Fc融合蛋白在药学领域的研究进展
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2）作为免疫复合物一部分，协助免疫细胞摄取抗原。 如 FcγR 介导的抗原摄取能够加强树突状细胞递呈抗 原和激活 CD4+ 和 CD8+ T 细胞的能力。
3）参与免疫球蛋白的运输，如 IgG 与 FcRn 的结合。
表 1 主要 Fc 受体一览 Table 1 Summary of main Fc receptors
2014 年 6 月 第 38 卷 第 6 期
Prog Pharm Sci Jun. 2014 Vol. 38 No. 6
420 王宇恒 , 等：Fc 融合蛋白在药学领域的研究进展
Hale Waihona Puke Baidu
融合，构建不能结合 FcγR I 和 C1q，无细胞毒性的长 效 EPO-hyFc 分子，其半衰期达到了重组人 EPO——阿 法达贝泊汀（darbepoetin alfa）的 2 倍 [3]。Vafa 等 [4] 通 过氨基酸替换，微调蛋白三级结构，破坏结合 FcγR 和补体的活性，构建能够完全消除免疫效应功能，但 能 够 正 常 结 合 新 生 儿 Fc 受 体（neonatal Fc receptor， FcRn）， 保 持 比 IgG2 更 长 循 环 血 浆 半 衰 期 的 IgG2Fc 突变体。Hristodorov 等 [5] 通过比较 6 种去糖基化的 hIgG 单抗和它们的糖基化物的理化性质和抗原结合力 等，发现去糖基化的 IgG1 单抗具有与糖基化物相似的 功能，并且由于前者引发免疫效应的能力降低，从而 更适用于作为治疗慢性疾病药物的融合伴侣。
受体
FcγRI (CD64)
抗体配基
IgG
细胞分布
单核细胞、巨噬细胞等
配基亲和力 /（L·mol-1）
107~109
效应
噬 菌 作 用， 细 胞 激 活， 介 导 ADCC 效应
FcγRIIA(CD32)
IgG
巨噬细胞、中性粒细胞等
<107
噬菌作用，脱颗粒作用，介导
ADCC 效应
FcγRIIB(CD32)
除了长效性，Fc 片段还能提高分子的稳定性。Fc 融合蛋白可以通过 Fc 铰链区的二硫键连接形成稳定的 二聚体，进一步通过对二硫键的基因工程改造和修饰， 还可以使 Fc 融合蛋白聚集成六聚体复合物 [9]。Fc 区域 可以独立折叠，保证伴侣分子体内外的稳定性。研究 发现，与 Fc 进行融合能够提高蛋白在哺乳动物细胞内 的表达 [10]，另一方面 Fc 片段可以与 Protein A 亲和柱特 异性结合，简化 Fc 融合蛋白的纯化步骤，这在相关生 物制品的研发过程中具有重要的意义。
FcεRI FcεRII(CD23) FcαRI (CD89)
FcRn
抗体配基
IgG IgG IgE IgE IgA IgG
细胞分布
巨噬细胞、单核细胞等 中性粒细胞、嗜酸细胞等 肥大细胞、嗜碱细胞等
B 细胞、T 细胞等 中性粒细胞、单核细胞等 上皮细胞、内皮细胞等
配基亲和力 /（L·mol-1）
2×107 <107 >1010 106 2×107
不同 Fc 片段能够特异性地结合体内相关 Fc 受体 （FcR），并发挥相应的生物学功能（见表 1）[11]，Fc 片段结合 FcR 发挥的生物学功能主要有以下 3 类。
1）结合免疫细胞表面的激活性或抑制性受体，正 向或负向调节免疫反应。激活性受体（如 FcγR Ⅱ A 等） 的胞浆区含有免疫受体酪氨酸活化基序（immunoreceptor tyrosine-based activation motifs，ITAM），而抑制性受体（如 FcγR Ⅱ B 等）胞浆区则含有抑制性基序（immunoreceptor tyrosine-based inhibitory motifs，ITIM），分别起到活化 和抑制免疫效应的作用。
Fc 融合蛋白是指利用基因工程等技术将某种具有 生物学活性的功能蛋白分子与 Fc 片段融合而产生的新 型蛋白，功能蛋白可以是能结合内源性受体（或配体） 的可溶性配体（或受体）分子或其他需要延长半衰期 的活性物质（如细胞因子）。该类融合蛋白不仅保留 了功能蛋白分子的生物学活性，并且还具有一些抗体 的性质，如长效半衰期。例如，普通重组 IL-2 体内半 衰期仅为 6.9 min，而重组 IL-2/Fc 融合蛋白体内循环半 衰期则延长了近 700 倍 [1]。
2 Fc 融合蛋白理化性质和生物学活性的影响 因素
Fc 融合蛋白的 2 个组成部分，通常具有相对独立 的结构域和功能，能够从不同的角度影响该类分子的 理化性质和生物学活性。
2.1 Fc 结构域 Fc 融合蛋白的重要特点是包含 Fc 片段，同时，这
也是影响其理化性质和生物学活性的关键因素。 抗体类药物往往具有较长的血浆半衰期，人体内源
蛋白。如阿斯利康的 Motavizumab-YTE 突变体的 Fc 段 包含了 3 个突变：“YTE”，即 252、254 和 256 位的 蛋氨酸（Met，M）、丝氨酸（Ser，S）和苏氨酸（Thr，T） 分别被酪氨酸（Tyr，Y）、T 和谷氨酸（Glu，E）替换， Ⅰ期临床研究证实本品在健康人体内的血浆半衰期达到 100 d，约为 Motavizumab 原型的 2~4 倍，而清除率仅为 原型的 71%~86%。“YTE”这一突变技术将有望应用 于其他抗体的优化，从而提高半衰期，减少给药频率 [8]。
性免疫球蛋白在 FcRn 的保护下，血浆半衰期能达到 19 d。Fc 融合蛋白含有的 Fc 片段也能够通过类似的原理 延长其半衰期，即 Fc 片段通过 CH2-CH3 与 FcRn 结合 并呈 pH 依赖性 [6]：在 pH 7.4 的生理条件下，FcRn 与 Fc 不结合；在细胞内涵体 pH 6.0~6.5 的酸性条件下， 两者结合，从而避免融合分子在细胞内被溶酶体等快速 降解。同时，融合 Fc 片段能够增大分子体积，降低肾 清除率 [7]。当然，还可以通过基因工程手段对 Fc 段的 氨基酸序列进行突变，获得半衰期更长的突变型融合
非溶细胞性融合蛋白由功能性蛋白与活性降低的 Fc 片段融合，通过对 Fc 片段上补体受体结合域或糖基 化模式的突变改造，调节 Fc 与相关受体的结合亲和力， 降低或消除 ADCC 和 CDC 效应，只保留功能蛋白的生 物学活性和 Fc 段长效体内半衰期，而不产生细胞毒性。 例如，研究者利用 IgD 和 IgG4 组成的杂合 Fc（hybrid Fc，hyFc） 与 促 红 细 胞 生 成 素（erythropoietin，EPO）
419 PROGRESS IN PHARMACEUTICAL SCIENCES 2014,38 (6):419-425
Fc 融合蛋白在药学领域的研究进展
王宇恒，郭薇，王欣，王辰，高向东，姚文兵 *
（中国药科大学生命科学与技术学院，江苏南京210009）
[ 摘要 ] Fc 融合蛋白是指利用基因工程等技术将某种具有生物活性的功能蛋白分子与 Fc 片段融合而产生的新型重组蛋白，其不仅保留了功 能蛋白分子的生物学活性，还具有一些抗体的性质，如通过结合相关 Fc 受体延长半衰期和引发抗体依赖细胞介导的细胞毒性效应等。对 Fc 融合蛋白及其在药学领域的研究进展进行了综述。 [ 关键词 ]Fc 融合蛋白；免疫球蛋白 Fc 片段；Fc 受体 [ 中图分类号 ]Q78[ 文献标志码 ] A[ 文章编号 ] 1001-5094（2014）06-0419-07
抗体类药物是当前药物研发的重点和热点，通常 能较快获得上市许可，并带来较大的商业成功。进入 21 世纪以来，美国 FDA 和欧洲药物管理局（European Medicines Agency，EMA）总共批准了约 20 种抗体类药 物。借助传统抗体的成功平台，一种基于抗体结构， 将蛋白或多肽与免疫球蛋白 Fc 片段相融合的新功能重 组蛋白也获得了一定的发展。
Advances in Research on Fc Fusion Protein in Pharmaceutical Field WANG Yuheng, GUO Wei, WANG Xin, WANG Chen, GAO Xiangdong, YAO Wenbing ( School of Life Science and Technology, China Pharmaceutical University, Nanjing 210009, China)
IgG
B 细胞、单核细胞等
<107
抑制细胞激活作用
Prog Pharm Sci Jun. 2014 Vol. 38 No. 6
2014 年 6 月 第 38 卷 第 6 期
王宇恒 , 等：Fc 融合蛋白在药学领域的研究进展
421
续表 1
受体
FcγRIIIA(CD16a) FcγRIIIB(CD16b)
接受日期：2014-03-31 * 通讯作者：姚文兵，教授； 研究方向：多肽、蛋白质类药物的分子改构和定点修饰研究； Tel：025-83271218； E-mail：wbyao @ cpu.edu.cn
1 Fc 融合蛋白的类别
根 据 是 否 需 要 发 挥 Fc 段 结 合 FcγR 来 介 导 抗 体 依 赖 细 胞 介 导 的 细 胞 毒 性（antibody-dependent cellmediated cytotoxicity，ADCC）或结合补体 C1q 来介导补 体依赖的细胞毒性（complement-dependent cytotoxicity， CDC）等的生物学活性，可将 Fc 融合蛋白分为溶细胞 性（cyto-lytic）和非溶细胞性（non-lytic）。前者由功 能性蛋白与天然或活性提高的 Fc 片段融合而成，不仅 具有功能蛋白的生物学活性和长效血浆半衰期，并且 保留了 Fc 段介导 ADCC 及 CDC 效应的能力，可以靶向 杀伤功能蛋白受体阳性细胞。在抗体应用领域，尤其 是具有抗肿瘤活性的抗体，通过优化 Fc 段氨基酸组成 或糖基化模式等，从而加强由其介导的 ADCC、CDC 等 细胞毒活性的研究已经成为一个热点 [2]。
[Abstract] Fc fusion protein is a new kind of recombinant protein fused with a functional part and Fc fragment part. Fc fusion protein not only maintains the bioactivity of functional part but also acquires the properties of antibody, such as binding Fc receptors to get longer half-life and to induce antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity (ADCC) effect. The Fc fusion proteins and their research progress in pharmaceutical field have been reviewed in this paper. [Key words] Fc fusion protein ; Fc fragment of immunoglobulin ; Fc receptor
2×108
效应
介导 ADCC 效应，促巨噬细胞分 泌细胞因子
诱导杀菌作用
脱颗粒作用，促炎性介质或细 胞因子释放
调节作用
噬菌作用，介导 ADCC 效应
将母体 IgG 转运到胎儿体内； 保护 IgG 免受降解
2.2 功能蛋白 虽然对 Fc 片段的改造会影响 Fc 融合蛋白的理化性
质和生物学活性，但其药理活性还是主要取决于功能蛋 白部分。功能蛋白应能特异性地结合某个靶点分子。例 如， 能 够 结 合 肿 瘤 坏 死 因 子（TNF） 并 拮 抗 其 作 用 的 上 市 药 物 有：TNF 全 长 抗 体（ 如 infliximab、adalimumab 和 golimumab），PEG 修 饰 的 Fab（ 如 certolizumab pegol） 和 TNFR-Fc 融合蛋白（如 etanercept）。靶点为 VEGF 的 药 物 有：VEGF 人 源 化 抗 体（ 如 bevacizumab）， 衍 生 自 bevacizumab 的 Fab（ 如 ranibizumab） 和 VEGFR-Fc 融 合 蛋白（如 aflibercept）。此外，人抗白介素 -1β 单克隆抗 体（如 canakinumab）、重组 IL-1R（如 anakinra）和 IL1R/Fc 融合蛋白（如 rinolacept）均能与 IL-1 相结合。
3）参与免疫球蛋白的运输，如 IgG 与 FcRn 的结合。
表 1 主要 Fc 受体一览 Table 1 Summary of main Fc receptors
2014 年 6 月 第 38 卷 第 6 期
Prog Pharm Sci Jun. 2014 Vol. 38 No. 6
420 王宇恒 , 等：Fc 融合蛋白在药学领域的研究进展
Hale Waihona Puke Baidu
融合，构建不能结合 FcγR I 和 C1q，无细胞毒性的长 效 EPO-hyFc 分子，其半衰期达到了重组人 EPO——阿 法达贝泊汀（darbepoetin alfa）的 2 倍 [3]。Vafa 等 [4] 通 过氨基酸替换，微调蛋白三级结构，破坏结合 FcγR 和补体的活性，构建能够完全消除免疫效应功能，但 能 够 正 常 结 合 新 生 儿 Fc 受 体（neonatal Fc receptor， FcRn）， 保 持 比 IgG2 更 长 循 环 血 浆 半 衰 期 的 IgG2Fc 突变体。Hristodorov 等 [5] 通过比较 6 种去糖基化的 hIgG 单抗和它们的糖基化物的理化性质和抗原结合力 等，发现去糖基化的 IgG1 单抗具有与糖基化物相似的 功能，并且由于前者引发免疫效应的能力降低，从而 更适用于作为治疗慢性疾病药物的融合伴侣。
受体
FcγRI (CD64)
抗体配基
IgG
细胞分布
单核细胞、巨噬细胞等
配基亲和力 /（L·mol-1）
107~109
效应
噬 菌 作 用， 细 胞 激 活， 介 导 ADCC 效应
FcγRIIA(CD32)
IgG
巨噬细胞、中性粒细胞等
<107
噬菌作用，脱颗粒作用，介导
ADCC 效应
FcγRIIB(CD32)
除了长效性，Fc 片段还能提高分子的稳定性。Fc 融合蛋白可以通过 Fc 铰链区的二硫键连接形成稳定的 二聚体，进一步通过对二硫键的基因工程改造和修饰， 还可以使 Fc 融合蛋白聚集成六聚体复合物 [9]。Fc 区域 可以独立折叠，保证伴侣分子体内外的稳定性。研究 发现，与 Fc 进行融合能够提高蛋白在哺乳动物细胞内 的表达 [10]，另一方面 Fc 片段可以与 Protein A 亲和柱特 异性结合，简化 Fc 融合蛋白的纯化步骤，这在相关生 物制品的研发过程中具有重要的意义。
FcεRI FcεRII(CD23) FcαRI (CD89)
FcRn
抗体配基
IgG IgG IgE IgE IgA IgG
细胞分布
巨噬细胞、单核细胞等 中性粒细胞、嗜酸细胞等 肥大细胞、嗜碱细胞等
B 细胞、T 细胞等 中性粒细胞、单核细胞等 上皮细胞、内皮细胞等
配基亲和力 /（L·mol-1）
2×107 <107 >1010 106 2×107
不同 Fc 片段能够特异性地结合体内相关 Fc 受体 （FcR），并发挥相应的生物学功能（见表 1）[11]，Fc 片段结合 FcR 发挥的生物学功能主要有以下 3 类。
1）结合免疫细胞表面的激活性或抑制性受体，正 向或负向调节免疫反应。激活性受体（如 FcγR Ⅱ A 等） 的胞浆区含有免疫受体酪氨酸活化基序（immunoreceptor tyrosine-based activation motifs，ITAM），而抑制性受体（如 FcγR Ⅱ B 等）胞浆区则含有抑制性基序（immunoreceptor tyrosine-based inhibitory motifs，ITIM），分别起到活化 和抑制免疫效应的作用。
Fc 融合蛋白是指利用基因工程等技术将某种具有 生物学活性的功能蛋白分子与 Fc 片段融合而产生的新 型蛋白，功能蛋白可以是能结合内源性受体（或配体） 的可溶性配体（或受体）分子或其他需要延长半衰期 的活性物质（如细胞因子）。该类融合蛋白不仅保留 了功能蛋白分子的生物学活性，并且还具有一些抗体 的性质，如长效半衰期。例如，普通重组 IL-2 体内半 衰期仅为 6.9 min，而重组 IL-2/Fc 融合蛋白体内循环半 衰期则延长了近 700 倍 [1]。
2 Fc 融合蛋白理化性质和生物学活性的影响 因素
Fc 融合蛋白的 2 个组成部分，通常具有相对独立 的结构域和功能，能够从不同的角度影响该类分子的 理化性质和生物学活性。
2.1 Fc 结构域 Fc 融合蛋白的重要特点是包含 Fc 片段，同时，这
也是影响其理化性质和生物学活性的关键因素。 抗体类药物往往具有较长的血浆半衰期，人体内源
蛋白。如阿斯利康的 Motavizumab-YTE 突变体的 Fc 段 包含了 3 个突变：“YTE”，即 252、254 和 256 位的 蛋氨酸（Met，M）、丝氨酸（Ser，S）和苏氨酸（Thr，T） 分别被酪氨酸（Tyr，Y）、T 和谷氨酸（Glu，E）替换， Ⅰ期临床研究证实本品在健康人体内的血浆半衰期达到 100 d，约为 Motavizumab 原型的 2~4 倍，而清除率仅为 原型的 71%~86%。“YTE”这一突变技术将有望应用 于其他抗体的优化，从而提高半衰期，减少给药频率 [8]。
性免疫球蛋白在 FcRn 的保护下，血浆半衰期能达到 19 d。Fc 融合蛋白含有的 Fc 片段也能够通过类似的原理 延长其半衰期，即 Fc 片段通过 CH2-CH3 与 FcRn 结合 并呈 pH 依赖性 [6]：在 pH 7.4 的生理条件下，FcRn 与 Fc 不结合；在细胞内涵体 pH 6.0~6.5 的酸性条件下， 两者结合，从而避免融合分子在细胞内被溶酶体等快速 降解。同时，融合 Fc 片段能够增大分子体积，降低肾 清除率 [7]。当然，还可以通过基因工程手段对 Fc 段的 氨基酸序列进行突变，获得半衰期更长的突变型融合
非溶细胞性融合蛋白由功能性蛋白与活性降低的 Fc 片段融合，通过对 Fc 片段上补体受体结合域或糖基 化模式的突变改造，调节 Fc 与相关受体的结合亲和力， 降低或消除 ADCC 和 CDC 效应，只保留功能蛋白的生 物学活性和 Fc 段长效体内半衰期，而不产生细胞毒性。 例如，研究者利用 IgD 和 IgG4 组成的杂合 Fc（hybrid Fc，hyFc） 与 促 红 细 胞 生 成 素（erythropoietin，EPO）
419 PROGRESS IN PHARMACEUTICAL SCIENCES 2014,38 (6):419-425
Fc 融合蛋白在药学领域的研究进展
王宇恒，郭薇，王欣，王辰，高向东，姚文兵 *
（中国药科大学生命科学与技术学院，江苏南京210009）
[ 摘要 ] Fc 融合蛋白是指利用基因工程等技术将某种具有生物活性的功能蛋白分子与 Fc 片段融合而产生的新型重组蛋白，其不仅保留了功 能蛋白分子的生物学活性，还具有一些抗体的性质，如通过结合相关 Fc 受体延长半衰期和引发抗体依赖细胞介导的细胞毒性效应等。对 Fc 融合蛋白及其在药学领域的研究进展进行了综述。 [ 关键词 ]Fc 融合蛋白；免疫球蛋白 Fc 片段；Fc 受体 [ 中图分类号 ]Q78[ 文献标志码 ] A[ 文章编号 ] 1001-5094（2014）06-0419-07
抗体类药物是当前药物研发的重点和热点，通常 能较快获得上市许可，并带来较大的商业成功。进入 21 世纪以来，美国 FDA 和欧洲药物管理局（European Medicines Agency，EMA）总共批准了约 20 种抗体类药 物。借助传统抗体的成功平台，一种基于抗体结构， 将蛋白或多肽与免疫球蛋白 Fc 片段相融合的新功能重 组蛋白也获得了一定的发展。
Advances in Research on Fc Fusion Protein in Pharmaceutical Field WANG Yuheng, GUO Wei, WANG Xin, WANG Chen, GAO Xiangdong, YAO Wenbing ( School of Life Science and Technology, China Pharmaceutical University, Nanjing 210009, China)
IgG
B 细胞、单核细胞等
<107
抑制细胞激活作用
Prog Pharm Sci Jun. 2014 Vol. 38 No. 6
2014 年 6 月 第 38 卷 第 6 期
王宇恒 , 等：Fc 融合蛋白在药学领域的研究进展
421
续表 1
受体
FcγRIIIA(CD16a) FcγRIIIB(CD16b)
接受日期：2014-03-31 * 通讯作者：姚文兵，教授； 研究方向：多肽、蛋白质类药物的分子改构和定点修饰研究； Tel：025-83271218； E-mail：wbyao @ cpu.edu.cn
1 Fc 融合蛋白的类别
根 据 是 否 需 要 发 挥 Fc 段 结 合 FcγR 来 介 导 抗 体 依 赖 细 胞 介 导 的 细 胞 毒 性（antibody-dependent cellmediated cytotoxicity，ADCC）或结合补体 C1q 来介导补 体依赖的细胞毒性（complement-dependent cytotoxicity， CDC）等的生物学活性，可将 Fc 融合蛋白分为溶细胞 性（cyto-lytic）和非溶细胞性（non-lytic）。前者由功 能性蛋白与天然或活性提高的 Fc 片段融合而成，不仅 具有功能蛋白的生物学活性和长效血浆半衰期，并且 保留了 Fc 段介导 ADCC 及 CDC 效应的能力，可以靶向 杀伤功能蛋白受体阳性细胞。在抗体应用领域，尤其 是具有抗肿瘤活性的抗体，通过优化 Fc 段氨基酸组成 或糖基化模式等，从而加强由其介导的 ADCC、CDC 等 细胞毒活性的研究已经成为一个热点 [2]。
[Abstract] Fc fusion protein is a new kind of recombinant protein fused with a functional part and Fc fragment part. Fc fusion protein not only maintains the bioactivity of functional part but also acquires the properties of antibody, such as binding Fc receptors to get longer half-life and to induce antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity (ADCC) effect. The Fc fusion proteins and their research progress in pharmaceutical field have been reviewed in this paper. [Key words] Fc fusion protein ; Fc fragment of immunoglobulin ; Fc receptor
2×108
效应
介导 ADCC 效应，促巨噬细胞分 泌细胞因子
诱导杀菌作用
脱颗粒作用，促炎性介质或细 胞因子释放
调节作用
噬菌作用，介导 ADCC 效应
将母体 IgG 转运到胎儿体内； 保护 IgG 免受降解
2.2 功能蛋白 虽然对 Fc 片段的改造会影响 Fc 融合蛋白的理化性
质和生物学活性，但其药理活性还是主要取决于功能蛋 白部分。功能蛋白应能特异性地结合某个靶点分子。例 如， 能 够 结 合 肿 瘤 坏 死 因 子（TNF） 并 拮 抗 其 作 用 的 上 市 药 物 有：TNF 全 长 抗 体（ 如 infliximab、adalimumab 和 golimumab），PEG 修 饰 的 Fab（ 如 certolizumab pegol） 和 TNFR-Fc 融合蛋白（如 etanercept）。靶点为 VEGF 的 药 物 有：VEGF 人 源 化 抗 体（ 如 bevacizumab）， 衍 生 自 bevacizumab 的 Fab（ 如 ranibizumab） 和 VEGFR-Fc 融 合 蛋白（如 aflibercept）。此外，人抗白介素 -1β 单克隆抗 体（如 canakinumab）、重组 IL-1R（如 anakinra）和 IL1R/Fc 融合蛋白（如 rinolacept）均能与 IL-1 相结合。