光谱分析技术ppt课件
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（2）选定波长 根据实验要求，转动波长手轮，调至所需要的单色波长。 （3）固定灵敏度档 在能使空白溶液很好地调到“100%”的情况下，尽可能采用灵敏
度 较低的挡，使用时，首先调到“1”挡，灵敏度不够时再逐渐升高。但换挡改变
灵敏 度后，须重新校正“0%”和“100%”。选好的灵敏度，实验过程中不要再变动。
溶液颜色的深浅与浓度之间的关系可 以用吸收定律来描述。它是由约
翰·海 因里希·朗伯和奥古斯特·比尔相结合 而成的，所以叫朗伯-比尔定律。原 子吸收分光光度计也符合这个定律。
溶液对光的吸收 当一束强度为I的平 行单色光照到溶液时，一部分光被溶 液吸收，一部分光被界面散射，其余 的光则透过溶液，如图所示
（4）调节T=0% 轻轻旋动“0%”旋钮，使数字显示为“00.0”（此时试样室是打开 的）。
（5）调节T=100% 将盛蒸馏水（或空白溶液，或纯溶剂）的比色皿放入比色皿座架中 的第一格内，并对准光路，把试样室盖子轻轻盖上，调节透过率“100%”旋钮，
使 数字显示正好为“100.0”。
（6）吸光度的测定 将选择开关置于“A”，盖上试样室盖子，将空白液置于光路中， 调 节吸光度调节旋钮，使数字显示为“.000”。将盛有待测溶液的比色皿放入比色 皿 座架中的其它格内，盖上试样室盖，轻轻拉动试样架拉手，使待测溶液进入光16 路，此时数字显示值即为该待测溶液的吸光度值。读数后，打开试样室盖，切断
光子的能量与波长的关系为 E=hυ= hc／λ
式中E为光子的能量（J：焦耳），υ为频率，h为普朗克常数（6.63×1034J·S），c为光速，λ为光的波长
因此，不同波长的光，其能量不同，短波能量大，长波能量小。
6
光的显色原理
若把某两种颜色的光，按一定的强度比例 混合，能够得到白色光，则这两种颜色的 光叫做互补色。图中处于直线关系的两种 光为互补色。如绿光和紫光为互补色， 黄光和蓝光为互补色等等。
4
光谱分析技术原理：
利用各种化学物质都具有发射、吸收或散射光谱谱系的特 征，以此来确定物质性质、结构或含量。
光谱分析技术分类：
发射光谱分析技术：火焰光度法、荧光法 吸收光谱分析技术：紫外、红外、原子、可见光分光光度法 散射光谱分析技术：比浊法
5
一、分光光度技术的基本原理
许多化学物质具有颜色，有些无颜色的化合物也可以与显色剂作用，生 成有色物质。实践证明，有色溶液的浓度越大，颜色越深；浓度越小， 颜色越浅。因此，可以通过比较溶液颜色深浅的方法来确定有色溶液 的浓度，对溶液中所含的物质进行定量分析。基于比较颜色深浅对溶液 进行定量分析的方法称为比色分析法。
各种溶液会呈现出不同的颜色，其原因是 溶液中有色质点（分子或离子）选择性地 吸收某种颜色的光。
实验证明：溶液所呈现的颜色是其主要吸收
光的互补色。如一束白光通过高
锰酸钾溶液时，绿光大部分被选
择吸收，其它的光透过溶液。从
互补色示意图可以看出， 透过光
中只剩下紫色光，所以高锰酸钾
溶液呈紫色。
7
（二）光的吸收定律
E 表示
E = C（g/dl）.L(cm)
单位是dL/(g.cm)
摩尔消光系数与百分消光系数的换算关系：
ε =E
* M（摩尔质量）
10
12
一、仪器基本组成
光源
单色器
样品室
检测器
显示
13
可见分光光度计
14
722型百度文库光光度计示意图
15
722型分光光度计使用方法
（1）预热仪器 将选择开关置于“T”，打开电源开关，使仪器预热20分钟。为了防止 光 电管疲劳，不要连续光照，预热仪器时和不测定时应将试样室盖打开，使光路切 断。
色 即由光的波长决定，人眼能感 觉到的光称为可见光，其波长 在400～750nm之间。在可见 光之外是 红外光760~1000nm
3
紫外光200~400nm
什么是光谱分析技术？
光的波长（λ） 单位用纳米（nm） 各种化学物质都具有一定的光谱特性，表现在能选择性吸收、 发射或散射某种波长的光。利用物质的吸收光谱、发射光谱 或散射光谱特征对物质进行定性、定量分析的技术称为光谱 分析技术。
A＝KCL
式中：
A——吸光度（或叫做光密度，也可用D表示）；
K——某溶液的消光（吸收）系数； C——溶液的浓度； L——光程，即溶液的厚度。
Lambert-Beer定律适用于可见光、紫外光、红外光和均匀非散射的液体。
10
分光光度计的基本结构
可见光光度计 721、721-A、722、723型 分光光度计等
紫外分光光度计 751、752、753型分光光度 计等
紫外-可见分光光度计 贝克曼DU500系列紫外/分 光光度计
11
吸光（消光）系数表达式
吸光系数
A
a表示
a = C（g/L）.L(cm)
单位 L/g.cm
摩尔消光系数
A
ε表示
ε = C（mol/L）.L(cm)
单位 L/mol.cm
百分消光系数
A
学习目标
1.能说出临床生物化学检验常用分析技术 名称
2.掌握光的吸收定律，理解吸光系数的意 义和应用
3.叙述分光光度技术的定量测定方法
4.知道火焰光度法、比浊法、原子吸收分 光光度法荧光分析法的原理、影响因 素和主要应用
2
是能的一种表现形式，是电 磁波的一种。光在真空中以直 线方式传播，在不同的介质处 发生反射、折射、衍射、色散、 干涉和偏振等现象。可用波长、 频率、传播速度等参量来描述 即光具有“波动性”。光的颜
A=－lgT=lg1/T=lgI 0/ I t
9
吸光度越大，表示该物质对光的吸收越强。透光度和吸光度都是用来表示 入射光被吸收的程度，它们之间可据式相互换算。
实验证明：单色光经过有色溶液时，透过溶液的光强度不仅与溶液的浓度 有关，而且还与溶液的厚度以及溶液本身对光的吸收性能有关。 其规律可用下式表示为
注意事项
（1）为了防止光电管疲劳，不测定时必须将试样室盖打 开，使光路切断，以延长光电管的使用寿命。
8
结论：
I0=I a+ I r+ I t
I0--入射光强度 I a--吸收光强度 I r--反射光强度 I t--透射光强度
通常由于I r很小可忽略不计，上式可简化为 I0=I a+ I t
透射光I t与入射光强度I0之比为透光率或透 光度，用T表示：
T= I t/ I 0 透光率的负对数称为吸光度或光密度或消光 度，用A表示：
度 较低的挡，使用时，首先调到“1”挡，灵敏度不够时再逐渐升高。但换挡改变
灵敏 度后，须重新校正“0%”和“100%”。选好的灵敏度，实验过程中不要再变动。
溶液颜色的深浅与浓度之间的关系可 以用吸收定律来描述。它是由约
翰·海 因里希·朗伯和奥古斯特·比尔相结合 而成的，所以叫朗伯-比尔定律。原 子吸收分光光度计也符合这个定律。
溶液对光的吸收 当一束强度为I的平 行单色光照到溶液时，一部分光被溶 液吸收，一部分光被界面散射，其余 的光则透过溶液，如图所示
（4）调节T=0% 轻轻旋动“0%”旋钮，使数字显示为“00.0”（此时试样室是打开 的）。
（5）调节T=100% 将盛蒸馏水（或空白溶液，或纯溶剂）的比色皿放入比色皿座架中 的第一格内，并对准光路，把试样室盖子轻轻盖上，调节透过率“100%”旋钮，
使 数字显示正好为“100.0”。
（6）吸光度的测定 将选择开关置于“A”，盖上试样室盖子，将空白液置于光路中， 调 节吸光度调节旋钮，使数字显示为“.000”。将盛有待测溶液的比色皿放入比色 皿 座架中的其它格内，盖上试样室盖，轻轻拉动试样架拉手，使待测溶液进入光16 路，此时数字显示值即为该待测溶液的吸光度值。读数后，打开试样室盖，切断
光子的能量与波长的关系为 E=hυ= hc／λ
式中E为光子的能量（J：焦耳），υ为频率，h为普朗克常数（6.63×1034J·S），c为光速，λ为光的波长
因此，不同波长的光，其能量不同，短波能量大，长波能量小。
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光的显色原理
若把某两种颜色的光，按一定的强度比例 混合，能够得到白色光，则这两种颜色的 光叫做互补色。图中处于直线关系的两种 光为互补色。如绿光和紫光为互补色， 黄光和蓝光为互补色等等。
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光谱分析技术原理：
利用各种化学物质都具有发射、吸收或散射光谱谱系的特 征，以此来确定物质性质、结构或含量。
光谱分析技术分类：
发射光谱分析技术：火焰光度法、荧光法 吸收光谱分析技术：紫外、红外、原子、可见光分光光度法 散射光谱分析技术：比浊法
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一、分光光度技术的基本原理
许多化学物质具有颜色，有些无颜色的化合物也可以与显色剂作用，生 成有色物质。实践证明，有色溶液的浓度越大，颜色越深；浓度越小， 颜色越浅。因此，可以通过比较溶液颜色深浅的方法来确定有色溶液 的浓度，对溶液中所含的物质进行定量分析。基于比较颜色深浅对溶液 进行定量分析的方法称为比色分析法。
各种溶液会呈现出不同的颜色，其原因是 溶液中有色质点（分子或离子）选择性地 吸收某种颜色的光。
实验证明：溶液所呈现的颜色是其主要吸收
光的互补色。如一束白光通过高
锰酸钾溶液时，绿光大部分被选
择吸收，其它的光透过溶液。从
互补色示意图可以看出， 透过光
中只剩下紫色光，所以高锰酸钾
溶液呈紫色。
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（二）光的吸收定律
E 表示
E = C（g/dl）.L(cm)
单位是dL/(g.cm)
摩尔消光系数与百分消光系数的换算关系：
ε =E
* M（摩尔质量）
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一、仪器基本组成
光源
单色器
样品室
检测器
显示
13
可见分光光度计
14
722型百度文库光光度计示意图
15
722型分光光度计使用方法
（1）预热仪器 将选择开关置于“T”，打开电源开关，使仪器预热20分钟。为了防止 光 电管疲劳，不要连续光照，预热仪器时和不测定时应将试样室盖打开，使光路切 断。
色 即由光的波长决定，人眼能感 觉到的光称为可见光，其波长 在400～750nm之间。在可见 光之外是 红外光760~1000nm
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紫外光200~400nm
什么是光谱分析技术？
光的波长（λ） 单位用纳米（nm） 各种化学物质都具有一定的光谱特性，表现在能选择性吸收、 发射或散射某种波长的光。利用物质的吸收光谱、发射光谱 或散射光谱特征对物质进行定性、定量分析的技术称为光谱 分析技术。
A＝KCL
式中：
A——吸光度（或叫做光密度，也可用D表示）；
K——某溶液的消光（吸收）系数； C——溶液的浓度； L——光程，即溶液的厚度。
Lambert-Beer定律适用于可见光、紫外光、红外光和均匀非散射的液体。
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分光光度计的基本结构
可见光光度计 721、721-A、722、723型 分光光度计等
紫外分光光度计 751、752、753型分光光度 计等
紫外-可见分光光度计 贝克曼DU500系列紫外/分 光光度计
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吸光（消光）系数表达式
吸光系数
A
a表示
a = C（g/L）.L(cm)
单位 L/g.cm
摩尔消光系数
A
ε表示
ε = C（mol/L）.L(cm)
单位 L/mol.cm
百分消光系数
A
学习目标
1.能说出临床生物化学检验常用分析技术 名称
2.掌握光的吸收定律，理解吸光系数的意 义和应用
3.叙述分光光度技术的定量测定方法
4.知道火焰光度法、比浊法、原子吸收分 光光度法荧光分析法的原理、影响因 素和主要应用
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是能的一种表现形式，是电 磁波的一种。光在真空中以直 线方式传播，在不同的介质处 发生反射、折射、衍射、色散、 干涉和偏振等现象。可用波长、 频率、传播速度等参量来描述 即光具有“波动性”。光的颜
A=－lgT=lg1/T=lgI 0/ I t
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吸光度越大，表示该物质对光的吸收越强。透光度和吸光度都是用来表示 入射光被吸收的程度，它们之间可据式相互换算。
实验证明：单色光经过有色溶液时，透过溶液的光强度不仅与溶液的浓度 有关，而且还与溶液的厚度以及溶液本身对光的吸收性能有关。 其规律可用下式表示为
注意事项
（1）为了防止光电管疲劳，不测定时必须将试样室盖打 开，使光路切断，以延长光电管的使用寿命。
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结论：
I0=I a+ I r+ I t
I0--入射光强度 I a--吸收光强度 I r--反射光强度 I t--透射光强度
通常由于I r很小可忽略不计，上式可简化为 I0=I a+ I t
透射光I t与入射光强度I0之比为透光率或透 光度，用T表示：
T= I t/ I 0 透光率的负对数称为吸光度或光密度或消光 度，用A表示：