双酶切
双酶切实验
双酶切概述双酶切反应(Double Digests)1、同步双酶切同步双酶切是一种省时省力的常用方法。
选择能让两种酶同时作用的最佳缓冲液是非常重要的一步。
NEB每一种酶都随酶提供相应的最佳NEBuffer，以保证100%的酶活性。
NEBuffer的组成及内切酶在不同缓冲液中的活性见《内切酶在不同缓冲液里的活性表》及每支酶的说明书。
能在最大程度上保证两种酶活性的缓冲液即可用于双酶切。
由于内切酶在非最佳缓冲液条件下的切割速率会减缓，因此使用时可根据每种酶在非最优缓冲液中的具体活性相应调整酶量和反应时间。
2、分步酶切如果找不到一种可以同时适合两种酶的缓冲液，就只能采用分步酶切。
分步酶切应从反应要求盐浓度低的酶开始，酶切完毕后再调整盐浓度直至满足第二种酶的要求，然后加入第二种酶完成双酶切反应。
3、使用配有特殊缓冲液的酶进行双酶切（图）使用配有特殊缓冲液的酶进行双酶切也不复杂。
在大多数情况下，采用标准缓冲液的酶也能在这些特殊缓冲液中进行酶切。
这保证了对缓冲液有特殊要求的酶也能良好工作。
由于内切酶在非最佳缓冲液中进行酶切反应时，反应速度会减缓，因此需要增加酶量或延长反应时间。
通过《内切酶在不同缓冲液里的活性表》可查看第二种酶在特殊缓冲液相应盐浓度下的作用活性。
双酶切建议缓冲液注：只要其中一种酶需要添加BSA，则应在双酶切反应体系中加入BSA。
BSA不会影响任何内切酶的活性。
注意将甘油的终浓度控制在10%以下，以避免出现星号活性，详见《星号活性》。
可通过增加反应体系的总体积的方法实现这一要求。
某些内切酶的组合不能采用同步双酶切法，只能采用分步法进行双酶切。
上表中这些组合以“se q”标注。
[编辑本段]双酶切的注意事项1、做转化的时候，进行酶连接反应时，注意保持低温状态，因为LIGASE酶很容易降解.为保险起见，一般连接3小时，16度。
2、对含有AMP-RESISTENCE的质粒铺板时，注意加AMP时的温度，温度过高，会使克隆株无法筛选出来.我的方法是培基高温消毒后放在烤箱里，烤箱一般温度为55-60度，然后做的时候拿出来，这样好掌握温度。
双酶切编辑
2连接反应
3注意事项
1简介编辑双酶切反应(Double Digests)
1、同步双酶切
同步双酶切是一种省时省力的常用方法。选择能让两种酶同时作用的最佳缓冲液是非常重要的一步。NEB每一种酶都随酶提供相应的最佳NEBuffer，以保证100%的酶活性。NEBuffer的组成及内切酶在不同缓冲液中的活性见《内切酶在不同缓冲液里的活性表》及每支酶的说明书。能在最大程度上保证两种酶活性的缓冲液即可用于双酶切。由于内切酶在非最佳缓冲液条件下的切割速率会减缓，因此使用时可根据每种酶在非最优缓冲液中的具体活性相应调整酶量和反应时间。
双酶切建议缓冲液
注：
只要其中一种酶需要添加BSA，则应在双酶切反应体系中加入BSA。BSA不会影响任何内切酶的活性。
注意将甘油的终浓度控制在10%以下，以避免出现星号活性，详见《星号活性》。可通过增加反应体系的总体积的方法实现这一要求。
某些内切酶的组合不能采用同步双酶切法，只能采用分步法进行双酶切。上表中这些组合以“seq”标注。
3、转化：
a、一般转化仅需要加入2μl加入至100μl正常的TOP10感受态细胞中，冰浴放置30分钟。
b、再在水浴中42℃热激一般90～120秒钟后，再在冰中放置3分钟。
c、加入800μl无抗生素培养基，37℃全温振荡摇床培养40分钟。
取100μl涂布平板。一般转化质粒不建议离心涂布（除非感受态效价特别低），
双酶切编辑
做转化的时候，进行酶连接反应时，注意保持低温状态，因为LIGASE酶很容易降解。为保险起见，一般连接3小时，16度；对含有AMP-RESISTENCE的质粒铺板时，注意加AMP时的温度，温度过高，会使克隆株无法筛选出来。我的方法是培基高温消毒后放在烤箱里，烤箱一般温度为55-60度，然后做的时候拿出来，这样好掌握温度。铺板前后注意用吹风机吹干；对照的设立：为验证双酶切是否成功。
双酶切实验原理
双酶切实验原理
双酶切实验是一种用于确定DNA序列的特定区域的酶切位点
的实验方法。
它基于两个限制性内切酶共同作用于DNA分子，产生不同的酶切位点的原理。
在双酶切实验中，首先选择两个具有不同的限制性内切酶，这两个酶分别具有不同的酶切位点序列。
然后，将待检测的
DNA样品与这两个限制性内切酶一起反应，使其在特定的条
件下与DNA发生切割。
由于每个限制性内切酶在特定的酶切位点周围识别并切割DNA，因此在双酶切实验中，如果DNA序列中同时存在这两
个酶切位点，那么DNA分子将在两个酶切位点处被切割成三
个部分。
如果DNA序列中只存在其中一个酶切位点，DNA分子将在该位点处被切割成两个部分。
如果DNA序列中不存在
这两个酶切位点，DNA分子将不被切割。
实验结束后，通过电泳将不同长度的DNA片段分离出来，并
通过染色或荧光等方法可视化这些DNA片段。
通过观察
DNA片段的迁移距离和相对大小，可以确定DNA序列的特定区域是否存在以上述的两个酶切位点。
从而对DNA序列进行
分析和确认。
值得注意的是，双酶切实验的成功与否取决于待检测的DNA
序列中是否存在与所选择的限制性内切酶的酶切位点匹配的序列。
如果DNA序列中不存在所选酶切位点，DNA将不会被切割，从而无法进行相关分析和确认。
因此，在进行双酶切实验
之前，需要进行相关的DNA序列分析和预测，以确定所选酶切位点是否适用于目标DNA序列的研究。
《双酶切及连接》课件
• 双酶切技术简介 • 双酶切的实验步骤 • 双酶切的应用 • 双酶切的注意事项 • 双酶切技术的发展趋势
01
双酶切技术简介
酶切技术的定义
01
02
03
酶切技术定义
酶切技术是一种利用酶的 专一性对特定底物进行切 割的生物技术。
酶的专一性
酶只对特定的底物起作用 ，切割位点具有高度专一 性。
双酶切技术的改进与创新
新型限制性核酸内切酶的 开发
随着生物技术的不断发展，新型限制性核酸 内切酶不断涌现，为双酶切技术提供更多选 择和灵活性。
自动化双酶切系统的研发
通过自动化技术实现双酶切的快速、高效和 标准化操作，提高实验效率并减少人为误差
。
双酶切技术的发展前景
01
双酶切技术在基因克隆和基因治 疗等领域的应用前景广阔，未来 将继续发挥重要作用。
05
双酶切技术的发展趋势
双酶切与其他技术的结合
双酶切与PCR技术的结合
通过双酶切技术将目的基因和载体进行酶切，再利用PCR技术进行扩增和鉴定，提高基 因克隆的效率和准确性。
双酶切与基因编辑技术的结合
将双酶切技术与CRISPR-Cas9等基因编辑技术结合，实现对特定基因的敲除、敲入和 定点突变等操作，为基因功能研究和基因治疗提供有力工具。
02
随着生物技术的不断进步，双酶 切技术将与其他技术不断融合创 新，为生命科学研究提供更多有 力工具。
THANKS
感谢观看
酶切技术的分类
单酶切技术
使用一种限制性内切核酸酶对 DNA进行切割。
双酶切技术
使用两种不同的限制性内切核酸酶 对DNA进行切割，通常用于产生 具有不同黏性末端的DNA片段， 便于后续的连接反应。
双酶切的作用
双酶切（Double digestion）是在分子生物学实验中使用两种限制性内切酶（restriction enzyme）同时切割DNA分子的方法。
限制性内切酶是一类能够识别特定DNA序列并在该序列上切割DNA的酶。
双酶切的作用主要有以下几个方面：
DNA片段的定位：通过使用两种限制性内切酶，可以在DNA分子上产生多个切割位点，从而将DNA分子切割成多个特定长度的片段。
这些片段的长度和位置是事先设计和选择的，可以用于定位和标记DNA序列的特定区域。
DNA重组：双酶切可以产生具有相同切割位点的DNA片段，这些片段可以通过DNA重组技术进行连接。
通过将两个不同DNA分子的相应片段切割并重组，可以构建新的DNA分子，例如重组蛋白表达载体、构建基因库等。
片段分析：通过使用两种限制性内切酶切割DNA，可以产生特定长度的DNA片段。
这些片段可以通过电泳等方法进行分离和分析，以研究DNA序列、基因的结构和功能等。
DNA克隆：在分子克隆中，双酶切可以用于将目标DNA片段插入到载体DNA分子中。
通过选择合适的限制性内切酶，可以在载体DNA和目标DNA的特定位置上切割，然后使用连接酶将它们连接起来，形成重组DNA分子。
双酶切在分子生物学研究和基因工程中起着重要作用，它可以用于定位和标记DNA序列、进行DNA重组、分析DNA片段和实现DNA克隆等应用。
实验报告双酶切实验目的(3篇)
第1篇一、实验目的1. 学习双酶切法获取目的基因片段的原理和方法。
2. 掌握DNA琼脂糖凝胶电泳的原理和方法。
3. 熟悉核酸琼脂糖胶回收的原理和方法。
4. 熟练操作限制性核酸内切酶、DNA连接酶等分子生物学实验技术。
5. 培养实验操作规范，提高实验技能。
二、实验原理1. 双酶切法：利用两种限制性核酸内切酶分别识别并切割目的基因片段和载体质粒，产生黏性末端或平末端，以便于连接。
2. DNA琼脂糖凝胶电泳：通过琼脂糖凝胶电泳分离不同分子量的DNA片段，便于观察和分析目的基因片段。
3. 核酸琼脂糖胶回收：利用琼脂糖凝胶电泳分离的DNA片段，通过酶解、溶解、纯化等步骤获得高纯度的目的基因片段。
三、实验器材1. 仪器：DNA电泳仪、凝胶成像系统、紫外分光光度计、PCR仪、移液器、微量离心机、恒温培养箱、电热恒温器等。
2. 试剂：限制性核酸内切酶、DNA连接酶、T4 DNA连接酶、DNA标记物、琼脂糖、DNA模板、DNA载体、DNA标记染料、缓冲液、DNA提取试剂盒等。
四、实验步骤1. 提取DNA模板：按照DNA提取试剂盒说明书提取目的基因片段和载体质粒的DNA。
2. 设计酶切反应体系：根据限制性核酸内切酶的识别序列，设计酶切反应体系，包括限制性核酸内切酶、DNA模板、缓冲液、DNA标记物等。
3. 酶切反应：将酶切反应体系放入恒温培养箱中，在适宜的温度下进行酶切反应。
4. 酶切产物鉴定：通过琼脂糖凝胶电泳分离酶切产物，观察DNA条带，鉴定酶切是否成功。
5. DNA连接：将酶切后的目的基因片段和载体质粒进行连接反应，连接条件按照DNA连接酶说明书进行。
6. 连接产物鉴定：通过琼脂糖凝胶电泳分离连接产物，观察DNA条带，鉴定连接是否成功。
7. 核酸琼脂糖胶回收：将连接产物进行琼脂糖凝胶电泳分离，回收目的基因片段。
8. 目的基因片段纯化：利用核酸琼脂糖胶回收试剂盒对回收的目的基因片段进行纯化。
9. 纯化产物鉴定：通过琼脂糖凝胶电泳分离纯化产物，观察DNA条带，鉴定纯化是否成功。
质粒的双酶切
如EcoRI的识别顺序为：
5’…… G’AA|TTC ……3’
3’…… C T T|AA’G …...5’
|表示中心对称轴，从两侧“读”核苷酸顺序都是GAATTC或CTTAAG，这就是 回文顺序。 ‘表示在双链上交错切割的位置，切割后生成两个DNA片段，各 有一个单链末端，两条单链是互补的，其断裂的磷酸二酯键以及氢键可通过 DNA连接酶的作用而“粘合”
• 限制性内切酶是体外剪切基因片段的重要工具，常常与核酸聚合酶、 连接酶以及末端修饰酶等一起称为工具酶
• 限制性内切酶按限制酶的组成、与修饰酶活性关系以及切断核酸的情 况不同，分为三类：Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型
➢ Ⅰ型限制性内切酶能识别专一的核苷酸顺序，并在识别点附近的一些核苷酸上 切割DNA分子中的双链，但是切割的核苷酸顺序没有专一性，是随机的。这类 限制性内切酶在DNA重组技术或基因工程中用处不大，无法用于分析DNA结 构或克隆基因。这类酶如EcoB、EcoK等
E5’c…oR…ⅠG酶’A（A切T|TaTK割CaR…a后公…司3形’） 成两种片段，片段末端同样可以通过DNA连接酶连接起来 1Ⅱ0×型H限B制➢u性ffe内rⅢ切型酶能限识别制专一性的内核苷切酸顺酶序也，并有在该专顺序一内的的固识定位别置顺上切序割双，链。但不是对称的回文顺序，在 3’…… CTA’|识TAG别……顺5’序旁边几个核苷酸对的固定位置上切割双链。但这几个核苷酸 由这于类这 酶类如限Ec制o对B性、内不Ec切oK是酶等的特识别异和切性割的的核。苷酸因都是此专一，的这。 种限制性内切酶切割后产生的一定长度 这但类这限 几制个性核内苷D切酸N酶对A在不片是DN特A段异重性组，的技具。术或有基因各工种程中单用处链不末大，端无法。用因于分此析D不NA能结构应或用克隆于基因基。因克隆
双酶切连接反应的注意要点
双酶切连接反应的注意要点双酶切：1、在双酶切载体时如果2个酶切位点靠得很近，必须注意酶切顺序。
因为有的限制性内切酶要求其识别序列的两端至少保留有若干个碱基才能保证酶的有效切割。
有的酶要求识别序列两端有多个碱基的，则必须先切，否则就可能造成酶切失败。
2、回收PCR产物：回收的PCR产物片段=1：10，一般取前者0.03pmol，后者取0.3pmol。
pmol为单位的DNA转换为为?g单位的DNA：（X pmoles×长度bp×650）/ 1,000,000 （注：长度bp×650是该双链DNA的分子量）所得数值即为?g,也可以直接用这个公式套.1pmol 1000bp DNA=0.66μg,如载体是5380bp，则0.03pmol为0.03×5.38×0.66=0.106524?g。
3、双酶切时间及其体系：需要强调的是很多人建议酶切过夜，其实完全没有必要，一般酶切3个小时，对于PCR产物，可以过夜酶切，效果会很好。
酶切体系不宜过大，会影响质粒和酶的碰撞机会，效果降低；质粒量不应该超过酶切要求的最大量，否则酶切不完全，酶的用量控制在1U酶在15-20ul体系中酶解1ugDNA。
4、两种酶切的条件不同时，分别进行两次酶切，切完一个纯化后再切：温度要求不同，先酶切低温要求的，再酶切高温要求的；若盐浓度要求不同，先酶切低盐浓度要求的，再酶切高盐浓度要求的。
5、若质粒是在TE中保存的，TE 中的EDTA可能与酶的激活因子螯合，影响酶切效果，可放大酶切体积或重新浓缩质粒。
6、限制酶的选择非常重要，尽量选择粘端酶切和那些酶切效率高的限制酶，提前看好各公司的双切酶所用公用的BUFFER，以及各酶在公用BUFFER里的效率。
选好酶切位点后，在各个酶的两边加上保护碱基。
7、纯化问题：纯化PCR产物割胶还是柱式，推荐柱式，因为割胶手法不准，很容易割下大块的胶，影响纯化效率。
双酶切连接反应
双酶切连接反应1、回收PCR产物：在进行PCR扩增时候，给引物两端设计好酶切位点，一般说来，限制酶的选择非常重要，尽量选择粘端酶切和那些酶切效率高的限制酶，如BamHI,HindIII,提前看好各公司的双切酶所用公用的BUFFER，以及各酶在公用BUFFER里的效率。
选好酶切位点后，在各个酶的两边加上保护碱基。
双酶切时间及其体系：需要强调的是很多人建议酶切过夜，其实完全没有必要，我一般酶切3个小时，其实1个小时已经足够。
应用大体系，如100微升。
纯化问题：纯化PCR产物割胶还是柱式，我推荐柱式，因为割胶手法不准，很容易割下大块的胶，影响纯化效率。
现在的柱式纯化号称可以祛除引物，既然如此，酶切掉的几个碱基肯定也会被纯化掉了。
所以，PCR产物和双酶切产物的纯化均可应用柱式纯化。
我用的是TAKARA的纯化柱试剂盒酶量的问题：以TAKARA的为例，其对1单位酶的定义如下：在50 μl 反应液中，30℃温度下反应1小时，将1 μg 的λDNA完全分解的酶量定义为1个活性单位(U)。
而该酶浓度约为15单位/微升，在除外酶降解的因素外，该酶可分解15μg的DNA，而一般从1-4ml菌液提出的 DNA约为3μg，而PCR纯化后的产物（50体系）约为3μg，所以即便全部加进去，只要纯化的质量好，酶切完全切得动。
2、酶切、回收后的PCR产物与载体的连接摩尔比的计算，很多人凭经验也可以。
但对于初学者从头认真计算则非常有必要。
回收的载体片段：回收的PCR产物片段=1：10 ，一般取前者0.03pmol，后者取0.3pmol。
pmol为单位的DNA转换为为μg单位的DNA：（X pmoles×长度bp×650）/ 1,000,000 （注：长度bp ×650是该双链DNA的分子量）所得数值即为μg,也可以直接用这个公式套.1pmol 1000bp DNA=0.66μg,如载体是5380bp，则0.03pmol为0.03×5.38×0.66=0.106524μg。
质粒双酶切后成功的标志
质粒双酶切后成功的标志
质粒双酶切后成功的标志是一项重要的实验步骤，该步骤会确保质粒酶切效果良好，有助于后续的基因工程操作。
下面将详细介绍质粒双酶切成功的标志。
1.凝胶电泳分析
最常用的检测质粒双酶切成功的方法是凝胶电泳分析。
通过电泳分离DNA，可以确定DNA的长度和完整性。
在凝胶电泳中，如果双酶切割作用有效，DNA会被切成两个或多个不同大小的碎片，这些碎片会在凝胶中形成不同的带状图案。
如果没有发生双酶切割，DNA将完整地保留，形成一个单独的带状图案。
2.碱基序列分析
双酶切后的DNA片段可以被进一步分离并测序，以确保正确的酶切位点。
这被称为限制性片段长度多态性（RFLP）分析。
通过与参考序列进行比较，可以确定酶切了哪些位点，并确认是否达到了预期的酶切效果。
这种方法通常在基因工程实验中使用，以确保重组质粒和转导体的正确性。
3.荧光素酶标记
质粒DNA上添加荧光素酶标记可以直接检测双酶切效果。
荧光素酶标记是一种绿色荧光蛋白，能够很容易地与DNA结合。
通过观察荧光素酶标记的荧光强度和分布，可以判断DNA是否成功双酶切割。
4.质粒测序
质粒测序是一种非常精确的检测方法。
通过使用测序仪器测量质粒双酶切后片段的每个碱基，可以确保酶切效果正确。
这种方法通常在对基因序列进行研究时使用，以确定基因在双酶切后发生的变化。
总之，质粒双酶切后成功的标志是可以通过精确的实验方法来检测，如凝胶电泳分析、碱基序列分析、荧光素酶标记和质粒测序。
这些方法可以帮助科学家确保质粒DNA的完整性和正确性，从而保证后续的基因工程操作的精确性和有效性。
双酶切
做转化的时候，进行酶连接反应时，注意保持低温状态，因为LIGASE酶很容易降解.为保险起见，一般连接3小时，16度；对含有AMP-RESISTENCE的质粒铺板时，注意加AMP时的温度，温度过高，会使克隆株无法筛选出来.我的方法是培基高温消毒后放在烤箱里，烤箱一般温度为55-60度，然后做的时候拿出来，这样好掌握温度。
铺板前后注意用吹风机吹干；对照的设立：为验证双酶切是否成功。
1、同步双酶切同步双酶切是一种省时省力的常用方法。
选择能让两种酶同时作用的最佳缓冲液是非常重要的一步。
NEB每一种酶都随酶提供相应的最佳NEBuffer，以保证100%的酶活性。
NEBuffer的组成及内切酶在不同缓冲液中的活性见《内切酶在不同缓冲液里的活性表》及每支酶的说明书。
能在最大程度上保证两种酶活性的缓冲液即可用于双酶切。
由于内切酶在非最佳缓冲液条件下的切割速率会减缓，因此使用时可根据每种酶在非最优缓冲液中的具体活性相应调整酶量和反应时间。
2、分步酶切如果找不到一种可以同时适合两种酶的缓冲液，就只能采用分步酶切。
分步酶切应从反应要求盐浓度低的酶开始，酶切完毕后再调整盐浓度直至满足第二种酶的要求，然后加入第二种酶完成双酶切反应。
3、使用配有特殊缓冲液的酶进行双酶切如图使用配有特殊缓冲液的酶进行双酶切也不复杂。
在大多数情况下，采用标准缓冲液的酶也能在这些特殊缓冲液中进行酶切。
这保证了对缓冲液有特殊要求的酶也能良好工作。
由于内切酶在非最佳缓冲液中进行酶切反应时，反应速度会减缓，因此需要增加酶量或延长反应时间。
通过《内切酶在不同缓冲液里的活性表》可查看第二种酶在特殊缓冲液相应盐浓度下的作用活性。
双酶切建议缓冲液注：只要其中一种酶需要添加BSA，则应在双酶切反应体系中加入BSA。
BSA 不会影响任何内切酶的活性。
注意将甘油的终浓度控制在10%以下，以避免出现星号活性，详见《星号活性》。
可通过增加反应体系的总体积的方法实现这一要求。
双酶切连接
前一阵子一直在做双酶切质粒重组，失败了很多次，不过很快改善了实验方法，用2周重组了 14个质粒。
现就自己的体会，谈一下质粒重组的一些个人经验。
1、回收PCR产物：在进行PCR扩增时候，给引物两端设计好酶切位点，一般说来，限制酶的选择非常重要，尽量选择粘端酶切和那些酶切效率高的限制酶，如BamHI,HindIII,提前看好各公司的双切酶所用公用的BUFFER，以及各酶在公用BUFFER里的效率。
选好酶切位点后，在各个酶的两边加上保护碱基。
双酶切时间及其体系：需要强调的是很多人建议酶切过夜，其实完全没有必要，我一般酶切3个小时，其实1个小时已经足够。
应用大体系，如100微升。
2.纯化问题：纯化PCR产物割胶还是柱式，我推荐柱式，因为割胶手法不准，很容易割下大块的胶，影响纯化效率。
现在的柱式纯化号称可以祛除引物，既然如此，酶切掉的几个碱基肯定也会被纯化掉了。
所以，PCR产物和双酶切产物的纯化均可应用柱式纯化。
我用的是TAKARA的纯化柱试剂盒3.酶量的问题：以TAKARA的为例，其对1单位酶的定义如下：在50 μl 反应液中，30℃温度下反应1小时，将1 μg 的λDNA完全分解的酶量定义为1个活性单位(U)。
而该酶浓度约为15单位/微升，在除外酶降解的因素外，该酶可分解15μg的DNA，而一般从1-4ml菌液提出的 DNA约为3μg，而PCR纯化后的产物（50体系）约为3μg，所以即便全部加进去，只要纯化的质量好，酶切完全切得动。
4.酶切、回收后的PCR产物与载体的连接:摩尔比的计算，很多人凭经验也可以。
但对于初学者从头认真计算则非常有必要。
回收的载体片段：回收的PCR产物片段=1：10 ，一般取前者0.03pmol，后者取0.3pmol。
pmol为单位的DNA转换为为µg单位的DNA：（X pmoles×长度bp×650）/ 1,000,000 （注：长度bp×650是该双链DNA的分子量）所得数值即为µg,也可以直接用这个公式套.1pmol 1000bp DNA=0.66μg,如载体是5380bp，则0.03pmol为0.03×5.38×0.66=0.106524µg。
双酶切连接反应
【原创】双酶切连接反应之全攻略（原创）双酶切连接反应之全攻略前一阵子一直在做双酶切质粒重组，失败了很多次，不过很快改善了实验方法，用2周重组了 14个质粒。
现就自己的体会，结合战友的宝贵经验，谈一下质粒重组的一些个人经验。
1、回收PCR产物：在进行PCR扩增时候，给引物两端设计好酶切位点，一般说来，限制酶的选择非常重要，尽量选择粘端酶切和那些酶切效率高的限制酶，如BamHI,HindIII,提前看好各公司的双切酶所用公用的BUFFER，以及各酶在公用BUFFER里的效率。
选好酶切位点后，在各个酶的两边加上保护碱基，其原则可参照：/upload/2006/08/13/31219184.pdf。
双酶切时间及其体系：需要强调的是很多人建议酶切过夜，其实完全没有必要，我一般酶切3个小时，其实1个小时已经足够。
应用大体系，如100微升。
纯化问题：纯化PCR产物割胶还是柱式，我推荐柱式，因为割胶手法不准，很容易割下大块的胶，影响纯化效率。
现在的柱式纯化号称可以祛除引物，既然如此，酶切掉的几个碱基肯定也会被纯化掉了。
所以，PCR产物和双酶切产物的纯化均可应用柱式纯化。
我用的是TAKARA的纯化柱试剂盒酶量的问题：以TAKARA的为例，其对1单位酶的定义如下：在50 μl 反应液中，30℃温度下反应1小时，将1 μg 的λDNA 完全分解的酶量定义为1个活性单位(U)。
而该酶浓度约为15单位/微升，在除外酶降解的因素外，该酶可分解15μg的DNA，而一般从1-4ml菌液提出的 DNA约为3μg，而PCR纯化后的产物（50体系）约为3μg，所以即便全部加进去，只要纯化的质量好，酶切完全切得动。
2、酶切、回收后的PCR产物与载体的连接摩尔比的计算，很多人凭经验也可以。
但对于初学者从头认真计算则非常有必要。
回收的载体片段：回收的PCR产物片段=1：10 ，一般取前者0.03pmol，后者取0.3pmol。
pmol为单位的DNA转换为为µg单位的DNA：（X pmoles×长度bp×650）/ 1,000,000 （注：长度bp×650是该双链DNA的分子量）所得数值即为µg,也可以直接用这个公式套.1pmol 1000bp DNA=0.66μg,如载体是5380bp，则0.03pmol为0.03×5.38×0.66=0.106524µg。
双酶切实验原理
双酶切实验原理双酶切实验是一种常用的分子生物学技术，用于分析DNA序列。
它基于限制性内切酶的特异性切割DNA的原理，结合凝胶电泳技术，可以对DNA进行特异性切割和分离，从而获得所需的DNA片段。
本文将介绍双酶切实验的原理及其操作步骤。
1.双酶切实验原理。
双酶切实验的原理基于限制性内切酶对DNA的特异性切割。
限制性内切酶是一类能够识别DNA特定序列并在该序列上切割的酶，它们能够将DNA分子切割成具有特定序列的片段。
在双酶切实验中，通常会使用两种不同的限制性内切酶，它们分别识别DNA的不同序列，并在这些序列上进行切割。
通过这种双酶切割的方式，可以获得具有特定序列的DNA片段。
2.双酶切实验操作步骤。
双酶切实验的操作步骤主要包括DNA提取、酶切反应、凝胶电泳和DNA可视化等步骤。
首先，需要从样品中提取DNA。
提取的DNA可以是来自细菌、动植物或其他生物体的基因组DNA，也可以是从质粒或病毒中提取的DNA。
提取的DNA需要经过纯化和定量后，才能进行后续的操作。
接下来，将提取的DNA与两种限制性内切酶和相应的缓冲液混合，进行酶切反应。
酶切反应的条件需要根据所使用的酶的特性来确定，包括反应温度、反应时间和反应缓冲液的配制等。
酶切反应完成后，需要对反应产物进行电泳分离。
在凝胶电泳中，将酶切反应产物加载到琼脂糖凝胶上，通电进行分离。
由于DNA分子在电场中具有不同的迁移速度，可以根据DNA片段的大小进行分离和检测。
分离完成后，可以通过染色或荧光标记等方法对DNA进行可视化。
3.双酶切实验的应用。
双酶切实验在分子生物学研究中有着广泛的应用。
它可以用于分析DNA序列的特异性，鉴定基因型、进行基因工程、构建基因库等。
通过双酶切实验，可以获得特定序列的DNA片段，为后续的克隆、测序和分析提供了重要的基础。
总的来说，双酶切实验是一种重要的分子生物学技术，它基于限制性内切酶的特异性切割原理，能够对DNA进行特异性切割和分离。
双酶切连接反应
双酶切连接反应1、回收PCR产物：在进行PCR扩增时候，给引物两端设计好酶切位点，一般说来，限制酶的选择非常重要，尽量选择粘端酶切和那些酶切效率高的限制酶，如BamHI,HindIII,提前看好各公司的双切酶所用公用的BUFFER，以及各酶在公用BUFFER里的效率。
选好酶切位点后，在各个酶的两边加上保护碱基。
双酶切时间及其体系：需要强调的是很多人建议酶切过夜，其实完全没有必要，我一般酶切3个小时，其实1个小时已经足够。
应用大体系，如100微升。
纯化问题：纯化PCR产物割胶还是柱式，我推荐柱式，因为割胶手法不准，很容易割下大块的胶，影响纯化效率。
现在的柱式纯化号称可以祛除引物，既然如此，酶切掉的几个碱基肯定也会被纯化掉了。
所以，PCR产物和双酶切产物的纯化均可应用柱式纯化。
我用的是TAKARA的纯化柱试剂盒酶量的问题：以TAKARA的为例，其对1单位酶的定义如下：在50 μl 反应液中，30℃温度下反应1小时，将1 μg 的λDNA完全分解的酶量定义为1个活性单位(U)。
而该酶浓度约为15单位/微升，在除外酶降解的因素外，该酶可分解15μg的DNA，而一般从1-4ml菌液提出的 DNA约为3μg，而PCR纯化后的产物（50体系）约为3μg，所以即便全部加进去，只要纯化的质量好，酶切完全切得动。
2、酶切、回收后的PCR产物与载体的连接摩尔比的计算，很多人凭经验也可以。
但对于初学者从头认真计算则非常有必要。
回收的载体片段：回收的PCR产物片段=1：10 ，一般取前者0.03pmol，后者取0.3pmol。
pmol为单位的DNA转换为为μg单位的DNA：（X pmoles×长度bp×650）/ 1,000,000 （注：长度bp ×650是该双链DNA的分子量）所得数值即为μg,也可以直接用这个公式套.1pmol 1000bp DNA=0.66μg,如载体是5380bp，则0.03pmol为0.03×5.38×0.66=0.106524μg。
基因工程中的单酶切与双酶切
基因工程中的单酶切与双酶切嘿，同学们！今天咱们来好好聊聊基因工程中的单酶切与双酶切这个超有意思的话题呀！单酶切呢，就好比是一把钥匙开一把锁。
你看哈，一种特定的限制性内切酶，它就专门识别和切割特定的 DNA 序列，就像钥匙只能开对应的那把锁一样。
比如说，我们有一段 DNA 序列，用特定的单酶切后，就会在那个特定的位置断开。
这在基因工程中可是很常用的手段呢！比如在构建重组DNA 分子的时候，我们可以用单酶切来处理载体和目的基因，然后把它们连接起来。
再来说说双酶切，这可就更有意思啦！它就像是有两把不同的钥匙同时去开两道不同的锁。
通过使用两种不同的限制性内切酶对 DNA 进行切割。
这有啥好处呢？哎呀呀，好处可多啦！这样可以更精确地控制 DNA 片段的大小和方向呀！举个例子吧，假如我们要把一个基因准确地插入到载体的特定位置，单靠单酶切可能会出现一些不确定性，但是用双酶切就能大大提高准确性呢！就像你要把一个拼图准确地放到它该在的位置，双酶切就是帮你更好地完成这个任务的工具哟！你们想想看，如果我们只有单酶切，那可能会出现一些混乱，就像你只有一把钥匙，有时候可能会开错锁呀！但有了双酶切，就好像多了一层保障，更靠谱了不是吗？而且呀，在实际的实验操作中，我们得根据具体的需求来选择是用单酶切还是双酶切呢。
这就跟你出门选择穿哪双鞋子一样，得看场合和目的呀！“哇，原来单酶切和双酶切这么神奇呀！”小明惊讶地说。
“可不是嘛！”我笑着回答，“基因工程就是这么充满魅力呀！”“那是不是双酶切就一定比单酶切好呢？”小红提出疑问。
“哈哈，这可不一定哦！”我解释道，“有时候单酶切就足够满足需求了，而且操作还相对简单些呢。
但有些复杂的情况，双酶切就显示出它的优势啦！所以没有绝对的好坏，要根据具体情况来判断呢。
”同学们，这下你们对基因工程中的单酶切与双酶切有更清楚的认识了吧？希望你们以后在遇到相关问题的时候，能像个小专家一样分析和解决哟！。
质粒的双酶切.正式版PPT文档
Ⅲ型限制性内切酶也有专一的识别顺序，但不是对称的回文顺序，在识别顺序旁边几个核苷酸对的固定位置上切割双链。
3’…… C T T|AA’G ….
• 影响限制性内切酶活性的因素有哪些？ 这种酶识别的专一核苷酸顺序最常见的是4个或6个核苷酸，少数也有识别5个核苷酸以及7个、8个、9个、10个和11个核苷酸的。
质粒的双酶切
二、实验原理
• 限制性内切酶是一类能识别双链DNA分子特异性核酸序列的DNA水 解酶。每一种内切酶能识别DNA分子中由4～6个核苷酸组成的特定序 列
• 多种细菌能合成限制性内切酶，这是它们保护自己，降解外来DNA分 子的重要手段。细菌细胞内的DNA由于相应序列上的A或C碱基的甲 基化而不被限制性内切酶攻击，而外源DNA一旦进入细胞则立即被识 别，双股DNA螺旋都被切断，这种现象被称为寄主控制的限制与修饰 现象
限制性内切酶是体外剪切基因片段的重要工具，常常与核酸聚合酶、连接酶以及末端修饰酶等一起称为工具酶
识反别应序 条列件• 和：切温D割度N位3A7点℃的：，纯酶切度1. 如EcoR•I的识D别N顺A序的为：甲基化程度
• 酶切消化反应的温度 • DNA的分子结构 • 溶液中离子浓度及种类 • 缓冲液的pH值
四、实验步骤
• 质粒DNA的双酶切 ➢ 反应体系：
EcoRⅠ XhoⅠ 10×H Buffer 质粒DNA 无菌水 总体积
1μL 1μL 2μL 10μL～12μL≤1μg 6μL ～ 4μL 20μL（无菌水补至总体积）
➢ 反应条件：温度37℃，酶切1.5h • 琼脂糖凝胶电泳检测酶切结果 • 紫外线投射仪观察结果 • UVP凝胶成像系统记录结果（电泳图）
限制性内切酶是体外剪切基因片段的重要工具，常常与核酸聚合酶、连接酶以及末端修饰酶等一起称为工具酶
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【原创】双酶切连接反应之全攻略（原创）双酶切连接反应之全攻略前一阵子一直在做双酶切质粒重组，失败了很多次，不过很快改善了实验方法，用2周重组了 14个质粒。
现就自己的体会，结合战友的宝贵经验，谈一下质粒重组的一些个人经验。
1、回收PCR产物：在进行PCR扩增时候，给引物两端设计好酶切位点，一般说来，限制酶的选择非常重要，尽量选择粘端酶切和那些酶切效率高的限制酶，如BamHI,HindIII,提前看好各公司的双切酶所用公用的BUFFER，以及各酶在公用BUFFER里的效率。
选好酶切位点后，在各个酶的两边加上保护碱基，其原则可参照：/upload/2006/08/13/31219184.pdf。
双酶切时间及其体系：需要强调的是很多人建议酶切过夜，其实完全没有必要，我一般酶切3个小时，其实1个小时已经足够。
应用大体系，如100微升。
纯化问题：纯化PCR产物割胶还是柱式，我推荐柱式，因为割胶手法不准，很容易割下大块的胶，影响纯化效率。
现在的柱式纯化号称可以祛除引物，既然如此，酶切掉的几个碱基肯定也会被纯化掉了。
所以，PCR产物和双酶切产物的纯化均可应用柱式纯化。
我用的是TAKARA的纯化柱试剂盒酶量的问题：以TAKARA的为例，其对1单位酶的定义如下：在50 μl 反应液中，30℃温度下反应1小时，将1 μg 的λDNA完全分解的酶量定义为1个活性单位(U)。
而该酶浓度约为15单位/微升，在除外酶降解的因素外，该酶可分解15μg的DNA，而一般从1-4ml菌液提出的 DNA约为3μg，而PCR纯化后的产物（50体系）约为3μg，所以即便全部加进去，只要纯化的质量好，酶切完全切得动。
2、酶切、回收后的PCR产物与载体的连接摩尔比的计算，很多人凭经验也可以。
但对于初学者从头认真计算则非常有必要。
回收的载体片段：回收的PCR产物片段=1：10 ，一般取前者0.03pmol，后者取0.3pmol。
pmol为单位的DNA转换为为µg单位的DNA：（X pmoles×长度bp×650）/ 1,000,000 （注：长度bp×650是该双链DNA的分子量）所得数值即为µg,也可以直接用这个公式套.1pmol 1000bp DNA=0.66μg,如载体是5380bp，则0.03pmol为0.03×5.38×0.66=0.106524µg。
测DNA浓度可以在专用机子上测，注意OD值，一般约1.8-2.0.另外，如果嫌麻烦，也可用MARKER进行估测，如MARKER2000，5微升的 MARKER每个条带约50ng。
连接反应：TAKARA的连接酶上的说明写的过夜，而其对连接酶单位的定义为：在20 μl的连接反应体系中，6 μg的λDNA-Hind III的分解物在16℃下反应30分钟时，有90%以上的DNA片段被连接所需要的酶量定义为1个活性单位（U）。
而它的浓度为350 U/μl ，所以完全够用。
连接酶容易失活，注意低温操作，最好在冰上。
时间3个小时足已。
3、转化：a、全量（10 μl）加入至100 μl JM109感受态细胞中，冰中放置30分钟。
b、42℃加热45秒钟后，再在冰中放置1分钟。
c、加入890 μl AMP阴性培养基，37℃振荡培养60分钟。
取100μl铺板。
也可离心后余100μl几个非常重要的问题1 做转化的时候,进行酶连接反应时,注意保持低温状态,因为LIGASE酶很容易降解.为保险起见,一般连接3小时,16度.2 对含有AMP-RESISTENCE的质粒铺板时,注意加AMP时的温度,温度过高,会使克隆株无法筛选出来.我的方法是培基高温消毒后放在烤箱里，烤箱一般温度为55-60度，然后做的时候拿出来，这样好掌握温度。
铺板前后注意用吹风机吹干3对照的设立：为验证双酶切是否成功,可做如下对照:A 酶切反应时加各单酶分别切,两管,用同一种BUFFER,跑胶,看单切的两管是否成线性.如两管均成线性可初步判断双酶切成功.做转化时,也要进行对照.设4个:A.即拿双酶切的质粒产物也进行连接反应,这个对照可进一步看双酶切是否成功,如果长出克隆,说明很有可能只进行了单酶切,如没长出克隆,则证明双酶切成功,当然要保证感受态,培基,连接酶都'正常'的情况下.B.酶切过的未进行连接反应的双酶切产物,进行转化,这一步可以证明是否有残留的未被任何酶切的原始质粒C.设原始质粒为对照,意为检测整个操作过程中是否有误.D.AMP阴性板上用同一批感受态细胞铺板20微升足够,检测感受态状况.4.所有的试剂切记低温保存.一步一个脚印.不要偷懒,图省事最后却更费事.注意设立对照。
经PCR鉴定，克隆90%-100%的阳性率，所以在后面的挑克隆中，我只挑选4个就足够了。
然后双酶切鉴定，测序。
希望大家不断补充。
Ding一下，和我的方法差不多。
连接前最好将水、插入片段和载体混合好以后置于45度水浴5min，马上置于冰上冷却，再加入buffer和ligase。
springwel wrote:用2周重组了 14个质粒。
这个效率非常不错！佩服！smartkevin wrote:Ding一下，和我的方法差不多。
连接前最好将水、插入片段和载体混合好以后置于45度水浴5min，马上置于冰上冷却，再加入buffer和ligase。
这个操作是什么原理？为什么要选择45C？其实也不一定45度，估计50度也行，45度对于几个碱基结合（酶切位点）的打开绰绰有余。
分子克隆3的经典操作，个人认为主要目的如下：插入片段和载体在之前的操作过程中有部分粘性末端已经匹配，如果直接连接可能会有多重插入和多载体自连的情况，45度处理是其粘性末端打开。
由于片段与载体混合、预热后马上置于冰上，使得片段与载体最大限度匹配，从而提高连接效率。
springwel wrote:酶量的问题：以TAKARA的为例，其对1单位酶的定义如下：在50 μl 反应液中，30℃温度下反应1小时，将1 μg 的λDNA完全分解的酶量定义为1个活性单位(U)。
而该酶浓度约为15单位/微升，在除外酶降解的因素外，该酶可分解15μg的DNA，而一般从1-4ml菌液提出的 DNA约为3μg，而PCR纯化后的产物（50体系）约为3μg，所以即便全部加进去，只要纯化的质量好，酶切完全切得动。
[color=red]但是公司给推荐的一般都是2。
0ul体系加1ul，其实我有的时候为了省酶，在20ul只加0.5ul酶，切的也很好。
我不明白的是，我们一般的质粒载体是否象lamda DNA一样好切，如果是那样的话，100ul体系加1ul可能也够了，会省好多钱啊，尤其是有的酶，一支才10ul，按推荐量加，做两个100ul体系需要两管，不知道有人试过没有。
smartkevin wrote:其实也不一定45度，估计50度也行，45度对于几个碱基结合（酶切位点）的打开绰绰有余。
分子克隆3的经典操作，个人认为主要目的如下：插入片段和载体在之前的操作过程中有部分粘性末端已经匹配，如果直接连接可能会有多重插入和多载体自连的情况，45度处理是其粘性末端打开。
由于片段与载体混合、预热后马上置于冰上，使得片段与载体最大限度匹配，从而提高连接效率。
如果真的是这样我觉得对于非同源粘性末端和平末端作用不大，对于同源粘性末端可能有作用。
不知道还有没有其他的解释？我倒是没有仔细看过分子克隆。
mybbff wrote:如果真的是这样我觉得对于非同源粘性末端和平末端作用不大，对于同源粘性末端可能有作用。
不知道还有没有其他的解释？我倒是没有仔细看过分子克隆。
刚才查了一下分子克隆3，只说了一句“以消除重新复性而导致的末端相互聚合”（中文版p71）。
其实如果是粘性末端酶切的话都是有用的，无所谓非同源和同源末端，就算是非同源末端，载体和载体，片段和片段也能聚合。
对于平末端应该就没有什么作用了。
autumnsun wrote:但是公司给推荐的一般都是2。
0ul体系加1ul，其实我有的时候为了省酶，在20ul只加0.5ul酶，切的也很好。
我不明白的是，我们一般的质粒载体是否象lamda DNA一样好切，如果是那样的话，100ul体系加1ul可能也够了，会省好多钱啊，尤其是有的酶，一支才10ul，按推荐量加，做两个100ul体系需要两管，不知道有人试过没有。
如果100ul里的DNA太多了也不行啊，酶和DNA还是要匹配的我不明白的是，我们一般的质粒载体是否象lamda DNA一样好切，如果是那样的话，100ul体系加1ul可能也够了，会省好多钱啊，尤其是有的酶，一支才10ul，按推荐量加，做两个100ul体系需要两管，不知道有人试过没有。
其实除了考虑酶浓度（每微升多少个单位）以外，还应该考虑这种酶在lamda DNA上的酶切位点数目。
比如用HincII和XbaI双切pUC118，这两个酶在pUC118上都只有一个酶切位点，而在lamda DNA上的酶切位点分别是35个和1个。
根据酶活性的定义，相同单位的HincII和XbaI对pUC118的酶切效率是35比1，所以在双酶切体系中，所用的HincII显然应该要少很多。
好真实用“回收的载体片段：回收的PCR产物片段=1：10，一般取前者0.3pmol，后者取0.03pmol。
”是不是应该前者0.03，后者0.3啊？精华！投你一票！msher wrote:好真实用“回收的载体片段：回收的PCR产物片段=1：10 ，一般取前者0.3pmol，后者取0.03pmol。
”是不是应该前者0.03，后者0.3啊？已经改了,谢谢!昨天14个测序结果出来，全部是阳性克隆。
两边是载体的序列，中间是插入的目的片段。
回顾自己的实验现补充几点。
做转化时,也要进行对照.设4个:A.即拿双酶切的质粒产物也进行连接反应,这个对照可进一步看双酶切是否成功,如果长出克隆,说明很有可能只进行了单酶切,如没长出克隆,则证明双酶切成功,当然要保证感受态,培基,连接酶都'正常'的情况下.B.酶切过的未进行连接反应的双酶切产物,进行转化,这一步可以证明是否有残留的未被任何酶切的原始质粒C.设原始质粒为对照,意为检测整个操作过程中是否有误.D.AMP阴性板上用同一批感受态细胞铺板20微升足够,检测感受态状况.就上面的对照简要说一下我的结果。
转化后第二天可见14个标本的平皿上长了很多克隆，约100个左右，我用的是直径6cm的板子，所以仍显较多，（我是先挑半个克隆并标记好行PCR鉴定后再对另外的一半进行摇菌抽提质粒），较难挑克隆，所以铺皿时不用离心，直接用100微升的铺皿就可以了，我其中一个是这样做的，长得克隆较大，很好挑选。