蛋白质分离纯化实验疑难问题与解答
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1mol/L尿素可 断开氢键作用
50％的乙烯乙二醇 能够降低疏水作用
促溶性盐如高氯酸 钠既能屏蔽电荷作 用，其促溶性还可 削弱电荷作用
问题8：如何提高蛋白的亲和吸附力
（1）Байду номын сангаас先了解配体和蛋白质间的相互作用类型，选择合适 的吸附缓冲液。
相互作用方式主要是疏水键，提高离子强度或pH将增强吸附，而 低温会弱化疏水作用。如果不了解相互作用类型，可预先用小样进行 比较实验确定最佳吸附条件。
（2）增加固定化配体的浓度 （3）延长吸附时间提高蛋白质与固定化配体的结合程度
采用二次吸附或分批式反应，或使用长柱子、低流速、低样品量 加样方式。
问题9：离子交换层析样品不保留
pH 值 阴离 流动相pH值<蛋白pI值时，蛋白分子呈阳离子状态，在柱上无保留 子柱 流动相pH值>蛋白pI值时，蛋白分子呈阴离子状态，在柱上保留 离 子 强 度
蛋白质分离纯化实验 疑难问题与解答
预 处 理 粗 分 离 精 分 离
原材料 提取液
破碎 溶解 离心 盐析 超滤 有机溶剂沉淀 透析 凝胶色谱 离子交换色谱 亲和色谱 高效液相色谱 电泳
粗提液
精提液
问题1：超声破碎后酶活降低
超声功率 超声效果 影响因素 控制不当 处理时间 温度过高，酶活降低
超声间歇
破碎 溶解 离心 盐析 超滤 有机溶剂沉淀 透析 凝胶色谱 离子交换色谱 亲和色谱 高效液相色谱 电泳
粗提液
精提液
问题3：超滤过程中流速变慢
原因分析
蛋白质在膜表面的聚集会导致滤过变慢
处理方法
搅拌式超滤装置
勿将样品浓缩到超滤棒接触不到的位置
问题4：盐析后酶失活
低温盐析
整个提取过程低温进行
缓慢均匀加入盐 处理方法 冰浴
避免局部盐浓度过高
盐析后搅拌40min~1h、在冰浴内 放置一段时间 透析、超滤、脱盐柱脱盐 脱盐后测酶活
尽快脱盐
问题5：有机溶剂沉淀时蛋白质变性
处理方法
• 低温沉淀 • 搅拌均匀：防止局部有机溶剂浓度过大 • 有机溶剂沉淀后立即用水或缓冲液溶解：降低有机溶 剂浓度 • 添加中性盐（0.05mol/L）：有机溶剂在中性盐存在 时能增加蛋白质的溶解度
预 处 理 粗 分 离 精 分 离
原材料 提取液
破碎 溶解 离心 盐析 超滤 有机溶剂沉淀 透析 凝胶色谱 离子交换色谱 亲和色谱 高效液相色谱 电泳
粗提液
精提液
问题6：凝胶层析分辨率低
• 降低流速 • 增加柱长 • 采用直径更小的颗粒 • 选用分离范围更窄的介质 • 清洗柱子中杂质 • 改变样品体积
问题11：高效液相色谱柱压升高
（1）如确定是色谱柱头的过滤筛板被污染，可以将色谱柱反方向 用甲醇冲洗至正常压力，或者卸下色谱柱头，将其放在 10％的稀 硝酸内超声清洗10分钟，后再用纯水超声10分钟，重新装入色谱柱。 （2）如确定色谱柱头的填料被污染，将柱头螺丝卸下，挖出柱 内前段被污染的填料，用相同的柱填料重新填入，仔细修复后， 重新安装上柱头螺丝。 （3）如确定定是盐结晶，用 10%的甲醇 / 水冲洗色谱柱使柱内 盐全部溶解，再换高浓度甲醇。 （4）如果因 pH 值使用不当，则很难恢复。
问题7：亲和层析产物变性
低pH洗脱条件 （pH2.5～3.0）
蛋白质构象发生 永久性改变
正常情况下疏水残基被隐藏在一级结 构域内部，但在洗脱条件下就暴露出 来了，导致蛋白质与柱子非特异疏水 性结合相应增加，蛋白质发生聚合的 概率上升，产物蛋白质的水解率增加。
问题7：亲和层析产物变性
处理方法
选择较温和的pH洗脱条件 利用一个或多个其它作用机制
当流动相或样品中的离子强度过大时，也会造成蛋白在离子交换柱 上不保留
上 样 量
上样量过大，亦会使蛋白样品保留变弱，一般样品的上样量不应超过该 填料结合蛋白量的20%
问题10：高效液相色谱柱污染
最有效的办法是纯化样品 提取纯化好的样品用流动 相来溶解
问题11：高效液相色柱压升高
1 色谱柱头的过滤筛板堵塞或污染 2 色谱柱头的填料被样品污染 3 色谱柱内缓冲液中的盐遇到高浓度的甲醇或 其他有机溶剂，形成结晶析出 4 流动相 pH 值过大或过小使固定相结构破坏 或溶解
预 处 理 粗 分 离 精 分 离
原材料 提取液
破碎 溶解 离心 盐析 超滤 有机溶剂沉淀 透析 凝胶色谱 离子交换色谱 亲和色谱 高效液相色谱 电泳
粗提液
精提液
谢 谢
程正琪 14212030013 林 旋 14212030014 廖飞龙 14212030015
问题1：超声破碎后酶活降低
冰 浴
降低温度
处理方法
预实验
确定目的蛋白最佳超声条件
问题2：提取过程中蛋白质易降解
温度过高
蛋白酶作用
问题2：提取过程中蛋白质易降解
处理方法
低温提取
加入蛋白酶抑制剂
选择合适超声条件
缩短提取时间
低温保存：4℃短暂保存、-80℃长期保存
预 处 理 粗 分 离 精 分 离
原材料 提取液
50％的乙烯乙二醇 能够降低疏水作用
促溶性盐如高氯酸 钠既能屏蔽电荷作 用，其促溶性还可 削弱电荷作用
问题8：如何提高蛋白的亲和吸附力
（1）Байду номын сангаас先了解配体和蛋白质间的相互作用类型，选择合适 的吸附缓冲液。
相互作用方式主要是疏水键，提高离子强度或pH将增强吸附，而 低温会弱化疏水作用。如果不了解相互作用类型，可预先用小样进行 比较实验确定最佳吸附条件。
（2）增加固定化配体的浓度 （3）延长吸附时间提高蛋白质与固定化配体的结合程度
采用二次吸附或分批式反应，或使用长柱子、低流速、低样品量 加样方式。
问题9：离子交换层析样品不保留
pH 值 阴离 流动相pH值<蛋白pI值时，蛋白分子呈阳离子状态，在柱上无保留 子柱 流动相pH值>蛋白pI值时，蛋白分子呈阴离子状态，在柱上保留 离 子 强 度
蛋白质分离纯化实验 疑难问题与解答
预 处 理 粗 分 离 精 分 离
原材料 提取液
破碎 溶解 离心 盐析 超滤 有机溶剂沉淀 透析 凝胶色谱 离子交换色谱 亲和色谱 高效液相色谱 电泳
粗提液
精提液
问题1：超声破碎后酶活降低
超声功率 超声效果 影响因素 控制不当 处理时间 温度过高，酶活降低
超声间歇
破碎 溶解 离心 盐析 超滤 有机溶剂沉淀 透析 凝胶色谱 离子交换色谱 亲和色谱 高效液相色谱 电泳
粗提液
精提液
问题3：超滤过程中流速变慢
原因分析
蛋白质在膜表面的聚集会导致滤过变慢
处理方法
搅拌式超滤装置
勿将样品浓缩到超滤棒接触不到的位置
问题4：盐析后酶失活
低温盐析
整个提取过程低温进行
缓慢均匀加入盐 处理方法 冰浴
避免局部盐浓度过高
盐析后搅拌40min~1h、在冰浴内 放置一段时间 透析、超滤、脱盐柱脱盐 脱盐后测酶活
尽快脱盐
问题5：有机溶剂沉淀时蛋白质变性
处理方法
• 低温沉淀 • 搅拌均匀：防止局部有机溶剂浓度过大 • 有机溶剂沉淀后立即用水或缓冲液溶解：降低有机溶 剂浓度 • 添加中性盐（0.05mol/L）：有机溶剂在中性盐存在 时能增加蛋白质的溶解度
预 处 理 粗 分 离 精 分 离
原材料 提取液
破碎 溶解 离心 盐析 超滤 有机溶剂沉淀 透析 凝胶色谱 离子交换色谱 亲和色谱 高效液相色谱 电泳
粗提液
精提液
问题6：凝胶层析分辨率低
• 降低流速 • 增加柱长 • 采用直径更小的颗粒 • 选用分离范围更窄的介质 • 清洗柱子中杂质 • 改变样品体积
问题11：高效液相色谱柱压升高
（1）如确定是色谱柱头的过滤筛板被污染，可以将色谱柱反方向 用甲醇冲洗至正常压力，或者卸下色谱柱头，将其放在 10％的稀 硝酸内超声清洗10分钟，后再用纯水超声10分钟，重新装入色谱柱。 （2）如确定色谱柱头的填料被污染，将柱头螺丝卸下，挖出柱 内前段被污染的填料，用相同的柱填料重新填入，仔细修复后， 重新安装上柱头螺丝。 （3）如确定定是盐结晶，用 10%的甲醇 / 水冲洗色谱柱使柱内 盐全部溶解，再换高浓度甲醇。 （4）如果因 pH 值使用不当，则很难恢复。
问题7：亲和层析产物变性
低pH洗脱条件 （pH2.5～3.0）
蛋白质构象发生 永久性改变
正常情况下疏水残基被隐藏在一级结 构域内部，但在洗脱条件下就暴露出 来了，导致蛋白质与柱子非特异疏水 性结合相应增加，蛋白质发生聚合的 概率上升，产物蛋白质的水解率增加。
问题7：亲和层析产物变性
处理方法
选择较温和的pH洗脱条件 利用一个或多个其它作用机制
当流动相或样品中的离子强度过大时，也会造成蛋白在离子交换柱 上不保留
上 样 量
上样量过大，亦会使蛋白样品保留变弱，一般样品的上样量不应超过该 填料结合蛋白量的20%
问题10：高效液相色谱柱污染
最有效的办法是纯化样品 提取纯化好的样品用流动 相来溶解
问题11：高效液相色柱压升高
1 色谱柱头的过滤筛板堵塞或污染 2 色谱柱头的填料被样品污染 3 色谱柱内缓冲液中的盐遇到高浓度的甲醇或 其他有机溶剂，形成结晶析出 4 流动相 pH 值过大或过小使固定相结构破坏 或溶解
预 处 理 粗 分 离 精 分 离
原材料 提取液
破碎 溶解 离心 盐析 超滤 有机溶剂沉淀 透析 凝胶色谱 离子交换色谱 亲和色谱 高效液相色谱 电泳
粗提液
精提液
谢 谢
程正琪 14212030013 林 旋 14212030014 廖飞龙 14212030015
问题1：超声破碎后酶活降低
冰 浴
降低温度
处理方法
预实验
确定目的蛋白最佳超声条件
问题2：提取过程中蛋白质易降解
温度过高
蛋白酶作用
问题2：提取过程中蛋白质易降解
处理方法
低温提取
加入蛋白酶抑制剂
选择合适超声条件
缩短提取时间
低温保存：4℃短暂保存、-80℃长期保存
预 处 理 粗 分 离 精 分 离
原材料 提取液