扫描电镜样品制备讲解

三、扫描电镜样品的制备
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1. 取样： 将取下的动植物组织放入预冷的含有 2％戊二醛
溶液的载玻片上，用刀片将组织块切成长 4mm左 右、高 3mm 左右的小块。 2. 样品的清洁：
把载玻片上切好的样品快，用牙签轻轻地逐个 拨入盛有0.1mol/L PH7.2 磷酸缓冲液的青霉素小 瓶中漂洗，并反复更换用于清洗的缓冲液，一般 漂洗 1小时，换液 3-4次。
主要优点： 景深长，所获得的图像立体感强，可用来观察生物 样品的各种形貌特征。
二、实验用品
1. 材料 植物的的根、茎、叶或动物的脏器等。
2. 试剂 丙酮、乙醇、 2％戊二醛溶液、 1％锇酸、
0.1mol/L PH7.2 磷酸缓冲液、醋酸异戊酯、液 体二氧化碳、导电胶等。 3. 器材
扫描电镜、 临界点干燥法、真空喷镀仪、青 霉素小瓶、培养皿、载玻片、牙签、脱脂棉等。
实验十一 扫描电镜样品制备
选作
扫描电镜即扫描电子显微镜（Scanning Electron Microscope，简称SEM）。主要用于观察样品的表面形貌 、割裂面结构、管腔内表面的结构等。
一、扫描电镜工作原理：
主要是利用样品表面产生的二次电子成像来对ຫໍສະໝຸດ Baidu质 的表面结构进行研究，是探索微观世界的有力工具。
? 加温置换：将温度调节设定在20℃处经15～20min后，由 于温度升高，杯内液体二氧化碳逐渐气化，因此，压力也 随之上升至7000Pa左右，样品中的醋酸异戊酯将与二氧 化碳充分置换。
? 气化：将温度旋钮调至临界温度以上(35～40℃)，此时随 着温度升高，样品杯内的压力也逐渐增加，达到二氧化碳 的临介点，界面也随之消失。当压力达到7134Pa时，经 5min后，即可排气。
? 装样： 将样品从醋酸异戊酯中挑入(或倒入)样品笼中，用 滤纸吸去样品笼外围的醋酸异戊酯，然后连笼移入仪器的 样品杯(高压容器)内，盖上盖并拧紧以防漏气。(注：在装 样前，应先打开仪器电源，将温度调节设定在0℃处预冷 10～15min，以保证液态二氧化碳有足够量进入样品杯中)。
? 注入液体二氧化碳 依次打开二氧化碳钢瓶排气阀和仪器的 进气阀在0～10℃下，向样品杯注入液体二氧化碳。
7. 粘贴样品
用牙签将少量导电胶涂到样品台上，胶面应略小于样品 底面。用镊子轻夹样品侧面，保证观察面向上贴牢在涂胶 上。粘贴后，待导电胶干透，才能进行真空镀膜和SEM镜 检。
8. 样品的导电处理
生物样品和其他非金属样品的表面电阻率很高，在电 镜观察时，往往容易发生荷电现象。另外，生物样品都是 由低原子序数的碳、氢、氧、氮等元素组成，二次电子的 发射率很低，信号弱，难以获得必要的图像反差。因此， 为了消除或减少以上不良现象的产生，生物样品和非导电 的样品在扫描电镜观察前，均需进行表面导电处理。扫描 电镀样品的表面导电处理方法，主要有金属镀膜法和组织 导电处理法两种。其中金属镀膜法又有真空镀膜及离子溅 射镀膜法等方法，本实验采用离子溅射镀膜法进行镀膜。
离子溅射镀膜法 :
3. 样品的固定
样品的固定、漂洗和脱水等处理所用的试剂和 方法基本上与透射电镜的样品相同，但由于扫描 电镜观察的是样品的表面，主要是要求保持样品 表面的原貌，因此，在固定、漂洗和脱水过程也 与透射电镜样品处理有不同之处。
一般在4℃的条件下完成固定比较好， 戊二 醛、锇酸均可单独固定，也可用“戊二醛 -锇酸” 双重固定法。
? 当液体二氧化碳充至样品杯容积的50％(通过刻度尺观察， 以液面超过样品笼为度)时，关闭仪器进气阀，静置15～ 20min，让醋酸异戊酯向液态二氧化碳中充分扩散，然后， 打开仪器排气流量计阀门和进气阀门，让其边排气边充液 10min左右，(让含有醋酸异戊酯的二氧化碳排出和充入新 鲜的液态二氧化碳)再关闭排气阀；继续充入液体二氧化碳 至样品杯的80％左右，关闭进液阀，停止充液。
5. 置换乙醇
吸出乙醇，加入醋酸异戊酯与乙醇 1：1的混合 液，浸泡 10-20 分钟并适当摇动，再吸弃混合液， 加入纯醋酸异戊酯浸泡 10-20分钟并适当摇动。
6. 样品的干燥
常规临界点干燥法。
临界点干燥法
? 临界点干燥法是一种消除了物相界面(液相／气相)，也就是 消除了表面张力来源的干燥方法。这种方法由于没有表面 张力的影响，所以样品不易收缩和损伤。具体处理步骤如 下：
? 排气：在保持温度不变的条件下(即不关电源)，打开流量 计的排气阀门，以1.0～1.51／min的速度排气(速度慢些 更好)。约经45～60min后，排气完毕，样品杯的压力下降 到零，将温度调节至室温约5rain后，即可取出样品装台镀 膜(若不能立即装台，应置于干燥器内保存)。
临界点干燥操作时的注意事项： ? 在样品放进样品杯前，样品杯应预先冷却至0～10℃。 ? 样品不宜过湿，但也不能让其表面干涸，应在半干半湿时
送入样品杯。因为过湿表明乙酸异戊脂太多会干燥后样品 仍含有乙酸异戊脂，影响干燥效果。而过干又会因空气干 燥而造成样品己变形，再进行临介点干燥也没有意义了。 ? 一次加入的样品不宜过多，以免带进过多的中间液，使样 品干燥不完全，另外，样品过多使二氧化碳量充入不足而 达不到临界点。 ? 充入液体二氧化碳的量要足。因为充液量不足，达不到临 界值，起不到临界点干燥作用，一般充液量应达样品杯容 积的2/3左右。 ? 在加温气化时，实际操作温度应超过临界值，以保证达到 充分的临界状态。 ? 开 、 闭 阀门时，动作要轻缓，尽量防止二氧化碳液对 样品产生突然冲击而造成样品损伤。因此，样品笼的上下 应垫上一层镜头纸或滤纸。排气速度也应尽量缓慢，一般 放气时间应在．4Omin以上，有时也可以放气过夜或过中 午。
固定1-3小时（依样品种类和固定剂而已）后， 吸出固定液， 加入0.1mol/L PH7.2 磷酸缓冲液， 漂洗1小时，换液 3-4次。
4. 脱水
从小瓶中吸出缓冲液， 加入乙醇逐级梯度脱水， 脱水剂的乙醇浓度依次为 30%－50%－70%－ 80%－90%－100%乙醇（两次）逐级脱水；样品 在每级停留 15-30分钟。