动物实验设计

口服避孕药预防化疗对大鼠卵巢损伤的研究

研究背景

卵巢早衰(premature ovarian failure POF)系指妇女在40岁以前绝经，常表现为雌激素水平降低引起的月经紊乱、不孕、围绝经期综合征等一系列症状。POF病因复杂，目前仍不清楚，化疗远期毒副作用是其中之一。随着化学毒性药物在肿瘤及自身免疫疾病的广泛应用，其导致的性腺功能损害成为研究新热点，其中以环磷酰胺(cyclophosphamide，crx)为代表的烷化剂引起的卵巢功能损害研究较多，但其作用机制仍不清楚。一些研究显示，CTX可直接损伤卵巢颗粒细胞，并主要作用于有丝分裂活跃的卵泡，而静止的生殖细胞呈低度敏感。另有学者提出，化疗期间应用口服避孕药抑制卵泡发育，能够减少化疗对卵巢的损害，依据是化疗药物损伤卵巢的机制和口服避孕药的作用机理，即通过雌孕激素负反馈抑制下丘脑．垂体一卵巢轴，从而抑制卵泡发育，储存原始卵泡，保护卵巢储备功能，减少卵巢损伤。相关研究也证实口服避孕药能够降低及预防化疗对卵巢的损伤，促进化疗后卵巢功能甚至是生殖功能的恢复。但也有学者持不同观点，结论尚有争议。本研究旨在探讨化疗期间应用口服避孕药能否保护卵巢功能，以确定口服避孕药的有效性。

目的

本文采用阴道涂片法监测大鼠动情周期，放射免疫法和组织切片法，检测大鼠血清雌二醇(E2)水平、卵泡刺激素(FSH)水平、卵巢重量及卵泡数量，并通过统计学分析，比较实验前后各组实验指标变化，探讨口服避孕药在化疗期间有否起到保护卵巢的作用及其相关机制。

材料与方法

1．SPF级近交系雌性Wistar大白鼠，3月龄，体重1 809～2009。喂食SPF级鼠饲料及净化水，室温20℃~25℃，相对湿度450／0-．55％，每日光照12h，饲养1周熟悉环境后，每日清晨9：00行阴道细胞涂片，显微镜下观察动情周期，选用有正常动情周期的大鼠进入实验。口服避孕药(OC>．—-．达英一35(35pg炔雌醇／2mg醋酸环丙孕酮)。环磷酰胺(CTX)，规格0．29x10支。

2．动物实验：75只Wistar雌性大鼠随机分为5组：

①空白对照组：不予任何药物处理；

②CTx组：负荷剂量50 mg／kg腹腔注射，之后8 mg／(kg·d)腹腔注射，连续14d；

③oc组：8．7599炔雌醇／0．5mg醋酸环丙孕酮(溶于lml生理盐水)，灌胃，连续25d；

④联合治疗I组：同时给予CTX和OC，连续15d，给药方法同②、③组；

⑤联合治疗II组：先连续10d给予OC灌胃，用药剂量同③组；第11d起加用CTX，给药方法、时间及剂量同④组。3．采用阴道涂片法监测大鼠动情周期，放射免疫法测定E2、FSH浓度。所有卵巢标本均经石蜡包埋，连续切片，苏木素．伊红(HE)染色。

从实验开始到结束，各组大鼠每天行阴道涂片，并于给药结束前，每隔5天(相当于大鼠1个正常动情周期)，于动情间期测定各组E2、FSH浓度；停药后第15、30天(相当于3及6个正常动情周期)，测定各组E2、FSH浓度。另外，停药当天、第15、30天，分别处死各组1／3大鼠，比较卵巢重量、卵泡数量变化。

4．统计学处理采用SPSSl0．0软件包检验分析，数据以均数士标准差表示，采用的具体统计学方法有单向方差分析、重复测量、析因分析，两两比较采用SNK及LSD法，所有结果均P<0．05具有统计学意义。

数据记录与结果分析

1．各组大鼠E2、FSH浓度及动情周期变化

(1)大鼠E2、FSH行重复测量分析，分别比较各组、各时间点E2、FSH，分析差异是否有统计学意义，实验分组和时间是否有交互作用。

(2)空白对照组：于动情间期测定E2和FSH。观察阴道涂片是否呈正常大鼠的动情周期改变。

(3)CTX组：观察从给药第5天至实验结束，E2和FSH的变化情况，与同期其余4组E2、FSH分别比较，并分析计算差异是否有统计学意义。记录阴道涂片该组大鼠在给药的第几天出现持续不排卵现象，停药多少天后恢复正常动情周期。

(4)OC组：观察并比较从给药第5天至停药第15天，以及停药第30天，该组E2、FSH浓度与同期空白对照组的高低，计算差异是否有统计学意义。记录阴道涂片该组大鼠在给药的第几天出现持续不排卵现象，停药多少天后恢复正

常动情周期。

(5)联合治疗I组：分别记录在联合给药第5天、第10天、停药当天、以及第15天，停药第30天，E2和FSH分别与上述各组进行比较，并分析差异是否有统计学意义。记录阴道涂片该组大鼠在给药的第几天出现持续不排卵现象，停药多少天后恢复正常动情周期

(6)联合治疗II组：①比较先给予OC药物的前10天，E2、FSH与同期OC组的大小；

②比较在联合给药第5天，E2、FSH与CTX组及联合治疗I组、空白对照组的大小。

③比较联合用药第10天、停药当天、15天，E2、FSH与CTX组、空白对照组的大小。

(7)比较联合治疗I、II组的E2浓度

2．各组大鼠卵巢重量的变化

(1)大鼠卵巢重量行析因分析。

(2)记录空白对照组大鼠卵巢重量。

(3)记录OC组和联合治疗I、II组，在停药当天，大鼠卵巢重量的变化，分别与空白对照组比较，分析差异是否有统计学意义。

(4)CTX组按时间依次测定卵巢重量，分别与同期

其余各组比较并分析差异是否有统计学意义俨。

4．各组大鼠卵泡数量的变化

(1)各组大鼠卵泡总数及各期卵泡数目分别行析因分析。

(2)记录空白对照组大鼠卵泡总数为，原始卵泡个数，初级卵泡个数，次级卵泡个数，成熟卵泡个数。

(3)记录OC组和联合治疗I、II组每次测定的卵泡总数，分别与空白对照组比较。分析差异是否有统计学意义

(4)记录CTX组在停药当天至第30天，卵泡总数及各期卵泡数量的变化，分别与其余各组比较，分析差异是否有统计学意义

讨论

1．环磷酰胺对大鼠各期卵泡的影响？

2．口服避孕药通过雌孕激素负反馈作用，对大鼠卵泡发育和生长起促进作用还是抑制作用，

是否对卵巢储备功能具有保护作用？