334ຫໍສະໝຸດ 33L172.55
6.5
2
2.8
L18
2
5.5
3.5
2.75
1.37
L19
2 结果与分析
2.1 蛋白酶及淀粉酶产生菌的分离与筛选 在 37℃
培养 24 h 后，在透明圈培养基上可以观察到共有 27
株能产生肉眼可见的透明圈，将它们作为蛋白酶的
初筛菌株，蛋白酶透明圈的直径（D1）和菌落直径（d） 及比值（D1/d）（见表 1）。 然后用碘液处理平板上的 27 株产蛋白酶的菌株，其中有 5 株产生淀粉水解
由图 2 可以明显看出，该菌株所产蛋白酶的最适处 理温度为 40℃，在 50℃以下时相对酶活较稳定；淀粉 酶的最适处理温度为 20℃，在 20～50℃之间酶活较稳
注:图中大写字母不同表示差异显著（P < 0.05），字 母 相 同 表 示 差 异 不显著（P > 0.05）。下图同
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圈的菌落，则说明该菌株分泌蛋白酶，然后在该菌株 上滴加碘液，观察菌株周围是否能产生淀粉水解圈， 若产生水解圈则说明此菌株也能分泌淀粉酶，即选 该菌株作为初筛菌株。 1.3.2 摇瓶复筛 将初筛得到的菌株接种于液体 培养基中，在 37℃条件下振荡培养 48 h。按 0.1%的 接种量转接至液体发酵培养基（100 mL/250 mL 三角 瓶）中 ，37 ℃ 振 荡 培 养 ，然 后 在 无 菌 操 作 台 中 取 发 酵 液，13 000 r/min 离心 10 min，取上清液测蛋白酶和 淀粉酶酶活力。 1.3.3 培养时间对目标菌产蛋白酶和淀粉酶酶活 力的影响 将目标菌株按 0.1%的接种量转接至液体 摇瓶发酵培养基中，37℃恒温振荡培养，分别在 12、 24、36、48、60、72、96、120、144 h 取发酵液，13 000 r/min 离心 10 min，取上清液在 pH7、40℃的条件下分别测 定蛋白酶和淀粉酶活力，每个时间点 5 个重复，取平 均值。以时间为横坐标、酶活为纵坐标作图，得出该 菌株的产酶活力曲线。 1.3.4 不同温度预处理对蛋白酶和淀粉酶酶活力 的影响 取产蛋白酶和淀粉酶酶活力最高时 （蛋白 酶 48 h、淀粉酶 96 h） 的上清液分别在 20、30、40、 50、60、70℃温度下进行预处理 15 min，之后放入冰 浴中使其快速冷却，然后在 pH7、40℃的条件下分别 测定不同温度处理下的蛋白酶和淀粉酶酶活，每个 温度梯度 5 个重复，取平均值。以温度为横坐标、以 相对酶活为纵坐标做图[7]。 1.3.5 不同 pH 对蛋白酶和淀粉酶活力的影响 取 产蛋白酶和淀粉酶酶活力最高时 （蛋白酶 48 h、淀 粉酶 96 h）的上清液中在 40 ℃的条件下、pH 为 5～9 的基质缓冲中进行反应，然后分别测定其蛋白酶和 淀粉酶酶活，每个 pH 梯度 5 个重复，取平均值[7]。pH 为横坐标、以相对酶活为纵坐标做图。 1.4 酶活测定方法 1.4.1 蛋白酶活力测定方法 采用 Folin- 酚法[8]测 定蛋白酶的活力。酶活定义：1 mL 酶液在一定 pH 和 温度下，每分钟水解酪蛋白产生 1 μg 酪氨酸的酶量 为 1 个酶活力单位（U/mL）。 1.4.2 淀 粉 酶 活 力 测 定 方 法 采 用 Yoo 改 良 法 [9]， 反应体系为 5 mL 的基质缓冲液加 0.5 mL 的淀粉酶原 液，在一定 pH 和温度下，反应 5 min 后，加 0.1 mol/L H2SO4 5 mL 终止反应，取 0.5 mL 反应液加 入 5 mL