治疗性抗体的改造

医学分子生物学杂志,2006,3(4):245 249 JM ed M o lB io,l2006,3(4):245 249

院士述评治疗性抗体的改造

沈倍奋

军事医学科学院基础医学研究所北京市,

100850

沈倍奋,中国工程院院士,军事医学科学院基础医学研究所研究员,博士生导师。中国

人民解放军分子免疫学重点实验室主任。现任中华医学会副会长,中国发明家学会副理

事长。从事单克隆抗体和基因工程抗体的研究和应用多年,近年来与不同学科的专家合

作致力于基于抗原-抗体相互作用的立体结构信息设计新功能分子的研究。在国内外学

术期刊上发表论文200余篇,主编专著4部。

【摘要】 市场上已有18个被FDA批准的单克隆抗体,它们用于治疗如肿瘤、移植排斥、自身免疫病、病毒感染等人类疾病。治疗性抗体代表了生物制药业发展最快的领域之一。随着技术的发展,各种形式的工程抗体被构建来改善它们的特性和效能,包括:鼠抗体人源化,提高生物学活性,如亲和力成熟,改进效应功能,改善药代动力学。文章评述了这一领域的最新进展,同时也讨论了工程抗体的免疫原性和亲和力。【关键词】 单克隆抗体;治疗性抗体;基因工程抗体;抗体人源化

【中图分类号】 R392 116

I mprove m ent of Therapeutic Anti bodies

SHEN B eifen

Institute of BasicM edical Sciences,Acade my of M ilit a ry M edical S ciences,B eijing,100850,China 【Abstract】 I n the m ar ke,t t h ere are eighteen m onoclonal anti b od i e s approved by the FDA They have been used to trea t hum an d i s ease,such as cancer,transplan t rejection,auto i m m udisease,an ti v ira l prophy lax is and so on The therapeu tic antibod ies represent one of the fastest gro w ing areas o f t h e b i o phar m aceutical industr y W ith the techno logy develop m en,t a diversity of eng i n eered anti b ody for m s have been created to i m prove their characteriza ti o n and efficacy,i n clud i n g hum anization o f m uri n e anti b odies,enhanc i n g t h e ir b i o log ical activities such as affi n ity m aturation,i m prove m ent o f effector functions,and alteri n g phar m acokinetics This revie w summ arized recent deve lopm ents i n t h is fie l d,also discussed t h e i m munogen icity and affi n ity of engineered anti b od i e s

【K ey w ords】 monoclona l antibody;therapeutic anti b ody;eng i n eered an ti b ody;hum an ized anti body

治疗性抗体是可以用来治疗疾病的抗体,因此也称它们为抗体药物。截至2005年5月,美国FDA已经批准18个抗体药物,主要用于治疗肿瘤、自身免疫性疾病、病毒感染和器官移植时的排斥反应等[1]。同时有100多种治疗性抗体正在进行临床试验,500多种抗体处于临床前研究。2003~ 2004年抗体药物销售增长48 1%,突破100亿美元。在以后几年里,抗体药物可能以更快的速度增长,预计到2010年可达到300亿美元[2]。从抗体药物的发展速度来看,目前它已成为生物技术药物中最重要的一大类,也是世界生物工程制药业的支柱产品之一[3]。

抗体作为治疗性药物已有上百年的历史。当时主要用抗血清进行治疗,由于其成分太复杂、多变,而且是异源蛋白,在治疗时会出现严重副作用。1975年,单克隆抗体技术问世,它是一种均一性好,且可无限生产的、抗单一抗原决定簇的抗体。1982年,Levy制备了针对一个B淋巴瘤患者瘤细胞的抗独特型单克隆抗体,对该患者的治疗取得很好的疗效。这一结果引起了人们对单抗用于治

疗产生了极大热情和期望,单抗被称之为 魔弹 。但事实并非如此,以后试用的一些抗肿瘤单抗并没有达到预期的效果。1986年,美国FDA批准抗CD3单抗OKT3用于抗移植排斥反应;1995年,欧洲上市17 1A鼠单抗治疗大肠癌。这些单抗的临床应用显示出两个方面的主要问题:鼠抗体虽然对靶抗原是非常特异的,但它不能激活相应的人的效应系统,如抗体依赖性细胞介导的细胞毒作用(ADCC)、补体依赖的细胞毒作用(CDC)等;此外,鼠抗体作为外源蛋白进入人体,会使人体免疫系统产生应答,即产生人抗鼠抗体(hum an anti m ouse an ti b ody,HAMA),而且异源蛋白在人体内很快被清除,即半寿期很短[4]。因此,人们利用重组DNA技术来解决上述问题[5 6]。

1 抗体人源化改造

最早出现的人源化抗体是人-鼠嵌合抗体,将鼠抗体可变区基因片段连接到人抗体恒定区基因上,由于Ig G类型的抗体稳定性好,易纯化和保存,因此嵌合抗体通常用Ig G型。人I gG有4个亚类,其中Ig G1和Ig G3亚类能结合补体,因此需要CDC效应来杀伤靶细胞的嵌合抗体采用Ig G1型恒定区[7]。一般嵌合抗体的人源化程度可达70%。进一步人源化的方法很多,最早是CDR移植,将鼠抗体的互补决定区(co m ple m entarity deter m i n i n g reg i o n,CDR)移植到人抗体的相应部位,这样人源化程度可达90%以上。但简单的CDR移植往往明显降低抗原-抗体反应的亲和力,甚至丧失与抗原结合的能力。为了保留亲本鼠抗体的亲和力和特异性,一些支持CDR loop构型的鼠Ig框架区氨基酸也应该进行移植。随着计算机模建技术的发展,蛋白质晶体结构数据库中抗体和某些抗原晶体数据的增多,在抗体人源化改造时,可以根据人和鼠CDRs间结构相似性选择人Ig模板,挑选能支持移植的鼠CDR与相应抗原结合的模板进行人源化改造[8 10]。最近,也有人提出框架改组(fra m e w ork shuffli n g)的方法进行抗体人源化改造[11],主要是将鼠抗体的6个CDR区以正确的读框融合到人I g 胚系框架中构建成库,用相应抗原筛库。由于筛出的抗体框架来源于相匹配的CDR序列和结构,因此它保留了与抗原的最好结合,这种抗体接近于天然的全人抗体。如果抗原也有晶体结构,则可以采用特异性决定基(spec ific ity deter m i n i n g residues, SDR)移植的方法[12],该方法首先需要分析待改造抗体的结合位点,或通过抗原-抗体复合物的三维结构确定抗体高变区中与抗原结合的关键氨基酸,然后将这些决定特异性的关键氨基酸移植到相匹配的人抗体相应位置上。另一种常用的人源化方法是表面重塑技术,即鼠抗体框架区表面氨基酸的 人源化 [13],通过鼠和人抗体可变区立体构象叠合比对,寻找合适的人抗体模板,将鼠Fv段表面暴露的框架区残基中与人Fv不同者改为人源的氨基酸,达到Fv的表面残基人源化,使免疫原性降低,由于不影响Fv的整体空间构象,所以仍保留与抗原的结合能力。

20世纪90年代,抗体库技术的出现为抗体人源化和人源抗体的制备开辟了新途径[14 15]。该技术将PCR扩增、抗体片段在大肠杆菌中功能性表达和噬菌体展示技术结合起来,在体外模拟体内的抗体生成过程。具体是利用PCR方法将B细胞中所有抗体基因钓出来,克隆到载体上,使之表达于噬菌体表面,构建成噬菌体抗体库,然后用抗原筛选出表达相应抗体的噬菌体,经扩增、测序获得特异性抗体基因。如果B细胞来源于人外周血,则可得到人抗体。也可以通过合成抗体库获得人抗体。该技术基于对已有人抗体的序列信息进行聚类分析后,将可用的胚系基因及所有重排的序列进行分组,所有序列中95%以上可归为14个亚组,其中7个V H亚组、4个V 和3个V 亚组,亚组的每个成员之间都有高度同源性。因此,可以设计、合成14个亚组各自通用的基因,作为构建组合抗体库的主干基因[16],然后与上述方法相似,用抗原从合成抗体库中筛选出相应的抗体。

抗原表位定向选择(ep itope gu i d ed se lection)的人源化方法就是利用抗体库技术进行鼠抗体人源化的又一种方法[17]。将鼠抗体的轻链或重链文库与人抗体的重链或轻链文库配对,构建成 人-鼠杂合抗体库 ,筛选与抗原结合的克隆,分离获得人抗体的重链或轻链基因。再将它们与人的轻链或重链文库混合,用抗原筛选,就能得到与抗原结合的特异性人抗体。为了获得高亲和力的抗体,往往需要大容量抗体库。噬菌体抗体库需要通过生物体转化。受转化效率的影响,一般库容不大。而核糖体展示技术不需要通过体内转化。因此,构建的抗体库库容可达1011~1013,从中可筛选高亲和力抗体[18 19]。随着分子生物学、结构生物学、生物信息学和计算机技术的发展,抗体人源化的方法层出不穷。

目前人源抗体的制备主要有4种技术:EB病毒转化人B淋巴细胞、人 人杂交瘤技术、抗体

246

沈倍奋.治疗性抗体的改造