浙江大学生物化学丙实验报告3、4

实验报告

课程名称： 生物化学实验（丙） 指导老师： 方祥年 成绩：__________________ 实验名称： 蔗糖酶蛋白含量的测定、蔗糖酶活力测定及其分离纯化效果的评价

同组学生姓名： 金宇尊、鲍其琛、袁平、朱耀仁、蔡玉林 一、实验目的和要求（必填） 二、实验内容和原理（必填） 三、实验材料与试剂（必填） 四、实验器材与仪器（必填） 五、操作方法和实验步骤（必填） 六、实验数据记录和处理 七、实验结果与分析（必填） 八、讨论、心得

一、实验目的和要求

1、蔗糖酶蛋白含量的测定——Folin-酚法

①学习Folin-酚法测定蛋白质含量的原理和方法；

②掌握分光光度法制作标准曲线，准确测定未知样品的蛋白质含量； ③掌握分光光度计的使用方法。

2、蔗糖酶活力测定——3.5－二硝基水杨酸法 ①掌握酶活力测定的基本原理和方法； ②学习酶的比活力的计算。

二、实验内容和原理

1、Folin-酚测定法

Folin-酚试剂是由甲、乙两种试剂组成的。甲试剂由碳酸钠、氢氧化钠、硫酸铜和酒石酸钾钠组成，在碱性条件下蛋白质中的肽键与酒石酸钾钠铜盐起作用，生成紫红色络合物；乙试剂是由磷钼酸和磷钨酸、硫酸、溴等组成，在碱性条件下，铜-蛋白质络合物以及蛋白质中的酪氨酸残基（酚基）和色氨酸还原磷钼酸-磷钨酸试剂（乙试剂）产生深蓝色（钼蓝和钨蓝的混合物），其色泽深浅与蛋白质含量成正比。可用500nm 波长比色测定，适于测定蛋白质含量0.05～0.5g/L 。 优点： 简单、迅速、灵敏度高；反应较稳定。 缺点： 该反应受多种因素的干扰。 2、蔗糖酶活力测定

蔗糖酶（β-D-呋喃型果糖苷-果糖水解酶EC 3.2.1.26），是一种水解酶。它能催化非还原性双糖（蔗糖）的1,2－糖苷键裂解，将蔗糖水解为等量的葡萄糖和果糖（还原糖）。因此，每水解1mol 蔗糖，就能生成2mol 还原糖。还原糖的测定有多种方法，例如：纳尔逊－索模吉试剂比色法，斐林试剂法等。

本实验采用3.5－二硝基水杨酸法测定还原糖的含量，由此可得出蔗糖酶水解速度。其原理是3.5－二硝基水杨酸与还原糖共热被还原成棕红色的氨基化合物，在一定范围内还原糖的量和反应液的颜色深度成正比。因此可利用分光光度计在520nm进行比色测定，求得样品中的含糖量。此法操作简便、迅速、杂质干扰较小。

3、蔗糖酶活力单位(u)：

蔗糖酶在室温(25℃）, pH4.5的条件下，每分钟水解产生1μmol葡萄糖所需的酶量(ml)。

4、蔗糖酶比活力的计算：

酶的比活力——为每毫克蛋白质所具有的酶活力单位数，一般用酶活力单位/mg蛋白质表示。

酶的比活力在酶学研究中用来衡量酶的纯度，对于同一种酶来说，比活力越大，酶的纯度越高。利用比活力的大小可以用来比较酶制剂中单位质量蛋白质的催化能力，是表示酶的纯度高低的一个重要指标。

比活力＝活力单位/mg蛋白

三、实验材料与试剂

1、实验材料

蔗糖酶提取的各步分离纯化样品Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ。

2、实验试剂

①标准蛋白质溶液：0.5g/L牛血清白蛋白

②Folin-酚试剂（甲试剂；乙试剂）

③1g/L葡萄糖标准溶液(葡萄糖相对分子量180.16）；

④0.2mol/L乙酸缓冲液，pH4.5；

⑤5％蔗糖溶液；

⑥3,5－二硝基水杨酸试剂；

甲液：溶解6.9g 结晶酚于15.2ml 10％NaOH溶液中，并用水稀释至69ml,在此溶液中加6.9g亚硫酸氢钠。

乙液：称取255克酒石酸钾钠加到300ml 10%NaOH溶液中，再加入800ml 1%3,5-二硝基水杨酸溶液.

甲,乙二溶液相混合即得黄色试剂,贮于棕色瓶中备用,在室温放置7-10天以后使用。

四、实验器材与仪器

1、蔗糖酶蛋白含量的测定——Folin-酚法

①试管、试管架以及离心管（7ml）、离心管架；

②移液管（1ml、2ml、5ml）；

③微量移液枪（200μl,1000μl）及枪头;

④可见光分光光度计及1cm玻璃比色皿；

⑤恒温水浴箱(25℃）。

2、蔗糖酶活力测定——3.5－二硝基水杨酸法

①试管、试管架以及离心管（7ml)和离心管架；

②移液管（1ml、2ml、10ml)；

③微量移液枪（200μl,1000μl）及枪头;

④恒温水浴（25℃、100℃）；

⑤可见光分光光度计、1cm玻璃比色皿；

五、操作方法和实验步骤

1、蔗糖酶蛋白含量的测定——Folin-酚法

①制备Folin-酚法蛋白质标准曲线

取6支试管，编号1－6，按表1顺序依次加入各种试剂，并在分光光度计于500nm处测定光吸收值（A500nm值）。

②各步分离纯化的蔗糖酶蛋白测定

由于蔗糖酶提取、分离纯化的各个样品的蔗糖酶蛋白质含量较高，因此在测蔗糖酶提取分离纯化样品Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ的蔗糖酶蛋白质含量以前，可根据各样品溶液的蔗糖酶蛋白质含量高低不同作适当的稀释，以测定蔗糖酶蛋白质含量,A500nm值在蛋白质含量标准曲线范围以内为宜。

取13支试管，编号1～13，按表2依次加入各种试剂，并在分光光度计于500nm处测定光吸收值（A500nm值）。

注：加入Folin-酚乙试剂后，要迅速混匀（加一管混匀一管），使还原反应产生在磷钼酸-磷钨酸试剂被破坏之前。

③绘制标准曲线并计算

⑴绘制标准曲线：

以光吸收值（A500nm）为纵坐标，标准蛋白质含量（mg/L）为横坐标，在坐标纸上绘制蛋白质标准曲线。

⑵计算：

蔗糖酶提取分离纯化的样品Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ稀释溶液的光吸收值（A500nm），根据蛋白质标准曲线得蔗糖酶蛋白含量，再进行样品Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ溶液的最终蔗糖酶蛋白含量的计算。

2、蔗糖酶活力测定——3.5－二硝基水杨酸法

①标准曲线的制作

按表3加操作，后以还原糖（mg数或μmol数）为横坐标，A520值为纵坐标，制作葡萄糖浓度－吸光值标准曲线。

②蔗糖酶的酶活力测定

按照表4加样，在520nm处测定吸光度。

六、实验数据记录和处理

表1

表2