小鼠淋巴细胞分离方法

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小鼠免疫器官的识别分离实验报告

小鼠免疫器官的识别分离实验报告
一、实验目的
1、明确各免疫器官分布与形态结构,熟练找到各免疫器官,弄清中枢免疫器官与外周免疫器官的区别与联系.
2、拿握密度梯度离心法分离小鼠脾脏淋巴细胞的方法,熟悉脾脏淋巴细胞的形态与功能.
二、实验原理脾脏是外周免疫器官之一,是人体最大的淋巴器宫.它生在腹腔左上方,质地比较脆,容易外伤.一般来讲脾脏有三大功能首先它是人体的"血库",当人体休息、安静时,它贮存血液,当处于运动、失血、缺氧等应激状态时,它又将血液排送到血循环中,以增加血容量:
其次,脾脏犹如一台"过滤器",当血液中出现病菌、抗原、异物、原虫时,脾脏中的巨噬细胞、淋巴细胞就会将其吃掉此外,脾脏还可以制造免疫球蛋白、补体等免疫物质,发挥免疫作用.脾是血循环中重要的滤过器,能清除血液中的异物、病菌以及衰老死亡的细胞,特别是红细胞和血小板.因此,脾功能亢进时可能会引起红细胞及血小板的减少.脾脏还有产生淋巴细胞的功能.
我们利用小鼠来观察脾脏的淋巴细胞.
小鼠淋巴细胞的比重为1.088,利用比重为1.088的淋巴细胞分离液,将脾细胞县液置于分离液上层,通过梯度离心的方法,在分离液与脾细胞县液交界液面处分离得到脾脏淋巴细胞.
三、实验器材KM种小鼠,PBS缓冲液,淋巴细胞分离液,200目不锈钢网,解剖器械四、实验步骤1、杀死老鼠,取出小鼠的脾脏,在pbs缓冲液中冲洗干净.
2、将小鼠脾脏至于200目铜网中,铜网绑定在烧杯上面,剪碎、碾磨,边碾磨边加PBS冲洗,制得脾细胞晨液.
3、将制得的脾细胞晨液转移到10ml的离心管中,1000r/min5min离心洗涤,倒掉上清,加入5 mIPBS再离心洗涤一次.。

小鼠单个核细胞分离

小鼠单个核细胞分离
第2页
操作步骤：
1. 将2ml小鼠脾脏细胞悬液混匀，然后用滴管沿盛有2ml淋巴细胞分离液试管壁轻轻铺于分离液面上。
2. 将该试管置水平式离心机中1800rpm离心15min。
3. 用滴管小心直接插入白色絮状细胞层，吸出界面层细胞，移入另一试管中。
小鼠单个核细胞分离
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操作步骤：
小鼠单个核细胞分离
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原理：
依据物理学颗粒沉降原理，不一样密度颗粒在其沉降运动中可因其比重差异而处于不一样分布位置。利用此原理可设计一定比重液体界面，将小鼠脾脏中各种不一样比重细胞经过离心沉降而到达使其彼此分离目标。
小鼠单个核细胞分离
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原理：
已知小鼠淋巴细胞和单核细胞比重为1.088左右，而红细胞与粒细胞比重均大于1.088。所以，若用比重为1.088±0.001分离液则可经过密度梯度离心方法，在分离液界面上搜集得到脾单个核细胞。
2. 分离时所取离心速度与时间，因各台离心机离心半径而异，需事先经过预试验决定。
3. 加入稀释血时应十分小心，注意保护试管内界面，勿使混同影响分离效果。
4.
小鼠单个核细胞分离
做细胞活力检验时，锥兰染色后应尽快
计数完成，时间过长则细胞活力可能降低。
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试验结果统计与分析
经过前后两次细胞计数：
取细胞悬液一滴加入等量白细胞稀释液于另一试管中充分混匀，用计数板在显微镜下计数，计算出淋巴细胞浓度（个/ml）。
检验细胞活力：取细胞悬液一滴，加入等量锥兰溶液于另一试管中，充分混匀后马上滴一滴细胞悬液于载玻片上，在显微镜下计数 100~200个淋巴细胞中着色死细胞数。

小鼠淋巴细胞增殖测定步骤

小鼠淋巴细胞增殖测定步骤
小鼠淋巴细胞增殖测定是用来评估免疫功能和细胞毒性的常用方法。

以下是一般的小鼠淋巴细胞增殖测定的步骤：
1. 准备小鼠：选择合适的小鼠品系和年龄，并确保小鼠健康。

2. 分离淋巴细胞：采集小鼠淋巴组织（例如脾脏或淋巴结）并进行细胞分离。

常用的方法包括机械破碎和离心分离。

3. 细胞计数与稀释：用血细胞计数器或显微镜计数细胞数目，并进行适当的稀释以获得合适的细胞密度。

4. 细胞悬液制备：将分离的淋巴细胞与培养基混合，使细胞悬浮于培养基中。

5. 细胞培养：将细胞悬液移至培养皿中，并在37°C、5% CO2
的条件下培养一段时间。

一般培养24-72小时。

6. 刺激因子处理：在培养皿中添加适当的刺激因子（如细胞激动剂或抗原），以刺激细胞增殖。

7. 溶菌酶处理：在培养结束后，加入溶菌酶等溶解剂，使未被细胞内的放射性同位素取代的DNA释放到培养基中。

8. 获得DNA：收集并离心细胞上清液，将其中的DNA沉淀。

9. 放射性测定：使用放射性技术，如液体闪烁计数器，测量
DNA中的放射性同位素含量。

10. 统计分析：根据放射性同位素的计数，计算细胞增殖水平，并进行统计分析。

这些步骤可以根据具体实验目的和方法的需求进行适当的调整和修改。

淋巴细胞增殖实验报告

淋巴细胞增殖实验报告一、实验目的本实验旨在通过体外培养淋巴细胞，观察不同刺激条件下淋巴细胞增殖的情况，探讨淋巴细胞增殖与免疫应答的关系，为进一步研究免疫调节机制提供实验依据。

二、实验材料1. 实验动物：昆明种小鼠，体重20-25g，雌雄不限。

2. 试剂：RPMI-1640培养基、胎牛血清、淋巴细胞分离液、植物血凝素（PHA）、刀豆素A（ConA）、胰蛋白酶、二甲基亚砜（DMSO）、ELISA试剂盒等。

3. 仪器：超净工作台、CO2培养箱、倒置显微镜、酶标仪、流式细胞仪等。

三、实验方法1. 淋巴细胞分离：取小鼠颈椎脱臼处死，无菌操作下取出脾脏，加入胰蛋白酶消化，离心洗涤，再用淋巴细胞分离液分离淋巴细胞。

2. 淋巴细胞培养：将分离得到的淋巴细胞用RPMI-1640培养基重悬，调整细胞密度为1×10^6个/mL，加入PHA或ConA作为刺激剂，分别设置无刺激组、PHA刺激组、ConA刺激组等。

3. 细胞增殖观察：将培养的淋巴细胞置于CO2培养箱中培养，分别在24h、48h、72h、96h和120h取样，用倒置显微镜观察细胞形态变化，并计算细胞数量。

4. ELISA检测：取培养上清液，按照ELISA试剂盒说明书检测细胞因子（如IL-2、IFN-γ等）含量。

5. 流式细胞术检测：取培养的淋巴细胞，用荧光标记的抗体检测T细胞亚群（如CD4+、CD8+等）和细胞周期分布。

四、实验结果1. 细胞形态观察：随着培养时间的延长，淋巴细胞在PHA或ConA刺激下逐渐转变为淋巴母细胞，细胞体积增大，核仁明显，细胞浆内出现空泡。

2. 细胞增殖：在PHA或ConA刺激下，淋巴细胞数量显著增加，且呈时间依赖性。

3. 细胞因子检测：ELISA结果显示，在PHA或ConA刺激下，培养上清液中IL-2、IFN-γ等细胞因子含量显著升高。

4. 流式细胞术检测：流式细胞术结果显示，在PHA或ConA刺激下，T细胞亚群CD4+和CD8+的比例发生改变，且细胞周期分布发生变化。

小鼠CD8+记忆性T淋巴细胞的分离、纯化和体外功能检测

Ｇｕａｎｇｚｕ５ｌ０５，ｈｏ１４０Ｃｈｉａ．ｎ
ＡｂｔａｔＯｅｔｖＴｏｅｔｂｉｈａｍｅｈｄｆｒｉｏａｉｇＣＤ８ｓｒｃｃｉｅｓａｌｔｏｏｓｌｔｓｎ＋ｍｅｒｌｍｐｏｙｅ（ｍｏｙＴｙｈｃｔｓＴｍ），ａｄｔｄｎｉｙｐｒｉｌｕｃｉｎｆｔｅｅｃｌｎｖｔｏｎｏｉｅｔａｔａｆｎｔｓｏｈｓｅｌｉｉ．ＭｅｈｄｅｍｏｓｋｎｔａｓｌｎａｉｎｍｏｅｆｏｓｒｔｏｓＴｈｕｅｓｉｒｎＤａｔｔｄｌｏｗａｓａｌｈｄａｄｔｅｓｌｎｃｔｓｏｅｉｉｎｓｗａｅａａｅ．Ｔｈｙｐｏｙｅｒｓｌｔｄｂｓｅｔｂｉｅｎｈｐｅｏｙｅｆｒｃｐｅｔｓｓｐｒｔｄｓｅｌｍｈｃｔｓｗｅｅｉｏａｅｙｍａｎｔｃｉａｅｅｌｓｒｉｇ（ＡＣＳ）ｇｅｉａｔｔｄｃｌｏｔｃｖｎＭ．Ｔｈｃｉｉｎｈｕｉｙｏｈｍｒｅｅｔｄｂｒｐｎｅａｔｔａｄｔｅｐｒｔｆｅｗｅｅｄｔｃｅｙｔｙａｖｙｔｂｕｔｉｉｇａｄｆｕｒｓｅｃｃｉａｅｅｌｓｒｉｇ（ＡＣ。ｒｓｅｔｅｙＥＩＳｗａｓｄｔａ — ｌｅｓａｎｎｎｌｏｅｃｎｅａｔｔｄｃｌｏｔｖｎＦＳ）ｅｐｃｉｌ．ＡｓｕｅｏｍｅｓｖＩｕｅｔｅＩ２ａｄＩ一ｅｅｓｉｒｈｔ一ｎＩ１ｌｖｌｎＴｍｙｄｆｅｅｔａｔｅｓｓｉｕａｅ．Ｒｅｕｔｅｓｒｉａａｅｏ０ｂｉｒｎｎｉｎｔｆｇｍｌｔｄｓｉＴｈｕｖｖｌｒｔｆｓ

小鼠免疫器官摘取及淋巴细胞分离

“小鼠免疫器官摘取及淋巴细胞分离”实验过程
1.培养皿加入纱布，在纱布上滴2ml淋巴细胞分离液。

2.脱颈处死小鼠，在75%酒精中浸泡30s(示意消毒小鼠)。

3.无菌条件下将腹部剪开，脱皮。

(2min)
4.选取小鼠腹部左侧，剪开腹膜，深红色细长组织即脾脏（淋巴细胞组织）
5.用镊子从下方夹取脾脏，，剔除结缔组织和脂肪后，将组织置于滴有小鼠淋巴细胞分离液的纱布上。

6.脾脏用弯头镊子在纱布上研磨至无血色组织后，纱布上加入1ml淋巴细胞分离液，再用移液器吸取研磨的液体，移至1.5ml离心管内。

(3min)
7.离心（1500rpm,3min）留上清，移入新的15ml离心管中，去除红细胞，此时可以取胸腺。

(可以做到这里停止，示意淋巴细胞和免疫器官胸腺)
8.在装有上清的离心管中加入3ml 1640培养基，离心1500rpm，3min，取沉淀，弃上清，重复清洗2次。

（6min）
9.在显微镜下将细胞浓度调为5×106
个/ml备用。

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达科为小鼠脾脏淋巴细胞分离解决方案 - 生物在线

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2. 3.
平皿的口径不能太大，否则尼龙网不能产生有效的弹力。镊子在一边夹住尼龙网，防止尼龙网在研磨过程中滑动。
参考文献：
1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 殷玉俊,等.[J]江苏大学学报医学版,2008,18(1):15-18 泰淑红,等.[J]免疫学杂志,2008,24(1):34-37 Juntao Zou, et,al.[J]Journal of the Neurological Sciences,2008,5:003-007 朱鹏,等.[J]中华微生物学和免疫学杂志,2007,27(11):1046-1049 朱鹏,等.[J]世界华人消化杂志,2007,15(31):3289-3294 刘义,等.[J]生殖与避孕,2007,27(11):691-694 张慧,等.[J]江苏大学学报医学版,2007,13(2):97-101 王晓莲,等.[J]实用老年医学,2007,21(4):240-242
3/4
达科为生物技术有限公司
EZ-SepTM 系列说明书

小鼠淋巴细胞分离

小鼠全脾分离及淋巴细胞的获取实验步骤：1.杀鼠：将小鼠颈椎脱臼处死，70%酒精喷涂表面，无菌条件下剖开小鼠腹腔2.分离全脾：取脾，横切约1mm厚放入固定液，作为组化样本，其余组织放入1ml 5% FCS 1640.3.脾淋巴细胞的分离：1)脾脏处理：将脾脏置于200目滤网上，用5mL注射器内芯轻轻研磨，不断向组织上滴加2ml 5% FCS 1640，直至组织内绝大部分细胞被分离，1ml注射器抽吸滤过，将细胞收集于5ml离心管中。

.2)500g，3min，弃上清。

3)红细胞裂解：加入1ml 红细胞裂解液，轻轻吹打混匀，室温裂解2分钟至红细胞完全破碎。

4)500g，5min，弃上清。

5)洗涤1次：加入1ml 5% FCS 1640，重悬沉淀，500g，3分钟，弃上清。

加入1mL 10% FCS1640重悬，取出15μL计数；6)台盼蓝染色细胞计数：1:20稀释细胞悬液，与0.4%台盼蓝染液9:1混合，计数；计算终浓度为1×107/mL所需加入10% FCS 1640的量。

7)加入适量10% FCS 1640调整细胞浓度至1×107/mL，置于4ºC备用。

小鼠淋巴结分离及淋巴细胞的获取实验步骤：1.杀鼠：将小鼠颈椎脱臼处死，70%酒精喷涂表面，无菌条件下剖开小鼠腹腔2.分离淋巴结：取腋下，腹股沟，肠系膜淋巴结，其中腋下淋巴结置固定液中送组化，其余淋巴结放入1ml 5% FCS 1640.3.淋巴结淋巴细胞的分离：1)淋巴结处理：将淋巴结漂浮于3ml 5% FCS 1640（玻璃平皿）中，用无菌大镊子紧捏淋巴结，并用5mL注射器内芯轻轻研磨，绝大部分淋巴细胞游离置培养基中，1ml注射器抽吸滤过，将细胞收集于5ml离心管中。

.2)500g，3min，弃上清。

3)洗涤：加入1ml 5% FCS 1640，重悬沉淀，500g，3分钟，弃上清。

加入1mL 10% FCS1640重悬，取出15μL计数；4)台盼蓝染色细胞计数：1:20稀释细胞悬液，与0.4%台盼蓝染液9:1混合，计数；计算终浓度为1×107/mL所需加入10% FCS 1640 的量。

小鼠淋巴细胞的分离培养

小鼠淋巴细胞的分离培养
一、血液中淋巴细胞的分离：
1在1.5ML离心管中加入淋巴细胞分离液0.7ML；
2眼部采集小鼠的抗凝血，抗凝剂20%.。

3轻轻将血液加入淋巴细胞分离液的表面，立即以2000—2500转/分离心10MIN。

4小心吸取上层细胞，转移至另一1.5ML离心管中,再用HANK’S 悬浮至1.5ML，再离心，去上清，再悬浮，等待分型用。

二、鼠脾脏中淋巴细胞的分离：
1无菌采集鼠的脾脏，且灭菌注射器的弯针头轻轻扎取，尽可能使单个细胞分离，再分别用4层灭菌纱布过滤2次。

2将滤液小心加入淋巴细胞分离液中。

离心。

3 吸取上层淋巴细胞，HANK‘S液洗涤2次（尽可能去除淋巴
细胞分离液）。

4加入1640培养液进行培养。

、
*淋巴细胞分离液不低于全部液体的50%。

淋巴细胞分离的实验方法

肝脏免疫学实验室淋巴细胞分离技术肝脏淋巴细胞分离1．小鼠摘眼球放血后，剪开颈动脉处死，摘取肝脏。

2．将肝脏放在200目钢丝网上自边缘开始研磨，转至15ml离心管中。

3．650rpm×1min离心，将上层液体转至15ml离心管中。

4．1500prm×5min离心后弃上清，重复洗两次。

5．6ml 40% Percoll 溶液重悬沉淀，将3ml 70% Percoll溶液加于其底层，2000rpm×20min，升6降2。

6．吸取两层Percoll溶液之间的白细胞层至15ml离心管中，加满PBS后2000rpm×5min 离心收集细胞。

7．1ml PBS 重悬细胞后，吸取10ul细胞悬液，按照1：1的比例与台盼蓝混匀后计数。

脾脏淋巴细胞分离1．小鼠摘眼球放血后剪开颈动脉处死，摘取脾脏。

2．用载玻片的粗糙面将脾脏一点一点磨碎，将收集的研磨悬液通过200目尼龙网过滤至15ml离心管中，1500rpm×5min离心收集细胞。

3．8ml PBS重悬细胞沉淀，在底层加入3ml Ficoll , 2000rpm×20min，升6降2。

4．吸取两层溶液之间的白细胞层至15ml离心管，加满PBS后2000rpm×5min离心收集细胞。

5．6-8 ml PBS 重悬细胞后，吸取10ul细胞悬液，按照1：1的比例与台盼蓝混匀后计数。

胸腺淋巴细胞分离1．小鼠摘眼球放血后，剪开颈动脉处死，摘取胸腺。

2．将胸腺放在200目钢丝网上研磨，将收集的研磨悬液通过尼龙网过滤至15ml离心管中，1500rpm×5min离心收集细胞。

3．6-8ml PBS 重悬细胞沉淀，再次通过200目尼龙网过滤后，吸取10ul细胞悬液，按照1：1的比例与台盼蓝混匀后计数。

淋巴结淋巴细胞分离1．小鼠摘眼球放血后脱臼处死，摘取淋巴结。

2．用载玻片的粗糙面将淋巴结磨碎，将收集的研磨悬液通过200目尼龙网过滤至15ml 离心管中，1500rpm×5min离心收集细胞。

小鼠脾脏淋巴细胞分离与计数实验报告

小鼠脾脏淋巴细胞分离与计数实验报告小鼠脾脏淋巴细胞分离与计数实验报告一、引言淋巴细胞是免疫系统中重要的细胞成分，其在免疫应答和抗体产生中发挥着关键作用。

为了研究淋巴细胞的功能和特性，需要将其从组织中分离出来并进行计数。

本实验旨在通过对小鼠脾脏进行淋巴细胞分离和计数，来获取关于淋巴细胞数量和纯度的信息。

二、材料与方法1. 实验动物：使用C57BL/6小鼠。

2. 仪器与试剂：离心管、离心机、PBS缓冲液、0.83%氯化铵溶液。

3. 实验步骤：A. 准备工作：i. 将离心管预冷至4℃。

ii. 准备PBS缓冲液，并保持在4℃。

B. 小鼠准备：i. 用无菌技术将小鼠安全固定在手术台上。

ii. 使用无菌器械，剪开腹部皮肤和腹壁，暴露脾脏。

iii. 小心取出脾脏并放入含有PBS缓冲液的离心管中。

C. 细胞分离：i. 使用无菌器械，将脾脏组织切碎至细胞悬浮液状态。

ii. 将细胞悬浮液通过70μm滤网过滤，以去除大块组织残渣。

iii. 向过滤后的细胞悬浮液中加入等体积的0.83%氯化铵溶液，进行红细胞溶解。

iv. 用PBS缓冲液洗涤淋巴细胞沉淀，重复此步骤2-3次。

D. 细胞计数：i. 取适量的淋巴细胞悬浮液，加入等体积的尝试涂片溶剂进行稀释。

ii. 在尝试涂片上使用布朗管计数室计数淋巴细胞数量。

三、结果根据实验操作所得数据，我们得到了以下结果：1. 成功分离出小鼠脾脏中的淋巴细胞。

2. 经过红细胞溶解和洗涤步骤后，淋巴细胞沉淀呈现白色悬浮液状态。

3. 在计数室中观察到淋巴细胞的形态特征，如小型、圆形和较大的核。

四、讨论本实验成功地分离出了小鼠脾脏中的淋巴细胞，并通过计数室观察到了其形态特征。

然而，有一些潜在问题需要考虑和改进：1. 纯度问题：尽管我们成功分离出淋巴细胞，但在实验过程中是否存在其他细胞类型的污染仍需进一步验证。

可以通过流式细胞术等技术来评估纯度。

2. 细胞活力：在实验过程中，我们没有对淋巴细胞进行活力测试。

小鼠脾脏淋巴细胞分离与计数实验报告

小鼠脾脏淋巴细胞分离与计数实验报告1. 引言小鼠脾脏淋巴细胞是免疫系统中重要的组成部分，它们在抵御病原体侵袭和保护机体免受自身免疫疾病侵害中发挥着关键的作用。

因此，为了研究小鼠脾脏淋巴细胞的特性和功能，我们需要将其从脾脏中分离出来并进行计数。

本实验旨在描述小鼠脾脏淋巴细胞的分离与计数方法。

2. 材料与方法2.1 实验材料•小鼠脾脏样品•细胞培养基•消化酶•离心管•细胞计数板•显微镜2.2 实验方法2.2.1 小鼠脾脏样品的获取1.选择适龄的小鼠，以确保其脾脏发育成熟。

2.用消毒工具将小鼠颈部暴露，进行脾脏的解剖。

3.将脾脏置于无菌的容器中，迅速将其转移到实验室。

2.2.2 小鼠脾脏淋巴细胞的分离1.将小鼠脾脏放置在无菌离心管中，并加入足够的细胞培养基。

2.使用搅拌器或离心机将脾脏组织均匀分散于培养基中。

3.加入消化酶，按照说明书中的浓度和时间进行消化。

4.在消化结束后，用细胞培养基冲洗脾脏组织，以去除余留的消化酶。

2.2.3 小鼠脾脏淋巴细胞的计数1.取适量的脾脏细胞悬液，加入细胞计数板中。

2.在显微镜下观察并计数细胞计数板中的淋巴细胞数量。

3. 实验结果3.1 小鼠脾脏样品的获取从适龄的小鼠身上成功解剖出脾脏，并将其转移到实验室。

3.2 小鼠脾脏淋巴细胞的分离经过消化酶的作用，小鼠脾脏细胞成功地被分离并悬浮于培养基中。

3.3 小鼠脾脏淋巴细胞的计数通过显微镜观察，我们计数了细胞计数板中的淋巴细胞数量，并记录了结果。

具体数据如下： 1. 格子1：20个淋巴细胞 2. 格子2：18个淋巴细胞 3. 格子3：22个淋巴细胞 4. 格子4：19个淋巴细胞根据计数结果求平均值，得到平均每格淋巴细胞数目为19.75个。

4. 结论根据我们的实验结果，我们成功地分离出小鼠脾脏淋巴细胞，并进行了有效的计数。

通过计数结果，可以推断小鼠脾脏淋巴细胞的数量在每格约为19.75个左右。

这些实验结果为进一步研究小鼠脾脏淋巴细胞的特性和功能提供了基础数据。

实验二淋巴细胞分离实验

注意事项
1.在Ficoll上加入稀释外周血时，应缓慢加，以免冲散界面
2. 吸取单个核细胞层时，应避免吸出过多的上清液或分层液而导致血小板污染
细胞计数
实验步骤注意事项
实验步骤
1、准备计数板： 2、制备细胞悬液：收集细胞，制成单个细胞
悬液 3、加样：用吸管轻轻吹打细胞悬液，取少许
小鼠脾脏淋巴细胞的分离
目的原理实验步骤注意事项
目的
熟悉淋巴细胞和外周血单个核细胞（PBMC）的分离方法
原理
脾脏各种血细胞的密度不尽相同，利用淋巴细胞分层液（Ficoll）作密度梯度离心，使一定比重的细胞群按相应密度梯度分布，从而将各种血细胞加以分离。
原理
外周血
红细胞
1.093
粒细胞
单个核细胞 (PBMC) 血小板
淋巴细胞单核细胞
1.092 1.075~1.090
1.030~1.035
Ficoll：1.077±0.001
稀
释
外
周, 30min
Ficoll
Ficoll
稀释的血浆、血小板 PBMC
红细胞粒细胞
实验步骤
1.实验一获取的小鼠脾脏载玻片研磨（研磨同时滴加1640培养液，保持细胞活性）
细胞悬液，在计数板上盖玻片的一侧加微量细胞悬液， 4、计数：在显微镜下，用10×物镜观察计数板四角大方格中的细胞数
实验步骤
5、计算：将结果代入下式，得出细胞密度细胞数/毫升原液 =（4大格细胞数之和/4）×104
注意事项
1.取样计数前，应充分混匀细胞悬液 2.加样量不要溢出盖玻片，也不要过少或带
气泡 3.细胞压中线时，数上不数下，数左不数右 4.本法要求细胞密度不低于104细胞/ml 5.镜下计数时，细胞数过少或过多，说明稀

小鼠t细胞分离步骤

小鼠t细胞分离步骤小鼠T细胞分离步骤T细胞是免疫系统中的重要成分，它们能够识别和攻击感染体内的病原体。

因此，对T细胞的研究对于疾病的治疗和预防具有重要意义。

本文将介绍小鼠T细胞的分离步骤。

步骤一：收集小鼠淋巴结需要从小鼠身上收集淋巴结。

淋巴结是免疫系统中的重要组织，其中包含大量的T细胞。

收集淋巴结的方法有多种，可以选择颈部、腋窝或腹股沟等部位进行切割。

收集后，将淋巴结放入含有PBS （磷酸盐缓冲液）的离心管中。

步骤二：制备单细胞悬液将淋巴结放入离心管中后，需要将其制备成单细胞悬液。

具体方法是用剪刀将淋巴结切碎，然后用过滤网过滤掉大块组织。

接着，用PBS洗涤细胞，使其成为单细胞悬液。

步骤三：离心分层将制备好的单细胞悬液放入离心管中，进行离心分层。

离心分层的目的是将不同密度的细胞分离开来。

在小鼠T细胞的分离中，需要将淋巴细胞和单核细胞分离开来。

离心分层的条件可以根据实验需要进行调整。

步骤四：T细胞的筛选将离心分层后的细胞进行筛选，以分离出T细胞。

T细胞的筛选可以使用多种方法，如磁珠分离、流式细胞术等。

其中，流式细胞术是一种常用的方法。

通过标记T细胞表面的特定抗原，然后使用荧光素等物质进行检测，从而分离出T细胞。

步骤五：培养和检测将分离出的T细胞进行培养和检测。

培养条件可以根据实验需要进行调整，一般需要提供适当的营养物质和生长因子。

检测T细胞的方法有多种，如细胞增殖实验、细胞毒性实验等。

总结小鼠T细胞的分离步骤包括收集淋巴结、制备单细胞悬液、离心分层、T细胞的筛选、培养和检测等。

这些步骤需要仔细操作，以确保分离出的T细胞质量和数量符合实验要求。

通过这些步骤，可以为T细胞的研究提供重要的实验基础。

小鼠淋巴细胞分离方法

小鼠淋巴细胞分离方法一、实验用品的准备：1.采血用品：10ml注射器10个；手套20付；15ml离心管10个；20µl枪头、200µl枪头、1000µl枪头。

摄子、剪刀各2把；加样器；70%酒精；5%碘酒；2.取脾用品：10ml注射器10个；手术器械10套；手套20付，60mm玻璃培养皿10个；200 目尼龙网，裁成100mm×100mm正方形10块；10mL 玻璃注射器内活塞10个；5mL刻度吸管、15mL离心管、1640培养基；鼠淋巴细胞分离液；摄子、剪刀各10把；70%酒精；5%碘酒；移液器、离心机；刀剪浸泡液（新洁尔灭）；注：红色必须灭菌；蓝色可以不灭菌；绿色需特殊处理；黑色不用灭菌。

二、相关实验：（一）实验名称：分离小鼠脾脏淋巴细胞实验目的：获得小鼠脾脏淋巴细胞，为ELISPOT实验做准备。

实验动物：BABALB/c小鼠；雌性实验材料：1．小鼠淋巴细胞分离液,2．60mm玻璃培养皿3．10mL 玻璃注射器内活塞，灭菌4．气管切开包5．5mL刻度吸管、15mL离心管、移液器、离心机6．1640培养基实验方法1. 断颈处死小鼠，浸入75%的乙醇中浸泡1-2分钟。

2. 在超净台中小心剪开小鼠的腹部外皮，用大头针固定，再剪开小鼠的腹腔，用镊子取出小鼠脾脏。

注意无菌操作。

3. 在培养皿中放入3mL1640基础培养基，将小鼠脾脏放入培养皿中，用1ml注射器吸取小鼠淋巴细胞分离液，注入小鼠脾脏，直至完全分离。

4. 把悬有脾脏细胞的1640培养基缓慢转移到装有6 mL淋巴细胞分离液的15 mL离心管中。

5. 3000转离心15分钟。

（病毒室离心机）6.吸出淋巴细胞层，加入5mL 1640培养基洗涤一次，1500转离心10 分钟。

7.倾倒上清液，加入3-5mL5ml5%FCS1640培养基重悬，细胞计数。

8.对获得的小鼠脾脏淋巴细胞进行ELSPOT 检测。

实验试剂用量：1．小鼠淋巴细胞分离液：60 mL 2．1640基础培养基：80 mL 3．5%FCS1640培养基：50Ml。

脾脏淋巴细胞分离方法

小鼠脾脏淋巴细胞分离方法需要提前准备的材料：提前高压灭菌：手术器械，200目尼龙网，除菌过滤：8.5%和0.85%的Nacl溶液各40ml，1XPBS溶液，hanks液40ml。

红细胞裂解液，六孔板，培养皿，75%酒精，100ml烧杯，无菌注射器5-10ml，15ml、50ml 离心管，4mlEP管，离心机等。

1、配制的percoll工作液：配制15 ml100%percoll液（简称工作液）：13.5ml percoll原液+1.5 ml 8.5%Nacl溶液混匀备用。

2、配制6个梯度，每个梯度2ml，实际配制3ml70%percoll液（1.090g/ml）：2.1 ml工作液+0.9 ml 0.85%Nacl溶液混匀备用60%percoll液（1.077g/ml）：1.8 ml工作液+1.2 ml 0.85%Nacl溶液混匀备用50%percoll液（1.067g/ml）：1.5 ml工作液+1.5 ml 0.85%Nacl溶液混匀备用40%percoll液（1.050g/ml）：1.2 ml工作液+1.8 ml 0.85%Nacl溶液混匀备用30%percoll液（1.043g/ml）：0.9 ml工作液+2.1 ml 0.85%Nacl溶液混匀备用20%percoll液（1.031g/ml）：0.6 ml工作液+2.4 ml 0.85%Nacl溶液混匀备用找一只15ml离心管，从低到高（20% percoll液→70%percoll液）依次装入，装好备用。

3、小鼠脾脏细胞分离（1）颈椎脱臼处死小鼠。

75%酒精浸泡10min（2）无菌条件下取出小鼠脾脏，去除筋膜等置于Hanks’ 液中，将脾脏放入2ml离心管中剪碎。

（3）将200目尼龙网置于六孔板上，用注射器头研磨，过程中不停加Hanks’ 液冲洗。

（4）收集脾细胞悬液置于离心管中，1500rpm 10min，弃上清。

（5）加10ml？红细胞裂解液混悬沉淀，室温静置10min，再1500rpm 10min（6）洗三遍，1500rpm 5min，离心去上清（7）加入2ml 0.85%Nacl溶液混悬沉淀。

小鼠肝脏淋巴细胞分离

肝脏淋巴细胞分离protocol
1. 腹腔注射100uL/只小鼠麻醉;
2. 用约20mL PBS从下腔静脉处灌洗(肾,肺,肝均变白,肝脏灌注也可);
3. 取10cm细胞培养皿,加入10mL 10% FBS+DMEM,将滤网浸于其中,取出的肝组织置于滤网中;
4. 用1mL注射器的内芯研磨,制备细胞悬液;
5. 从皿中吸取细胞悬液到50mL离心管,补加PBS至30mL;
6. 50g离心3min,上清转移至新管;
7. 1500rpm X 5min离心,2.5mL DMEM重悬细胞。

8. 准备percoll:
6mL 100% percoll + 660uL 10X PBS配成90% percoll
4mL 90% percol + 1.12mL DMEM配成70% percoll
2.5mL细胞重悬液+ 2mL 90% percoll配成40% percoll;
9. 将40% percoll细胞悬液沿管壁缓缓加入70% percoll中;
10. 2000rpm离心20min,brake和accelerate都设为level 1;
11. 吸取中间层细胞,PBS补加到10mL,400g离心10分钟;
12. 弃上清,加1mL红细胞裂解液,裂解2min
13. 补加PBS到10mL,终止裂解,400g离心10分钟
14. 将细胞重悬到合适体积,计数,用于下游分析。

实验三_小鼠淋巴结分离及淋巴细胞的获取

实验三小鼠淋巴结分离及淋巴细胞的获取一、实验目的1、了解小鼠淋巴结的分布特点2、熟练掌握小鼠淋巴细胞分离技术和显微观察技术二、实验原理淋巴结是外周免疫器官，位于淋巴管汇集部位，是淋巴细胞定居和特异性免疫应答发生的场所。

淋巴结遍布全身，其中以颈部、腋下、腹股沟，肠系膜淋巴结最容易分离，是获取淋巴细胞的主要组织之一。

小鼠颈部和腋下淋巴结分布如图3所示。

淋巴结内，T 细胞占淋巴细胞总数的75％，B 细胞占25％。

三、实验仪器和试剂1、仪器设备显微镜、玻片、解剖台、大头针、摄子、剪刀、玻璃平皿、微量移液器、注射器、离心管、筛网等2、试剂和材料（1）实验小鼠（2）生理盐水（3）75%酒精四、实验步骤1、杀鼠：将小鼠颈椎脱臼法处死，75%酒精喷表面，用大头针将鼠四肢固定在解剖台上。

2、分离淋巴结：用剪刀剪开小鼠皮肤，钝性剥开皮肤，仔细寻找小鼠取颈部和腋下淋巴结，并用镊子取下淋巴结，将淋巴结置于盛有3mL 生理盐水的玻璃平皿中。

3、淋巴结淋巴细胞的分离：（1）淋巴结处理：将淋巴结转移到筛网上，筛网置于原玻璃平皿中，用5mL 注射器内芯轻轻研磨淋巴结，不断从平皿中吸取生理盐水冲洗筛网。

（2）移开筛网，将平皿内的细胞收集于2 个1.5mL 离心管中。

（3）3000rpm 室温离心3min，弃上清。

（4）加入20～100μL 生理盐水，重悬沉淀。

4、显微观察：取出10μL 细胞悬液滴在干净干燥的玻片上，盖上盖玻片，在显微镜下观察分离到的淋巴细胞。

五、注意事项1、要按正确的方法抓小鼠和处死小鼠，避免被小鼠伤害。

2、注意区分淋巴组织和其他组织，取到的淋巴结要足够，至少三个。

3、用注射器内芯研磨淋巴结时，力度一定要准确，避免破坏淋巴细胞。

4、冲洗筛网要干净，避免淋巴浓度过低。

5、装玻片时要记得盖上盖玻片，观察时从低倍镜到高倍镜。

六、结果分析试验结果如图所示图中气泡状的小圆点就是淋巴细胞。

淋巴细胞布满这个视野，呈均匀分布，且没有其他的杂质细胞，说明试验过程很成功。

密度梯度法分离小鼠淋巴细胞

密度梯度法分离小鼠淋巴细胞一、实验目的掌握密度梯度法分离单个核淋巴细胞二、实验原理红细胞和多核白细胞的比重（1.092左右）比淋巴细胞的比重（1.075-1.090）大，因此利用一种比重介于1.075~1.092之间的等渗溶液（淋巴细胞分离液）作密度梯度离心，使不同比重的细胞按不同的密度梯度分布。

三、实验试剂和器材Balb/c鼠，1640培养基，淋巴细胞分离液，镊子，剪刀，金属网，研棒，平皿，枪头、15ml离心管、移液器、离心机、白瓷盘、酒精棉球、烧杯。

四、实验步骤1、对Balb/c鼠先用摘眼球放血并拉脊椎处死。

2、用酒精棉球擦拭小鼠腹部，用剪刀和镊子在腹部剪开一个小口，用手撕开小鼠的皮毛，使肌肉裸露，用剪刀和镊子剪开肌肉，取脾脏。

去除血细胞及脂肪组织，用2ml 1640进行清洗。

3、将清洗过的脾脏放到置于平皿中的金属网上，先加入1ml 1640，用研磨棒压碎脾脏成单细胞，补加2ml 1640冲洗金属网。

4、将研磨的单细胞悬液小心的靠壁滴加入5ml体积的淋巴细胞分离液的液面上（小心不破坏淋巴细胞分离液液面），2000r/min，离心20min，此时离心管中由上至下细胞分四层。

用枪头小心吸取第二层的环状乳白色淋巴细胞层，放入加入了约10ml的PBS的离心管中，充分混匀，1500r/min，离心5min，弃上清。

剩余约100ul PBS，重悬，混匀，即得淋巴细胞悬液。

五、实验结果1、离心后溶液分为四层，最上层为粉红色澄清液体，第二层处于分界处，稍微发白模糊，第三层为透明状液体，有少量絮状漂浮物，最下层为深红色沉淀。

2、最后得到的淋巴细胞悬液较为浑浊，颜色发白。

六、实验分析及讨论（一）实验讨论1、淋巴细胞分离液看起来是无色透明的，实际上由两种糖分构成，具有梯度，故可以对淋巴细胞产生分离作用。

2、再去脾脏前要确保小鼠已被处死，避免小鼠挣扎造成污染。

3、在解剖前用酒精棉球擦拭小鼠腹部，即可起到消毒作用，又可以弄湿鼠毛露出皮肤，方便解剖。

小鼠脾脏淋巴细胞检测方法

小鼠脾脏淋巴细胞检测方法说实话小鼠脾脏淋巴细胞检测这事儿，我一开始也是瞎摸索。

我试过好多种方法，走了不少弯路呢。

我最早的时候，那就是按照一些书上的基本步骤来。

先得把小鼠处死，这一步可得小心点，千万不要把脾脏什么的给弄破弄坏了，就好比你拆一个特别精密的小零件，得小心翼翼的，不然就全乱套了。

然后取脾的时候，我就出过岔子。

有次取脾太着急，结果把旁边的一些组织也带出来了不少，这就会影响后面步骤的准确性。

我后来就明白了，得用镊子特别小心地把脾脏完整地分离出来才好。

取出来脾脏之后就要研磨来制备细胞悬液。

我研磨的时候一开始总是掌握不好力度，要么就是研磨得太轻了，细胞没有完全释放出来，就像你榨果汁，但是力气小了，好多果肉还在果渣里一样；要么就是研磨得太重，把细胞弄破了一些，这就惨了。

经过好多回试验，我才逐渐掌握了那个合适的力度，就像你慢慢找到了开锁的正确手感一样。

制备好细胞悬液后下面就是分离淋巴细胞了。

有密度梯度离心法，可这方法里那个离心的转速啊，就像一个神秘的数字，我试了好几个不同的转速，才找到了最适合的那个数值，能把淋巴细胞比较干净地分离出来。

刚开始的时候要么转速不对，淋巴细胞和别的细胞混在一起分不开，要么就是纯度不够。

对于检测淋巴细胞数量和活性这一步，我以前用过台盼蓝染色的方法。

但这个染液的量得用好，有一次染液加多了，结果看细胞都花了眼，都辨不清死活了。

后来知道就只能加那么一点点，就够覆盖细胞就好，然后在显微镜下仔细看蓝的就是死细胞，没着色的就是活细胞。

而且这个观察的时候，也得有耐心，要多个视野都看看统计，不能就看一眼就下结论。

这就像你数一堆东西一样得仔细都数到。

还有用流式细胞术检测淋巴细胞的各种亚群，这个仪器老高级了，但操作起来参数设置很关键，我一开始也是晕头转向的，老是测不准。

后来向做过的同事请教，又自己不断尝试不同的参数组合，才慢慢能得到准确的结果。

比如说那个门的设置，就像是给不同的人群划区域，要是划得不好，就把类型分错了。