酶工程在茶饮料中的应用及研究进展

酶工程是生物工程的一个重要组成部分，它 是在一定的生物反应器内，利用酶的催化作用， 进行物质转化的技术[1]。酶工程技术主要包括酶制 剂的制备、酶的分离纯化、酶的固定化、酶反应 器、酶分子的修饰和应用等。酶工程在茶业上的 研究和应用主要集中在茶叶深加工领域，包括茶 叶天然产物（茶氨酸、茶黄素等）的合成、提取，茶 饮料加工，以及茶树育种、茶叶天然源农药的开 发等。如固定化酶制备茶黄素[2]，固定化膜酶催化 茶多酚形成茶黄素的反应条件优选[3]，Suzuki 等利 用 GGT 催化 L-谷氨酰胺（Gln）和乙胺反应制备茶 氨酸，Gln 转化率可达到 60%[4]，Shuai Y.等利用枯 草芽孢杆菌 SK11.004 中的谷氨酰转肽酶来高效率 合成茶氨酸[5]。
多 酚 氧 化 酶（Polyphenol Oxidase， EC1.10.3.1） 在茶叶加工中是一种重要的酶类，多酚氧化酶的 作用主要是促使儿茶素类物质氧化成邻醌进而形 成茶黄素等氧化聚合物[23]。红茶的品质特点就是在 制造过程中多酚氧化酶将黄烷醇类氧化成醌，形 成的醌再经氧化缩合成更复杂的发酵产物如茶黄 素、茶红素和茶褐素[23]。因此可以通过多酚氧化酶 的转化作用将非红茶原料加工成具有红茶特征的 速溶茶。酶的来源可以是茶鲜叶本身、其它植物 或者微生物等。Takeo T.和 Uritani J.用茶鲜叶或绿 茶为原料，成功地利用从马铃薯、蚕豆、大枫树、
单宁酶不仅在解决茶饮料冷后浑上研究和应用 有很多，而且还广泛用于酒类、果汁饮料等的澄 清。目前单宁酶较多来自在微生物资源方面，主 要集中在曲霉属、青霉属、细菌等，如黑曲霉、米 曲霉、泡盛曲霉、青霉、球形芽孢杆菌等。并且有 研究者 Raghuwanshi S. 等指出球形芽孢杆菌（Bacil－ lus sphaericus）是目前最高产生单宁酶的菌株[17]。总 之，单宁酶在有蛋白质参与的沉淀反应中扮演着 重要的角色，广泛应用于医药和食品工业[18]。 1.2 水解酶类
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高效率，降低生产成本；将其运用在果汁饮料、 茶饮料实际生产应用中，可以起到改善风味、提 高品质的作用[37]。
Su E. Z.等人对固定化 β-葡萄糖苷酶、固定化 的单宁酶进行了研究，通过交联-包埋-交联法固 定化后，其中固定化 β-葡萄糖苷酶的活性回收率 达 46.0%，固定化单宁酶达 76.6%，并且还对这两 种固定化酶的性质进行了研究，以确定其最适的 反应条件；此外还对它们的储藏稳定性和重复实 用性进行测定，在 42d 的储藏后活性保留量分别 为 73.3%、72.5%，在 50 次重复使用之后固 定化 β-葡萄糖苷酶的残留活性还有 93.6%，固定化单 宁酶在 30 次使用后为 86.9%，都显示出了较好的 储藏稳定性和重复使用性[28，38]。苏二正等通过共固 定化单宁酶和 β-葡萄糖苷酶，比较了海藻酸钠和 壳聚糖两种载体及不同固定化方法对单宁酶和 β葡萄糖苷酶的共固定化效果，结果表明以海藻酸 钠为载体，采用交联-包埋-交联固定化方法的效 果最佳[39，40]。印度 Khan A. A.等，利用硅藻土 545采 用吸附法对土豆中提纯的多酚氧化酶进行固定化 研究，酶活回收率达到 71％，并且固定化酶对高 温、表面活性剂（如 SDS 等）的抗性以及在有机溶 剂中的稳定性较游离酶有着显著的提高[41]。李荣林 等在研究多酚氧化酶固定化技术的试验中指出用海 藻酸钠包埋具有较好的效果[42]。Fernandez-Lorente G. 等人指出固定化单宁酶在最佳的反应条件下稳定性 很好[43]。Boadia D. K.等尝试采用多种载体对单宁酶 进行固定化研究，结果表明以海藻酸钙为核心， 外面包裹壳聚糖，再用戊二醛交联，所产生的胶 珠性能最佳，固定化单宁酶可在茶汤中连续进行 3 批共 39h 的“冷后浑”转溶处理，冰箱保存一个月 后酶活力仍保持稳定[44]。Girelli A. M.等的试验将固 定化的酪氨酸酶生物反应器作为一种快速工具来 测定茶叶中茶多酚含量[45]。
［收稿日期］ 2013-02-03 ［作者简介］ 张敏星（1987-），女，云南大理人，硕士研究生，研究方向：茶叶加工与综合利用研究。 ［通讯作者］ 陈文品，博士，研究生导师，研究方向：茶叶初、精、深加工研究。
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为 pH5.0~6.0、温度 45℃ 。 [13] Jakson 和 Lee 研 究报 道：添加单宁酶处理茶汤，茶中不利于品质的铁、 钙、镁和锌等离子的溶解性会增加[14]。邓军等总结 单宁酶在茶饮料的应用主要是防止冷后浑、提高茶 叶提取率，保持茶汁的色泽和减轻苦涩味[15]。Lu M. J.等人利用单宁酶处理绿茶的浸提液，结果表明经 单宁酶处理后能明显减少茶乳酪，改善茶汤色泽 和感官品质[16]。
水解酶（Hydrolase，EC3）在茶饮料上的应用主 要包括纤维素酶、半纤维素酶、蛋白酶、果胶酶 等。这些酶主要是通过酶解法的原理打开茶叶细 胞壁，使茶叶内的有效成分充分溶解出来，从而 提高茶叶的萃取率和茶汤固形物的含量，增加茶 饮料口感的丰富度。姜绍通等利用酶制剂研究了 提取速溶绿茶的条件，认为绿茶在蛋白酶、纤维 素酶组合作用下 ，速溶绿茶提 取率达 30% 左右 ， 并具有保香效果好、冲溶后茶水口味鲜醇的优点[19]。 梁靖等人研究了纤维素酶在速溶茶中应用的最佳 条件是：浸提温度 45℃、浸提时间 60min、添加量 0.15u/ml[20]。武永福等人通过正交设计和实际生产的 结合指出速溶茶酶辅提的较合适的工艺参数为： 蛋白酶、果胶酶、纤维素酶各添加 0.25%，原料粉 碎至 16 目，茶水比 1∶15，浸提 2 次，各 30min[21]。 黄静等在外源果胶酶对绿茶液微滤过程的效应研 究中加入外源果胶酶后，茶液中的水浸出物、茶 多酚、氨基酸、咖啡碱、儿茶素和糖的含量都有 所增加[22]。 1.3 多酚氧化酶
茶叶是一种天然的保健产品，随着人们生活 节奏的加快，茶饮料作为顺应时代发展的产物已 经深入人们的生活。茶饮料是指以茶叶的水提取 液或其浓缩液、茶粉等为原料，经加工制成的饮 料[6]。目前茶饮料行业发展迅猛，对整个茶叶行业 的发展起着不可低估的推动作用。但茶饮料加工 中还存在一些技术性难题制约其发展，比如茶叶 中的茶多酚及其氧化产物茶黄素、茶红素等和咖 啡碱通过氢键的缔合作用，形成络合物而导致冷 后浑；在茶饮料加工过程中芳香物质出现香气混 杂、损耗及变化而导致香气低沉恶化；还有滋味 淡薄、汤色褐变等现象。酶工程技术正好具有反 应条件温和，专一性强、效率高的特点，能有效
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张敏星，张灵枝，陈文品 （华南农业大学园艺学院茶学系，广东广州 510642）
摘要：主要综述和总结了单宁酶、多糖水解酶、多酚氧化酶、β-葡萄糖苷酶等多种酶制剂及固定化酶技术在茶饮料中的 应用与研究状况，并对其应用前景进行了展望。 关键词：酶工程；茶饮料；固定化酶 中图分类号：TS275.2 Q814 文献标识码：B ｄｏｉ：10.3969/j.issn.1007-7871.2013.04.003
还有一些酶类物质可以应用在茶饮料的生产 加工中，葡萄糖氧化酶可作为护色酶应用于茶饮 料生产中，溶菌酶防止茶饮料因微生物污染而引 起的变质，用蛋白酶可降低浑浊度等。宁井铭等 对绿茶饮料护色技术的研究时指出加入一定量的 葡萄糖氧化酶，消耗以部分的游离氧，从而减小 的游离氧，可以使茶汤中茶多酚、维生素、芳香 成分等对氧敏感的物质变得稳定，因而起到了护 色作用[32]。茶饮料中的沉淀除了茶内含成分的作用 之外，也有可能是由细菌等微生物污染而引起的， 加入溶菌酶则可以起到溶菌防腐的作用[33]。茶汤中 添加蛋白酶可分解蛋白质，防止蛋白质的沉降， 提高茶饮料的澄清度[34]。
苹果中提取的酶制剂直接加工成速溶茶的制造工 艺，并取得了专利[24]。日本人竹元万寿美曾用简单 经济的方法制造富含茶黄素类的发酵茶饮料，并 获得了专利[25]。此外，多酚氧化酶还可用于茶饮料 生产过程中异味的去除、独特风味物质的形成、 解决浑浊现象等方面[26]。 1.4 β-葡萄糖苷酶
β-葡萄糖苷酶（Beta-Glucosidase，EC3.2.1.21） 又称 β-D-葡萄糖苷水解酶，它能水解结合于末端 非还原性的 β-D-葡萄糖键，同时释放出 β-D-葡 萄糖和相应的配基。香气形成机理研究结果表明， 内源糖苷酶对茶叶花香形成起着很重要的作用 。 [27] 比如茶叶中具有百合花香或玉兰花香味的芳樟醇、 具有玫瑰香气的香叶醇等，这些芳香物质的形成 是由糖苷类水解酶的作用而产生的。Su E. Z.等人对 固定化 β-葡萄糖苷酶在茶饮料的增香效果中得出 经固定化 β-葡萄糖苷酶处理的不同茶饮料，绿茶、 乌 龙 茶 和 红 茶 的 香 精 油 总 量 分 别 增 加 20.69% 、 10.30%、6.79%[28]。李平等人将黑曲霉 β-葡萄糖苷 酶应用于果汁、茶汁、果酒等食品的增香，显示 出较好的增香效果[29]。吕连梅用固定化的 β-葡萄糖 苷酶处理 5 种茶汤，其香气释放总量、醇系香气 总量都有不同程度的提高[30]。β-葡萄糖苷酶不仅对 茶叶增香有显著的效益、在果汁风味的改良和果 酒增香中也有广泛的应用[31]。 1.5 其他酶制剂
综上所述，固定化酶技术在茶饮料上的的研 究主要集中在固定化的方法的探索、寻找合适的 载体、反应器等方面，总体上都取得了一定的成 就。当然由于技术原因，目前用酶处理茶汤进行 工业化生产的成本太高，无法在生产上大力推行， 当前要解决的问题首先要培养产高酶、活力强的 菌种，其次解决酶固定化的问题[46]。所以探索新方 法和固定化材料提高酶活性，研究新方法将实验 成果转向工业生产等将成为未来酶工程发展的方 向[47]。
2 固定化酶技术在茶饮料中的应用
固定化酶技术是 20 世纪 60 年代发展起来的 一项生物工程技术，酶的固定化是用固体材料将 酶束缚或限制于一定区域内，进行特有的催化反 应并可回收及重复利用的技术[35]。其固定方法主要 有吸附法、包埋法、共价键合法和一些其他方法， 针对不同的酶，不同的载体，需要采用不同的方 法，有时还需要将几种方法联合使用[36]。通过固定 化酶技术不仅可以实现反应工业化、连续化，提
解决这些问题，为茶饮料的健康发展奠定良好而 坚实的基础。本文就其在茶饮料中的应用进行阐 述和总结，并对未来的发展趋势进行展望。
1 酶制剂在茶饮料中的应用
1.1 单宁酶 单宁酶（Tannase，EC3.1.1.20）通过水解酯型儿
茶素释放出没食子酸，没食子酸又与茶黄素、茶 红素等竞争咖啡碱，形成小分子量的水溶物，从而 降低茶汤的浊度，改善茶汤色泽。Takico Y.将一种 曲霉菌属（Aspegillus oryzae）所产生的单宁酶作用于 6%的红茶茶汤，发现单宁酶在茶汤 pH5.6、温度 45℃的条件下作用 30～60min 时，茶乳酪产生得最少[7]。 Beena P. S.等人指出泡盛曲霉（Aspergillus awamori） 能 产 生 一 种 胞 外 酶— — —嗜 酸 性 单 宁 酶 ， 这 种 酶 不 仅能使茶乳酪的增溶，还能在降解茶乳酪的同时 产生没食子酸和单宁酶[8]。1976 年，可口可乐公司 利 用 单 宁 酶 防 止 茶 饮 料 中 的“ 冷 后 浑 ”， 浑 浊 度 由 80%降到 8%[9]。Lane R. W.等人通过对单宁酶的安 全性评价指出，单宁酶可用于茶叶的加工[10]。还有 研究通过青霉菌产生单宁酶进行酒的澄清和茶乳 酪的增溶，其中经过处理后茶乳酪能降低 74% 。 [11] 童鑫等人的在研究外源单宁酶对绿茶液微滤过程 的影响中指出外源单宁酶的加入能有效提高微滤工 效和微滤液的生化得率[12]。Thomas R. L.等研究单宁 酶对红茶及绿茶茶汤的作用，提出最佳作用条件