PAGE测定蛋白质的相对分子量
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以标准蛋白质Mr的常用对数（lgMr）对相对迁移率作图，得到标准曲线。根据 待测蛋白质样品的相对迁移率，从标准曲线上查出其相对分子量的常用对数，再换算 出其相对分子量。
10. 脱色液：50ml甲醇，75ml冰醋酸与875 ml重蒸水混合。 11. 待测蛋白样品。 12. 1%琼脂糖（最好用电极液配） 13. TEMED
五、实验步骤
1、洗净晾干电泳槽、玻璃板、夹条、梳齿等。安装后用1%琼脂糖封 玻璃板两侧及底部。
2、分离胶的选择和配置方法
1 2）分离胶和浓缩胶的配制方法
2）待测样品的制备 （同标准蛋白质样品处理）
6、 电泳
1）待浓缩胶完全聚合后，标记好加样孔位置，将电泳槽注满电极缓冲液，小心拔出梳齿， 用电极缓冲液冲洗加样孔数次。
2）用微量注射器按次序向加样孔内加样。 3）接上电泳仪，上电极接电源负极，下极接正极。打开电源，调节电流至20～30mA并保 持电流强度恒定。待蓝色的溴酚蓝条带迁移至距凝胶下端约1cm时，停止电泳。
溶 解后，定容至100ml，棕色试剂瓶4℃保存，30天内使用。
2. 分离胶缓冲液：1.5mol/L Tris-HCl，pH8.8。
18.15 Tris（三羟甲基氨基甲烷），少许重蒸水溶解，用1M HCl调pH8.8，重
蒸水定容至100ml，4℃保存。
3. 浓缩胶缓冲液：0.5mol/LHCl，pH6.8。
兔磷酸化酶B 97 400 牛血清白蛋白 66 200 兔肌动蛋白 43 000 牛碳酸酐酶 31 000 胰蛋白酶抑制剂 20 100 鸡蛋清溶菌酶 14 400
8. 质量浓度为10%过硫酸铵： （临用前配制） 9. 染色液：
0.25g考马斯亮蓝R250，加入40ml甲醇，10ml冰醋酸,蒸馏水定容至100ml，过滤。
PAGE测定蛋白质的相对分子量
Leabharlann Baidu
三、实验器材
1.直流稳压电泳仪 2.垂直平板电泳槽（含玻璃板、夹条、梳齿、夹子等） 3.移液器（1.0ml、200μl、20μl） 4.微量注射器（20μl） 5.烧杯、培养皿、试管、滴管、直尺 6.脱色摇床
四、实验试剂
1. 凝胶贮备液：丙烯酰胺（Acr）29.2g和亚甲基双丙烯酰胺（Bis）0.8g重蒸水
分离胶的浓度
12%
重蒸水 /ml
3.35
1.5M Tris-HCl(pH8.8) /ml 2.5
10%SDS /ml
0.1
凝胶贮备液(Acr/Bis) /ml
4.0
10%过硫酸铵 /μl
50
TEMED/μl（最后加，防烧杯中聚合） 5
总体积 /ml
10ml
浓缩胶的浓度
5%
重蒸水/ml
2.92
0.5M Tis-HCl(pH6.8)/ml 1.25
6gTris, 少许重蒸水溶解，用1M HCl调pH6.8，重蒸水定容至100ml，4℃保存。
4. 10%SDS，室温保存。
5. 两类样品缓冲液：
2倍还原缓冲液（2×reducing buffer）
0.5mol/L HCl，pH6.8 2.5 ml
甘油
2.0 ml
质量浓度10%SDS
4.0ml
质量浓度0.1%溴酚蓝
0.5ml
β-巯基乙醇
1.0 ml
总体积10 ml
四、实验试剂
6. 电极缓冲液，pH8.3。
Tris3g，甘氨酸14.4g，SDS1.0g加重蒸水溶解定容至1000ml，4℃保存。
7. 低分子量标准蛋白质（上海产）。
开封后溶于200μl重蒸水，加200μl 2倍样品缓冲液（还原缓冲液），分装20小管，20℃保存。临用前沸水浴3～5min，其相对分子量（Mr）如下：
4、浓缩胶的灌制 （等分离胶聚合后配制）
按照上表右边操作。混匀后灌注在分离胶上。小心插入梳齿，避免混入气泡，将电泳槽垂直 静置于室温下至浓缩胶完全聚合（约40min）。
5、样品的制备
1）标准蛋白样品的制备 （样品约5-10μg，最好离心取上清加样） 取分装好的20 μl低相对分子质量标准蛋白质，放入沸水浴中加热3～5min，取出冷却。
10%SDS /ml
0.05
凝胶贮备液(Acr/Bis) /ml 0.8
10%过硫酸铵 /μl
25
TEMED /μl
5
总体积 /ml
5ml
五、实验步骤
3、分离胶的灌制
按照上表左边操作。因加入TEMED后凝胶就开始聚合，故应立即混匀混合液，然后用滴管 吸取分离胶，在电泳槽的两玻璃之间灌注，避免气泡。留出梳齿的齿高加1cm空间以便灌注浓缩胶。 用滴管小心地在溶液上覆盖一层重蒸水，将电泳槽垂直静置于室温下约40～60min，待分离胶聚合 完全后，除去覆盖的重蒸水。
五、实验步骤
7、 染色与脱色
小心将胶取出，置于一大培养皿中。加染色液染色30min，倾出染色液，加入脱 色液，数小时更换一次脱色液，直至背景清晰。
8、相对分子量的计算
用直尺分别量出标准蛋白质、待测蛋白质区带中心以及溴酚蓝前沿距分离胶顶端 的距离，按下式计算相对迁移率（R）：
相对迁移率 = 样品迁移距离（cm）/ 指示剂迁移距离（cm）
10. 脱色液：50ml甲醇，75ml冰醋酸与875 ml重蒸水混合。 11. 待测蛋白样品。 12. 1%琼脂糖（最好用电极液配） 13. TEMED
五、实验步骤
1、洗净晾干电泳槽、玻璃板、夹条、梳齿等。安装后用1%琼脂糖封 玻璃板两侧及底部。
2、分离胶的选择和配置方法
1 2）分离胶和浓缩胶的配制方法
2）待测样品的制备 （同标准蛋白质样品处理）
6、 电泳
1）待浓缩胶完全聚合后，标记好加样孔位置，将电泳槽注满电极缓冲液，小心拔出梳齿， 用电极缓冲液冲洗加样孔数次。
2）用微量注射器按次序向加样孔内加样。 3）接上电泳仪，上电极接电源负极，下极接正极。打开电源，调节电流至20～30mA并保 持电流强度恒定。待蓝色的溴酚蓝条带迁移至距凝胶下端约1cm时，停止电泳。
溶 解后，定容至100ml，棕色试剂瓶4℃保存，30天内使用。
2. 分离胶缓冲液：1.5mol/L Tris-HCl，pH8.8。
18.15 Tris（三羟甲基氨基甲烷），少许重蒸水溶解，用1M HCl调pH8.8，重
蒸水定容至100ml，4℃保存。
3. 浓缩胶缓冲液：0.5mol/LHCl，pH6.8。
兔磷酸化酶B 97 400 牛血清白蛋白 66 200 兔肌动蛋白 43 000 牛碳酸酐酶 31 000 胰蛋白酶抑制剂 20 100 鸡蛋清溶菌酶 14 400
8. 质量浓度为10%过硫酸铵： （临用前配制） 9. 染色液：
0.25g考马斯亮蓝R250，加入40ml甲醇，10ml冰醋酸,蒸馏水定容至100ml，过滤。
PAGE测定蛋白质的相对分子量
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三、实验器材
1.直流稳压电泳仪 2.垂直平板电泳槽（含玻璃板、夹条、梳齿、夹子等） 3.移液器（1.0ml、200μl、20μl） 4.微量注射器（20μl） 5.烧杯、培养皿、试管、滴管、直尺 6.脱色摇床
四、实验试剂
1. 凝胶贮备液：丙烯酰胺（Acr）29.2g和亚甲基双丙烯酰胺（Bis）0.8g重蒸水
分离胶的浓度
12%
重蒸水 /ml
3.35
1.5M Tris-HCl(pH8.8) /ml 2.5
10%SDS /ml
0.1
凝胶贮备液(Acr/Bis) /ml
4.0
10%过硫酸铵 /μl
50
TEMED/μl（最后加，防烧杯中聚合） 5
总体积 /ml
10ml
浓缩胶的浓度
5%
重蒸水/ml
2.92
0.5M Tis-HCl(pH6.8)/ml 1.25
6gTris, 少许重蒸水溶解，用1M HCl调pH6.8，重蒸水定容至100ml，4℃保存。
4. 10%SDS，室温保存。
5. 两类样品缓冲液：
2倍还原缓冲液（2×reducing buffer）
0.5mol/L HCl，pH6.8 2.5 ml
甘油
2.0 ml
质量浓度10%SDS
4.0ml
质量浓度0.1%溴酚蓝
0.5ml
β-巯基乙醇
1.0 ml
总体积10 ml
四、实验试剂
6. 电极缓冲液，pH8.3。
Tris3g，甘氨酸14.4g，SDS1.0g加重蒸水溶解定容至1000ml，4℃保存。
7. 低分子量标准蛋白质（上海产）。
开封后溶于200μl重蒸水，加200μl 2倍样品缓冲液（还原缓冲液），分装20小管，20℃保存。临用前沸水浴3～5min，其相对分子量（Mr）如下：
4、浓缩胶的灌制 （等分离胶聚合后配制）
按照上表右边操作。混匀后灌注在分离胶上。小心插入梳齿，避免混入气泡，将电泳槽垂直 静置于室温下至浓缩胶完全聚合（约40min）。
5、样品的制备
1）标准蛋白样品的制备 （样品约5-10μg，最好离心取上清加样） 取分装好的20 μl低相对分子质量标准蛋白质，放入沸水浴中加热3～5min，取出冷却。
10%SDS /ml
0.05
凝胶贮备液(Acr/Bis) /ml 0.8
10%过硫酸铵 /μl
25
TEMED /μl
5
总体积 /ml
5ml
五、实验步骤
3、分离胶的灌制
按照上表左边操作。因加入TEMED后凝胶就开始聚合，故应立即混匀混合液，然后用滴管 吸取分离胶，在电泳槽的两玻璃之间灌注，避免气泡。留出梳齿的齿高加1cm空间以便灌注浓缩胶。 用滴管小心地在溶液上覆盖一层重蒸水，将电泳槽垂直静置于室温下约40～60min，待分离胶聚合 完全后，除去覆盖的重蒸水。
五、实验步骤
7、 染色与脱色
小心将胶取出，置于一大培养皿中。加染色液染色30min，倾出染色液，加入脱 色液，数小时更换一次脱色液，直至背景清晰。
8、相对分子量的计算
用直尺分别量出标准蛋白质、待测蛋白质区带中心以及溴酚蓝前沿距分离胶顶端 的距离，按下式计算相对迁移率（R）：
相对迁移率 = 样品迁移距离（cm）/ 指示剂迁移距离（cm）