克隆绿色荧光蛋白分子生物学实验报告
分子生物学实验设计报告
分⼦⽣物学实验设计报告分⼦⽣物学实验设计报告——得到表达绿⾊荧光蛋⽩基因的⼤肠杆菌郭晓涵艾珉吉实验最终⽬标：得到表达绿⾊荧光蛋⽩基因的⼤肠杆菌实验所需质粒：PET28a质粒、pEGFP-N3质粒（⽼师提供）（pEGFP-N3载体为真核细胞表达载体）实验所需细胞：DH-5α和BL-21感受态细胞（⽼师提供）实验主要部分：将PET28a质粒及pEGFP-N3质粒转⼊感受态细胞并扩⼤培养；提取上述两种质粒并酶切检测；扩增EGPF基因⽚段和pET-28a酶切质粒并构建重组质粒；重组质粒转⼊DH-5α扩增及菌落PCR检测与细胞发光检测。
图⽰如下：两种质粒扩⼤培养及酶切检测载体质粒PET-28a ⽬的基因质粒(绿⾊荧光蛋⽩)质粒重组具体步骤：分离质粒DNA的⽅法⼀般包括三个基本步骤：培养细菌使质粒扩增收集和裂解细菌分离和纯化质粒DNA重组质粒PET-28a-GFP的构建：E.coli DH-5α（pEGFP-N3） E.coli DH-5α（pET-28a）质粒pEGFP-N3 质粒pET-28a插⼊⽚段连接插⼊⽚段重组质粒（PET-28a-GFP）⼀、将PET28a质粒及pEGFP-N3质粒转⼊DH-5α感受态细胞并扩⼤培养1. 取200 µl制备好的感受态细胞，冰上解冻，均匀悬浮。
2. 分别加⼊2 µl⽬的质粒，轻轻混匀，冰上静置10-30 min。
3. 42 ℃⽔浴2min后，冰上放置2 min。
4. 加⼊400µl LB液体培养基，37 ℃，50-100 rpm振荡培养1 h。
5. 取200 µl悬浮细胞均匀涂布在LB固体培养基（含卡那霉素）上，培养⽫正放静置1-2 h后，封⼝膜封好，37 ℃倒置培养12-18 h，留做备⽤。
注：LB培养液的制备⽅法——胰蛋⽩胨（Tryptone）10g，酵母提取物（Yeast extract）5 g，NaCl 5g，琼脂（固体培养基）15g，⽤1N NaOH调pH 7.5。
生化绿色荧光蛋白的基因克隆及表达开题报告
学号：班级：姓名：《生物化学与生物分子学实验》——分子生物学设计性实验开题报告实验课题:绿色荧光蛋白的基因克隆及表达指导老师:作者姓名:所在院系：小组编号：小组成员:完成时间：成都医学院Cheng Du Medical College题目：绿色荧光蛋白（GFP）基因的基因克隆及在大肠杆菌中的表达立题依据：随着分子生物学和基因工程技术的迅速发展和广泛应用，人们根据自己的意愿有目的、有计划、有根据、有预见地将外源基因导入动物细胞内, 使外源基因进行表达、阐明基因表达的调控机理或者通过与染色体基因组进行稳定整合,将生物性状传递给子代动物的研究方兴未艾[1].1.选材：大肠杆菌大肠杆菌是第一个用于重组蛋白生产的宿主菌，它不仅具有遗传背景清楚、培养操作简单、转化和转导效率高、生长繁殖快、成本低廉、可以快速大规模地生产目的蛋白等优点.而且其表达外源基因产物的水平远高于其它基因表达系统,表达的目的蛋白量甚至能超过细菌中蛋白量的30 ％，因此大肠杆菌是目前应用最广泛的蛋白质表达系统。
2.基因标记技术基因标记技术是近年来发展起来的分子生物学技术。
荧光蛋白基因在标记基因方面由于具有独特的优点而引起了科学家的广泛关注，现已被普遍应用到分子生物学研究的各个方面。
荧光蛋白是海洋生物体内的一类发光蛋白,分为绿色荧光蛋白、蓝色荧光蛋白、黄色荧光蛋白和红色荧光蛋白［2］.3。
绿色荧光蛋白从水母（Aequorea victoria)体内发现的发光蛋白。
分子质量为26kDa，由238个氨基酸构成,第65～67位氨基酸(Ser-Tyr—Gly）形成发光团，是主要发光的位置。
其发光团的形成不具物种专一性，发出荧光稳定,且不需依赖任何辅因子或其他基质而发光.绿色荧光蛋白基因转化入宿主细胞后很稳定，对多数宿主的生理无影响，是常用的报道基因.【实验目的】研究绿色荧光蛋白（Greed Fluorescent Protein，GFP）基因的基因克隆及在大肠杆菌中的表达.【研究意义】研究绿色荧光蛋白在大肠杆菌体内的基因克隆和表达.通过质粒重组形成所需要的重组质粒pET-28a-GFP，将重组质粒导入大肠杆菌体内，通过酶切、PCR及用IPTG诱导检测是否在大肠杆菌体内诱导表达成功。
绿色荧光蛋白的克隆实验汇报.
6、重组DNA的鉴定
1、含目的基因质粒DNA的提取
实验原理：
在PH为12.6的碱性环境下，利用细菌 染色体完全变性而质粒DNA为完全分离的 性质，再将溶液PH调至中性，质粒DNA恢 复原状，细菌线性DNA变为沉淀而除去
1、含目的基因质粒DNA的提取
实验步骤：
1. 收集细胞
2. 悬浮细胞
1.5mL 菌液12000rpm 菌体沉淀 250μl 剧烈震荡
实验原理：
转化技术的关键在于制备感受态细胞， 本实验是利用CaCl2转化法，细菌在低温，低 渗的溶液中，菌体细胞膨胀成球形，局部失 去细胞壁，外来DNA可形成粘合物黏附在细 胞表面，经过42℃短暂热冲击，使DNA复合 物进入细胞。
4、重组DNA的转化
热
实验步骤：
激
感受态细菌 100 l
＋
连接产物 混匀 10 l 冰浴中30分钟
它的这一些性质为生物学研究提供了 很好的标记分子，可以在黑暗的显微镜视 场中观察到细胞中的细胞器等结构，而且 还能够标记活细胞，使得活细胞中结构的 观察成为可能。
绿色荧光蛋白简介
下村修
马丁·沙尔菲
钱永健
他们因为在研究绿色荧光蛋白方面所作的 贡献而分享了2008年的诺贝尔化学奖
实验目的
掌握绿色荧光蛋白的基因克隆的一般步骤，加深 对基因克隆的认识，如：
2、PCR扩增目的基因
实验步骤：
① 94℃预变性5分钟后开始以下循环 ② 94℃ 30 秒
56℃ 30 秒 30 循环 72℃ 1 分钟 ③ 72℃ 7 分钟 ④ 4 ℃ 保温 实验过程约1小时50分钟
2、PCR扩增目的基因
电泳结果：
结果分析：
3、构建重组DNA
绿色荧光蛋白基因克隆及表达 结题报告
H2O 10XPCR Buffer EGFP-F EGFP-R dNTP rTap 菌 总体积
15μl 2.5μl 2μl 2μl 2μl 0.5μl 1μl 25μl
11.阳性菌株培养
等转板的菌长出以后,挑取2~3个阳性克隆 摇菌,37℃过夜。
12.重组质粒提取
(1)取已经培养好的含有pEGFP和pET-28a重组质粒1.5mL置于Eppendorf管中 ，以10000r/min离心1min，去掉上清；重复一次。然后将小管倒扣在吸水纸上 ，并用移液枪吸出多余的菌液，尽量除尽。加入150μL的GET缓冲液，充分混 匀，室温下放置10min。使用EDTA是为了除去细胞壁上的Ca2+，使溶菌酶更易 与细胞壁接触。
重复步骤上述步骤。将吸附柱Ca2放回收集管中，12000r/min离心 2min，室温放置数分钟，彻底除去漂洗液PW。将吸附柱Ca2，置于 室温10分钟，向吸附膜的中间位置悬空滴加适量洗脱缓冲液EB，室温 放置2min，12000r/min离心2min，收集DNA溶液。
6.连接反应
（1）将酶切后的片段用T4-DNA连接酶相 连 （2）16℃连接过夜。
试剂
溶液1－G.E.T缓冲液（pH8.0），溶液2－ 0.2mol/L NaOH, 1%SDS，溶液3－乙酸钾溶液 (3M, pH=4.8)，灭菌蒸馏水，pH7.5~8.0醋酸铵 （NH4Ac）7.5mol/L，异丙醇，70％乙醇，无水 乙醇，0.5 × TBE缓冲液，平衡液BL，溶胶液 PN，漂洗液PW，洗脱缓冲液EB，0.1 mol/L CaCl2溶液，卡那霉素100mg/ml，IPTG，2KB DNA Maker，6XLoading Buffer，酶反应终止 液(10 x Loading Buffer)，0.25%溴酚蓝， 10xPCR缓冲液，琼脂糖，NaAc，TE缓冲液， 酚氯仿，T4DNAligase及其缓冲液(10 x ligase Buffer)
分子生物学实验报告
分子生物学实验报告----绿色荧光蛋白(GFP)基因的克隆、表达和纯化一、实验背景绿色荧光蛋白（green fluorescent protein，GFP）是一类存在于包括水母、水螅和珊瑚等腔肠动物体内的生物发光蛋白。
当受到紫外或蓝光激发时，GFP发射绿色荧光。
它产生荧光无需底物或辅因子发色团是其蛋白质一级序列固有的。
GFP由3个外显子组成，长2.6kb；GFP是由238个氨基酸所组成的单体蛋白，相对分子质量为27.0 kMr，其蛋白性质十分稳定，能耐受60℃处理。
1996年GFP的晶体结构被解出，蛋白质中央是一个圆柱形水桶样结构，长420 nm，宽240 nm，由11个围绕中心α螺旋的反平行β折叠组成，荧光基团的形成就是从这个螺旋开始的，桶的顶部由3个短的垂直片段覆盖，底部由一个短的垂直片段覆盖，对荧光活性很重要的生色团则位于大空腔内。
发色团是由其蛋白质内部第65-67位的Ser-Tyr-Gly自身环化和氧化形成。
1996年GFP的晶体结构被解出，蛋白质中央是一个圆柱形水桶样结构，长420 nm，宽240 nm，由11个围绕中心α螺旋的反平行β折叠组成，荧光基团的形成就是从这个螺旋开始的,桶的顶部由3个短的垂直片段覆盖，底部由一个短的垂直片段覆盖，对荧光活性很重要的生色团则位于大空腔内。
实验使用的EGFP蛋白取自原核-真核穿梭质粒pEGFP-NB3B的蛋白质编码序列。
此质粒原本被设计于在原核系统中进行扩增，并可在真核哺乳动物细胞中进行表达。
本质粒主要包括位于PCMV真核启动子与SV40 真核多聚腺苷酸尾部之间的EGFP编码序列与位于EGFP上游的多克隆位点；一个由SV40 早期启动子启动的卡那霉素/新霉素抗性基因，以及上游的细菌启动子可启动在原核系统中的复制与卡那抗性。
在EGFP编码序列上下游，存在特异的BamH I及Not I限制性内切酶位点，可切下整段EGFP编码序列。
表达EGFP 蛋白使用的pET-28 原核载体包含有在多克隆位点两侧的His-tag polyHis 编码序列；用于表达蛋白的T7 启动子，T7 转录起始物以及T7 终止子；选择性筛选使用的lacI 编码序列及卡那霉素抗性序列，pBR322 启动子，以及为产生单链DNA 产物的f1 启动子。
南方医科大学分生实验-绿色荧光蛋白(EGFP)的基因克隆
绿色荧光蛋白（EGFP）的基因克隆南方医科大学学院摘要本实验旨在学习基因克隆并检验，绿色荧光蛋白基因转化入宿主细胞后很稳定，对多数宿主的生理无影响，是常用的报道基因，便于实验。
本实验通过将含有目的基因GFP的pEGFP-N1质粒和pMD18-T载体进行酶切、电泳、回收、连接、转入、筛选之后，把GFP基因成功导入到大肠杆菌DH5α(克隆菌)中，从而实现荧光蛋白基因的克隆和表达。
关键词：绿色荧光蛋白克隆表达实验名称绿色荧光蛋白的基因克隆2015- ~实验日期实验地点2015-合作者指导老师评分教师签名批改日期一、实验目的1.学习使用限制性内切酶进行DNA酶切的原理和方法。
2.学习掌握琼脂糖凝胶电泳的基本原理和操作方法。
3.掌握PCR技术原理和PCR仪的操作方法。
4.学习PCR产物的TA克隆的基本原理和操作步骤。
5.了解和掌握大肠杆菌的制备方法的基本原理和操作要点以及DNA转化大肠杆菌的原理和方法。
6.掌握双酶切法鉴定重组DNA的基本原理和操作步骤，以及菌落PCR鉴定重组DNA的基本原理和方法。
7.掌握IPTG诱导GFP基因表达的基本原理和操作步骤二、实验原理1.pEGFP-N1质粒2.T载体三、材料与方法：1.实验材料：质粒：pEGFP-N1T载体：pUCm-T菌种：DH5(克隆菌)PCR引物：F——GGCATATGGTGAGCAAGGGCGAR——CGGGATCCCTTGTACAGCTCGTCTm=56实验试剂：即用型蓝白T载体（pMD18-T vector cloning kit）快速DNA连接试剂盒限制性内切酶：EcoR I（Fermentas）Axygen质粒提取试剂盒抗生素：氨苄青霉素(Amp)、卡那霉素(Kan)X-gal、IPTG等实验仪器：超净工作台，恒温摇床，高压灭菌锅，恒温培养箱，台式高速离心机，大容量冷冻离心机，PCR仪，紫外分光光度计，水平电泳槽，垂直电泳槽，电泳仪，凝胶成像系统，制冰机、超低温冰箱等2.方法分离目的基因→限制酶切割目的基因与载体→连接重组体→转入受体细胞→筛选重组体、转化子四、实验具体流程1.获取外源基因1)碱裂解法提取质粒使用Axygen质粒提取试剂盒离心1300r pm,1min瞬时离心漩涡震荡颠倒数次悬浮沉淀颠倒数次离心放置3-5min 13000rpm,1min离心13000rpm,1min2)取0.2 ml PCR反应管一支，用微量加样枪按下述顺序分别加入各试剂(注意每换一种试剂换一个新吸头)：H2O 6μl质粒DNA（pEGFP-N1）2μl引物GFP1 (10μM) 1μl引物GFP2 (10μM) 1μlPremix Taq 10μl总体积20μl加完试剂后，将PCR反应管放到PCR仪上。
绿色荧光蛋白基因重组与鉴定
分子生物学综合性实验结题报告绿色荧光蛋白基因左xx1学 10110902014 10110904007 班 10G20专生物制药学生物医药摘要绿色荧光蛋白(green fluorescent protein)基因是一种重要的报告基因，将其和另外一种基因融合在一起，能检测到融合蛋白的表达情况。
本实验中我们使用BamH Ⅰ和Not Ⅰ从pEGFP-N3质粒上得到EGFP基因，再把它重组到pET-28ａ表达载体上，将重组体转化入DH5ａ菌种中进行培养，采取酶切发法鉴定的方法对转化的重组子进行鉴定。
关键词：绿色荧光蛋白；酶切；载体；Green fluorescent protein gene is a kind of important report gene, its and another gene fusion together, can detect the fusion protein expression. In this experiment we use BamH Ⅰand Not Ⅰfrom pEGFP - N3 plasmid get EGFP gene, again it restructuring to pET - 28 a expression vector and recombinant into DH5a strains in training and take enzyme cut hair method appraisal method to transform the restructuring of the child for identification.Keywords：Green fluorescent protein gene；enzyme cut；1..引言 ------------------------------5页2..应用前景 ------------------------------6页3..分子生物学实验原理 ------------------------------8页4..实验材料及试剂 ------------------------------12页5..实验流程 ------------------------------13页6..实验结果 ------------------------------19页7..分析 ------------------------------21页参考文献 -------------------------------22页致谢 ------------------------------ 23页附录 -------------------------------24页绿色萤光蛋白(green fluorescent protein)，简称GFP，是一类存在于水母﹑水螅何珊瑚等腔肠动物体内的生物发光蛋白,这种蛋白质最早是由普林斯顿大学的科学家下村修（Osamu Shimomura）等人在1962年在一种学名Aequorea victoria的水母中发现。
GFP实验报告
绿色荧光蛋白的克隆摘要：目的：研究绿色荧光蛋白基因的基因克隆。
方法：分别提取DH-5α(pEGFP-N1)和DH-5α(pMD-18T)质粒，将两个质粒酶切并连接形成重组质粒pMD-18T-GFP，将重组质粒导入DH-5α克隆菌中进行转化，用抗生素抗性筛选后，通过限制性核酸内切酶EcoR I 和 Hind III对所建质粒进行分析鉴定。
关键词：绿色荧光蛋白 DNA重组The cloning of green fluorescent proteinAbstract：Objective: Studies indicated the cloning of the GFP gene.Methods: Extract the plasmid of the DH-5α(pEGFP-N1) and DH-5α (pMD-18T). Then cutting by enzyme and connecting the two plasmids to form pMD-18T-GFP recombined plasmid. The recombinant plasmid confirmed by restriction enzyme and PCR was transferred into E.coli DH-5αto ensure the expression of green fluorescent protein. After resistant screening with antibiotics, analyze and identify the recombined plasmid.Keywords: Green Fluorescent Protein DNA recombination随着分子生物学和基因工程技术的迅速发展和广泛应用，重组DNA技术在发展蛋白质、多肽类药物与疫苗、转基因和基因敲除动物、HGP、基因诊断和基因治疗等方面得到广泛应用。
绿色荧光蛋白(GFP)基因的克隆、表达和粗提取
绿色荧光蛋白(GFP)基因的克隆、表达和粗提取欧阳学文南方医科大学预防医学（卫生检验检疫）摘要目的：研究绿色荧光蛋白（green fluorescent protein，GFP）基因在大肠杆菌中的基因克隆与重组表达，以及对其进行粗提取。
方法：从E.coli DH5ɑ中用碱提取质粒的方法提取质粒pEGFPN3和质粒pET28a。
然后用质粒DNA的琼脂糖凝胶电泳对已经提取的产物进行电泳，确定从大肠杆菌中成功提取了质粒。
再用限制性内切酶BamHI和NotI对成功提取的质粒进行酶切，并对酶切后的质粒进行琼脂糖凝胶电泳，用以确定已经提取了GFP基因。
将含有GFP基因的质粒转化到感受态细胞E.coli BL21中，用LB培养基对转化后的E.coli进行扩大培养。
用IPTG诱导GFP基因表达可以看到浅绿色菌落。
最后对绿色荧光蛋白进行粗提取。
结论：本实验有助于学生掌握最基本的分子生物学实验技术，为进一步的实验奠定基础。
关键词：绿色荧光蛋白基因克隆重组表达转化粗提取目录1 前言32 实验目的43 实验设备44 材料及试剂55 实验操作步骤55.1操作流程55.2质粒DNA的分离与纯化65.2.1 质粒的培养65.2.2 质粒的DNA的碱提取法65.2.3 质粒DNA的鉴定与纯化75.3酶切及连接85.3.1 双酶切85.3.2 回收酶切产物（采用DNA回收试剂盒进行回收）8 5.3.3 连接95.4大肠杆菌感受态细胞的制备及转化95.4.1 LB（LuriaBertain）液体和固体培养基的配制（参考附录）95.4.2．感受态细胞的制备 (CaCl2法)95.4.3 转化涂板105.5GFP蛋白的诱导表达105.6绿色荧光蛋白的粗提取11参考文献11附录121LB培养基的配制：122.溶液Ⅰ123.溶液Ⅱ124.溶液Ⅲ（100ML）125.DN ASEFREE RN ASE A136.TE缓冲液（P H8.0）137.20×TBE138.G ENE F INDER溴酚蓝上样缓冲液139．PEGFPN3质粒全图谱1310．P ET28A质粒全图谱141 前言绿色荧光蛋白（green fluorescent protein，GFP）是一类存在于包括水母、水螅和珊瑚等腔肠动物体内的生物发光蛋白。
分子生物学实验报告
分⼦⽣物学实验报告分⼦⽣物学实验报告----绿⾊荧光蛋⽩(GFP)基因的克隆、表达和纯化⼀、实验背景绿⾊荧光蛋⽩（green fluorescent protein，GFP）是⼀类存在于包括⽔母、⽔螅和珊瑚等腔肠动物体内的⽣物发光蛋⽩。
当受到紫外或蓝光激发时，GFP发射绿⾊荧光。
它产⽣荧光⽆需底物或辅因⼦发⾊团是其蛋⽩质⼀级序列固有的。
GFP由3个外显⼦组成，长2.6kb；GFP是由238个氨基酸所组成的单体蛋⽩，相对分⼦质量为27.0 kMr，其蛋⽩性质⼗分稳定，能耐受60℃处理。
1996年GFP的晶体结构被解出，蛋⽩质中央是⼀个圆柱形⽔桶样结构，长420 nm，宽240 nm，由11个围绕中⼼α螺旋的反平⾏β折叠组成，荧光基团的形成就是从这个螺旋开始的，桶的顶部由3个短的垂直⽚段覆盖，底部由⼀个短的垂直⽚段覆盖，对荧光活性很重要的⽣⾊团则位于⼤空腔内。
发⾊团是由其蛋⽩质内部第65-67位的Ser-Tyr-Gly⾃⾝环化和氧化形成。
1996年GFP的晶体结构被解出，蛋⽩质中央是⼀个圆柱形⽔桶样结构，长420 nm，宽240 nm，由11个围绕中⼼α螺旋的反平⾏β折叠组成，荧光基团的形成就是从这个螺旋开始的,桶的顶部由3个短的垂直⽚段覆盖，底部由⼀个短的垂直⽚段覆盖，对荧光活性很重要的⽣⾊团则位于⼤空腔内。
实验使⽤的EGFP蛋⽩取⾃原核-真核穿梭质粒pEGFP-NB3B的蛋⽩质编码序列。
此质粒原本被设计于在原核系统中进⾏扩增，并可在真核哺乳动物细胞中进⾏表达。
本质粒主要包括位于PCMV真核启动⼦与SV40 真核多聚腺苷酸尾部之间的EGFP 编码序列与位于EGFP上游的多克隆位点；⼀个由SV40 早期启动⼦启动的卡那霉素/新霉素抗性基因，以及上游的细菌启动⼦可启动在原核系统中的复制与卡那抗性。
在EGFP编码序列上下游，存在特异的BamH I及Not I限制性内切酶位点，可切下整段EGFP编码序列。
绿色荧光蛋白(GFP)基因地克隆、表达和粗提取
绿色荧光蛋白(GFP)基因的克隆、表达和粗提取南方医科大学2011预防医学（卫生检验检疫）摘要目的：研究绿色荧光蛋白（green fluorescent protein，GFP）基因在大肠杆菌中的基因克隆与重组表达，以及对其进行粗提取。
方法：从 E.coli DH5ɑ中用碱提取质粒的方法提取质粒pEGFP-N3和质粒pET-28a。
然后用质粒DNA的琼脂糖凝胶电泳对已经提取的产物进行电泳，确定从大肠杆菌中成功提取了质粒。
再用限制性内切酶BamHI和NotI 对成功提取的质粒进行酶切，并对酶切后的质粒进行琼脂糖凝胶电泳，用以确定已经提取了GFP基因。
将含有GFP基因的质粒转化到感受态细胞E.coli BL-21中，用LB培养基对转化后的E.coli进行扩大培养。
用IPTG诱导GFP基因表达可以看到浅绿色菌落。
最后对绿色荧光蛋白进行粗提取。
结论：本实验有助于学生掌握最基本的分子生物学实验技术，为进一步的实验奠定基础。
关键词：绿色荧光蛋白基因克隆重组表达转化粗提取1 前言 (3)2 实验目的 (4)3 实验设备 (4)4 材料及试剂 (5)5 实验操作步骤 (5)5.1操作流程 (5)5.2质粒DNA的分离与纯化 (6)5.2.1 质粒的培养 (6)5.2.2 质粒的DNA的碱提取法 (6)5.2.3 质粒DNA的鉴定与纯化 (7)5.3酶切及连接 (7)5.3.1 双酶切 (7)5.3.2 回收酶切产物（采用DNA回收试剂盒进行回收） (8)5.3.3 连接 (9)5.4大肠杆菌感受态细胞的制备及转化 (9)5.4.1 LB（Luria-Bertain）液体和固体培养基的配制（参考附录） (9)5.4.2．感受态细胞的制备 (CaCl2法) (9)5.4.3 转化涂板 (10)5.5GFP蛋白的诱导表达 (10)5.6绿色荧光蛋白的粗提取 (11)参考文献 (11)附录 (12)1LB培养基的配制： (12)2.溶液Ⅰ (12)3.溶液Ⅱ (12)4.溶液Ⅲ（100ML） (12)5.DN ASE-FREE RN ASE A (12)6.TE缓冲液（P H8.0） (12)7.20×TBE (13)8.G ENE F INDER-溴酚蓝上样缓冲液 (13)9．PEGFP-N3质粒全图谱 (13)10．P ET-28A质粒全图谱 (14)绿色荧光蛋白（green fluorescent protein，GFP）是一类存在于包括水母、水螅和珊瑚等腔肠动物体内的生物发光蛋白。
分子生物学试验设计报告-四川大学
分子生物学实验设计报告绿色荧光蛋白的克隆表达一、引言荧光蛋白是海洋生物体内的一类发光蛋白，分为绿色荧光蛋白、蓝色荧光蛋白、黄色荧光蛋白和红色荧光蛋白。
绿色荧光蛋白是由日本学者下村修于1962年从多管水母中发现并分离得到的一种发光蛋白。
它是由238个氨基酸构成的“ 3 -桶”型三维立体结构，其中65至67位氨基酸（丝氨酸-酪氨酸-甘氨酸）形成发光团，为主要的发光位置。
通过生物化学的方法将基因做小小的改变，就可以改变GFP中的氨基酸，得到变异GFP。
目前应用较多的GFP的突变体-增强型绿色荧光蛋白（简称EGFP）传统的PCR产物克隆方法主要有两种：一种是PCR引物设计时引入载体上的酶切位点，PCR产物经双酶切后定向克隆到目的载体上；另一种是TA载体连接。
这两种方法费时费力，过程繁冗。
而本实验采用的无缝克隆和组装技术是一种新的、快速、简洁的克隆方法，旨在克服上述缺陷，它可以在质粒的任何位点进行一个或多个目标DNA的片断的插入，而不需要任何限制性内切酶和连接酶。
突破传统的双酶切再加上连接，只需要一步重组法，即可得到高效率克隆的重组载体，这个重组载体能够在一定的宿主细胞中进行扩增，形成大量的子代分子。
研究绿色荧光蛋白在大肠杆菌体内的基因克隆和表达。
通过质粒重组形成所需要的重组质粒pET-28a-GFP，将重组质粒导入大肠杆菌体内，通过酶切、PCR及用IPTG诱导检测是否在大肠杆菌体内诱导表达成功。
菌液PCR是直接用菌液作为模板进行PCR的一种选取成功导入载体的菌落的方法，省时，快捷，但容易出现假阳性。
为了避免这种情况，我们需在设计引物时加上目的基因片段以及改进菌液处理方法。
、实验流程使用无缝克隆试剂盒或改进方法进行重组质粒的构建三、实验步骤1. 质粒DNA的提取1.1实验原理：1.1.1.质粒：一种染色体外的遗传因子，大小在1kb~200kb之间，是具有双链闭合环状结构的DNA分子，主要发现于细菌、放线菌和真菌细胞中。
绿色荧光蛋白基因克隆及表达结果分析
3 结果与分析3.1质粒提取用醋酸铵法提取pET-28a 和pEGFP-N3质粒后，进行琼脂糖电泳检测质粒是否提取成功。
得到电泳结果，如图一所示，3、4号泳道有明显清晰的条带说明pEGFP-N3提取成功。
1、2泳道同样有明显清晰的条带，说明pET-28a 提取成功。
3.2双酶切用BamH1和Not1分别对pEGFP-N3和pET-28a 双酶切。
1、2号泳道为pEGFP-N3的酶切结果，如图二所示，电泳会得到两条带，说明pEGFP-N3酶切成功。
4号泳道为pET-28a 的酶切产物的电泳有明显条带，证明酶切成功。
3.3 抗性筛选通过氯化钙法制备DH5α感受态细胞，用热激发将pET-28a-GFP 转入DH5α感图 1 pET-28a 和pEGFP-N3质粒提取电泳图1、2泳道为pET-28a 电泳结果 3、4号泳道为pEGFP-N3电泳结果图 2 BamH1、Not1双酶切 pEGFP-N3和pET-28a1、2号泳道为pEGFP-N3酶切产物 3号泳道为pEGFP-N3原始质粒 4号泳道为pET-28a 酶切产物 5号用泳道为pET-28a 原使质粒受态细胞。
转化重组质粒后涂平板，进行重组质粒的抗性筛选。
因为28a中含有抗卡那基因，所以筛选后可以得到含28a的重组质粒。
从图中可以看出1号平板长出较多菌落，说明DH5α感受态细胞存活。
2号平板无菌落生长，说明DH5α中不含抗卡那基因。
3号板生长出较少菌落，证明卡那有活性。
4号板无菌落生长。
失败原因其一可能是在倒了第一个平板加入卡那后，由于倒平板速度太慢，导致培养基凝固，影响了卡那的浓度和活性。
其二可能是在转化过程中，离心后，弃上清的过程中，将沉淀和上清混在了一起，影响了溶液的浓度。
图3重组质粒转化DH5α感受态细胞1号图为不含卡那的阴性对照2号图为含卡那的阴性对照3号图为含卡那的自提pET-28a的阳性对照4号图为含卡那的连接产物结果3.4PCR鉴定经PCR扩增后，进行琼脂糖凝胶电泳检测是否扩增成功，得到电泳结果如图四所示，结果表明，1、2泳道的条带约为700bp，说明成功扩增出含有GFP的基因。
绿色荧光蛋白分子实验
5、变性时间过长损害酶活性，过短靶序列变性不彻底，易造成扩增 失败。
6、循环数——过多易产生非特异扩增。
7、酶失活：需更换新酶，或新旧两种酶同时使用，以分析是否因酶 的活性丧失或不够而 导致假阴性。需注意的是有时忘加Taq酶或溴 乙锭。
8、引物：引物质量、引物的浓度、两条引物的浓度是否对称，是 PCR失败或扩增条带不 理想、容易弥散的常见原因。有些批号的引 物合成质量有问题，两条引物一条浓度 高，一条浓度低，造成低效 率的不对称扩增。
试验方法——热休克法
10 L载 体DNA
40L感 受态菌
On ice混合， 静置10min
200L转化液 +16ulIPTG+40u lX-Gal，涂含抗
菌素的平板
37℃摇1h
42ºC 45秒
加入1mL LB培养基
检验是否从大肠杆菌中提取出质粒DNA 的电泳图。
影响转化率的因素
➢细胞生长状态和密度:
糖的酶，最常用的β-半乳糖苷酶基因来自大肠杆菌lac操纵子 ，它们使载体中带有大肠杆菌lac操纵子的调节序列和编码β半乳糖苷酶N末端146个氨基酸的序列。用异丙基--D-半乳糖 苷(IPTG)可诱导这个末端片段的合成，合成的片段能与宿主 编码的β-半乳糖苷酶缺陷型进行互补，恢复该酶的活性，这 一过程称为α-互补。
影响因素：
1、dNTP的质量与浓度——dNTP的质量与浓度和PCR扩增效率有密 切关系，dNTP粉呈颗粒状，如保存不当易变性失去生物学活性。
2、模板（靶基因）核酸——模板核酸的量与纯化程度，是PCR成败 与否的关键环节之一。
3、Mg2+浓度——Mg2+对PCR扩增的特异性和产量有显著的影响， 在一般的PCR反应中，各种dNTP浓度为200umol/L时，Mg2+浓度为 1.5～2.0mmol/L为宜。Mg2+浓度过高，反应特异性降低，出现非特 异扩增，浓度过低会降低Taq DNA聚合酶的活性，使反应产物减少。
绿色荧光蛋白的基因克隆与表达论文
湖北师范学院分子生物学综合试验论文论文题目绿色荧光蛋白(GFP)基因的克隆和表达作者姓名樊恒达专业名称生物技术准考证号2008114020308指导教师王友如中国·黄石绿色荧光蛋白(GFP)基因的克隆和表达樊恒达（湖北师范学院生命科学学院0803班学号：2008114020308，湖北黄石）摘要目的：研究绿色荧光蛋白（green fluorescent protein，GFP）基因在大肠杆菌中的基因克隆与重组表达。
方法：从E.coli DH5ɑ中用碱法提取质粒的方法提取质粒pET-28a-GFP。
然后用质粒DNA的琼脂糖凝胶电泳对已经提取的产物进行电泳，确定从大肠杆菌中成功提取了质粒。
再用限制性内切酶BamHI和NotI对成功提取的质粒进行酶切，并用质粒DNA的琼脂糖凝胶电泳对酶切后的质粒进行电泳，用以确定已经提取的质粒中含有GFP基因。
将含有GFP基因的质粒转化到感受态细胞E.coli BL-21中，用LB培养基对转化后的E.coli进行扩大培养。
最后用IPTG诱导GFP基因表达可以看到浅绿色菌落。
结论：本实验对学生掌握最基本的分子生物学试验技术奠定了基础。
关键词：绿色荧光蛋白基因克隆重组表达转化Green Fluorescent Protein (GFP) Gene Cloning and ExpressionFan Hengda(class 3 grade 8, college of biology science ,Hubei Normal university, Huang Shi) : AbstractObjective:searching for the phenomenon of green fluorescent protein gene’s cloning and restructuring expression in the E.coli .Method:drawing plasmid pET-28a-GFP from E.coli DH5ɑ by using the method of Alkali Distillation .Then the selected production can be electrophored by using the AGE ,in order to make sure drawing successfully plasmid from E.coli. The selected plasmid is cutting by the extinction enzymes BamHI and NotI and the sliced plasmid can be electrophored by using the AGE in order to ensure the selected plasmid containing GFP gene .Converting the plasmid having gene of GFP into the feeling states E.c oli BL - 21 cells and cultivating it largely through the LB medium .Finally the IPTG can guide the expression of GFP gene and we can see light green clonies .Conclusion:This experiment sets up foundation for students to master the basical experimental technology of molecular biology .目录引言 (3)材料与方法 (3)1材料 (3)1.1材料 (3)1.2仪器 (3)1.3试剂 (3)2方法 (3)2.1重组质粒（pET-28a-GFP）的构建 (3)2.2碱法提取质粒 (4)2.3质粒DNA的琼脂糖凝胶电泳 (4)2.5.E.coliDH5α感受态细胞的制备及转化 (4)2.6 扩大培养 (4)2.7 GFP蛋白的诱导表达 (5)结果 (5)1实验现象 (5)1.1 碱法提取质粒 (5)1.2碱法提取质粒电泳 (5)1.3酶切质粒电泳 (5)1.4重组质粒的转化及阴阳性对照 (6)1.5 GFP蛋白的诱导表达结果 (6)1.6 紫外灯下看到的绿色荧光蛋白 (7) (7)讨论 (7)参考文献 (8)引言：2008年10 月 8日，瑞典皇家科学院把今年的诺贝尔化学奖授予绿色荧光蛋白（GFP）的发现者和推广者。
分子生物学实验设计报告绿色荧光蛋白的克隆表达
分子生物学实验设计报告绿色荧光蛋白的克隆表达陶成秋20杨晨20一、引言基因标记技术是近年来发展起来的分子生物学技术。
荧光蛋白基因在标记基因方面由于具有独特的优点而广受科学家们的关注。
荧光蛋白是海洋生物体内的一类发光蛋白，分为绿色荧光蛋白、蓝色荧光蛋白、黄色荧光蛋白和红色荧光蛋白。
绿色荧光蛋白（green fluorescent protein，GFP）是一类存在于包括水母、水螅和珊瑚等腔肠动物体内的生物发光蛋白，共27kD，由238个氨基酸构成。
当受到紫外或蓝光激发时，GFP发射绿色荧光。
它产生荧光无需底物或辅因子，发色团是其蛋白质一级序列固有的。
基因克隆技术包括把来自不同物的基因同有自主复制能力的载体DNA在体外人工连接，构建成新的重组DNA，然后送入受体生物中去表达，从而产生遗传物质和状态的转移和重新组合。
采用重组DNA技术，将不同来源的DNA分子在体外进行特异性切割，重新连接，组装成一个新的杂合DNA分子。
在此基础上，这个杂合分子能够在一定的宿主细胞中进行扩增，形成大量的子代分子。
研究绿色荧光蛋白在大肠杆菌体内的基因克隆和表达。
通过质粒重组形成所需要的重组质粒pET-28a-GFP，将重组质粒导入大肠杆菌体内，通过酶切、PCR及用IPTG诱导检测是否在大肠杆菌体内诱导表达成功。
根据电泳结果及荧光现象得出结论，重组质粒在大肠杆菌体内成功诱导表达。
二、实验流程三、具体实验方案实验一、质粒DNA的提取1.实验原理：1）质粒(Plasmid)是一种染色体外的遗传因子，大小在1kb~200kb之间，是具有双链闭合环状结构的DNA分子，主要发现于细菌、放线菌和真菌细胞中。
质粒具有自主复制能力，，能使子代保持他们恒定的复制数，可表达它携带的遗传信息。
它可以独立游离于细胞质内，也可以整合到细菌染色体中，它离开宿主细胞就不能复制，而它控制的许多生物学功能也是对宿主细胞的补偿。
2）从大肠杆菌中抽提质粒DNA的方法很多，可以在实验中根据不同的需要采用不同的方法。
阿拉伯糖诱导绿色荧光蛋白的表达
分子生物学实验报告阿拉伯糖诱导绿色荧光蛋白的表达阿拉伯糖诱导绿色荧光蛋白的表达摘要绿色荧光蛋白(green fluorescent protein)，简称GFP，这种蛋白质最早是由下村修等人在1962年在一种学名Aequorea victoria的水母中发现。
绿色荧光蛋白（GFP）基因来自海底生物多孔水母，该基因表达产物在紫外光照射下可发出绿色荧光。
现已将该基因克隆到阿拉伯糖启动子驱动的原核表达pGLO中，通过阿拉伯糖的诱导，可使该基因在细菌中进行表达。
GFP融合蛋白的荧光灵敏度远比荧光素标记的荧光抗体高，抗光漂白能力强，因此更适用于定量测定与分析。
关键字：绿色荧光蛋白阿拉伯糖操纵子前言由水母Aequorea victoria中发现的野生型绿色荧光蛋白，395nm和475nm分别是最大和次大的激发波长，它的发射波长的峰点是在509nm，在可见光绿光的范围下是较弱的位置。
由海肾（sea pansy）所得的绿色荧光蛋白，仅有在498nm 有一个较高的激发峰点。
在细胞生物学与分子生物学领域中，绿色荧光蛋白基因常被用作为一个报导基因(reporter gene）。
一些经修饰过的型式可作为生物探针，绿色荧光蛋白基因也可以克隆到脊椎动物（例如：兔子上进行表现，并拿来映证某种假设的实验方法。
2008年10月8日，日本科学家下村修（伍兹霍尔海洋生物学研究所）、美国科学家马丁·查尔菲（哥伦比亚大学）和钱永健（加利福尼亚大学圣迭戈分校）因为发现和改造绿色荧光蛋白而获得了当年（2008）的诺贝尔化学奖。
实验目的1.学习用诱导物诱导外源基因的表达。
2.学习感受态细胞的制备和转化。
实验材料、试剂及仪器实验材料GFP质粒DNA、感受态大肠杆菌实验试剂实验仪器恒温摇床、无菌操作台（含酒精灯.）、紫外灯、灭菌锅、电泳仪、1.5ml 离心管、培养皿、PCR扩增仪、台式离心机、紫外分析仪恒温水浴、冷冻离心机、平衡天平、微量移液器等实验步骤<一>GFP质粒DNA的提取与P38质粒提取方法相同。
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南方医科大学绿色荧光蛋白的克隆实验报告年级专业 2014级生物技术姓名朱旭峰学号 3147020042摘要细菌质粒是一类双链、闭环的DNA，大小范围从1kb至200kb以上不等。
各种质粒都是存在于细胞质中、独立于细胞染色体之外的自主复制的遗传成份，通常情况下可持续稳定地处于染色体外的游离状态，但在一定条件下也会可逆地整合到寄主染色体上，随着染色体的复制而复制，并通过细胞分裂传递到后代。
质粒已成为目前最常用的基因克隆的载体分子，重要的条件是可获得大量纯化的质粒DNA分子。
目前已有许多方法可用于质粒DNA的提取，下面主要介绍碱裂解法提取质粒DNA的方法。
Cloning of green fluorescent proteinAbstract：Bacterial plasmid is a kind of double chain, closed-loop DNA, ranging from 1KB to 200kb. All plasmid is present in the cytoplasm, independently from the chromosome of autonomously replicating genetic component, usually under the condition of sustainable and stable in staining in the free state, but under certain conditions will irreversibly integrated into the host chromosome, with the replication of the chromosome replication and by cell split passed on to future generations.Plasmids have become the most commonly used gene cloning vector molecules, the important condition is to obtain a large number of purified plasmid DNA molecules. There are many methods can be used to extract plasmid DNA, the following are mainly introduced the method of extracting plasmid DNA by alkaline lysis method.关键词 GFP 质粒提取感受态细菌细菌转化1.前言碱裂解法是一种应用最为广泛的制备质粒DNA的方法，纯化质粒DNA的方法通常是利用了质粒DNA相对较小及共价闭环两个性质。
例如，氯化铯-溴化乙锭梯度平衡离心、离子交换层析、凝胶过滤层析、聚乙二醇分级沉淀等方法，但这些方法相对昂贵或费时。
对于小量制备的质粒DNA，经过苯酚、氯仿抽提，RNA酶消化和乙醇沉淀等简单步骤去除残余蛋白质和RNA，所得纯化的质粒DNA已可满足细菌转化、DNA片段的分离和酶切、常规亚克隆及探针标记等要求，故在分子生物学实验室中常用。
2.实验目的2.1.学习碱裂解法提取质粒的原理质粒是一种染色体外的稳定遗传因子，具有双链闭环结构的DNA分子。
它具有自主复制能力，能使子代细胞保持它们恒定的拷贝数，可表达它携带的遗传信息。
目前，经人工改造的质粒已广泛用基因工程中目的基因的运载工具——载体。
质粒DNA的提取是依据质粒DNA分子较染色体DNA分子小，且具有超螺旋共价闭合环状的特点，从而将质粒DNA与大肠杆菌染色体DNA分离。
现在常用的方法有：碱裂解法、密度梯度离心法、煮沸裂解法等。
实验室普遍采用的碱裂解法具有操作简便、快速、得率高的优点。
其主要原理：利用染色体DNA与质粒DNA的变性与复性的差异而达到分离的目的。
在碱变性条件下，染色体DNA的氢键断裂，双螺旋解开而变性，质粒DNA氢键也大部分断裂，双螺旋也有部分解开，但共价闭合环状结构的两条互补链不会完全分离，当pH=4.8的乙酸钠将其pH调到中性时，变性的质粒DNA又恢复到原来的构型，而染色体DNA不能复性，形成缠绕的致密网状结构，离心后，由于浮力密度不同，染色体DNA 与大分子RNA、蛋白质-SDS复合物等一起沉淀下来而被除去。
2.2.掌握蓝白斑筛选的实验方法及原理蓝白斑筛选是重组子筛选的一种方法：是根据载体的遗传特征筛选重组子，如α-互补、抗生素基因等。
现在使用的许多载体都带有一个大肠杆菌的DNA的短区段，其中有β-半乳糖苷酶基因（lacZ）的调控序列和前146个氨基酸的编码信息。
在这个编码区中插入了一个多克隆位点（MCS），它并不破坏读框，但可使少数几个氨基酸插入到β-半乳糖苷酶的氨基端而不影响功能，这种载体适用于可编码β-半乳糖苷酶C端部分序列的宿主细胞。
因此，宿主和质粒编码的片段虽都没有酶活性，但它们同时存在时，可形成具有酶学活性的蛋白质。
这样，lacZ基因在缺少近操纵基因区段的宿主细胞与带有完整近操纵基因区段的质粒之间实现了互补，称为α-互补。
由α-互补而产生的LacZ+细菌在诱导剂IPTG的作用下，在生色底物X-Gal存在时产生蓝色菌落，因而易于识别。
然而，当外源DNA插入到质粒的多克隆位点后，几乎不可避免地导致无α-互补能力的氨基端片段，使得带有重组质粒的细菌形成白色菌落。
这种重组子的筛选，又称为蓝白斑筛选。
如用蓝白斑筛选则经连接产物转化的钙化菌平板37℃温箱倒置培养12-16hr后，有重组质粒的细菌形成白色菌落。
3.实验原理3.1.碱裂解法1)基于染色体DNA与质粒DNA的变性与复性的差异；2)高碱性条件下，染色体DNA和质粒DNA变性；3)当以高盐缓冲液调节其pH值至中性时，变性的质粒DNA复性并保存在溶液中，染色体DNA不能复性而形成缠连的网状结构，通过离心形成沉定去除；3.2.离心层析柱1)硅基质膜在高盐、低pH值状态下选择性地结合溶液中的质粒DNA；2)去蛋白液和漂洗液将杂质和其它细菌成分去除；3)低盐，高pH值的洗脱缓冲液将纯净质粒DNA从硅基质膜上洗脱；3.3.感受态细菌的制备（CaCl2法）1)挑取一DH5α单菌落于2.5ml LB培养液中37℃过夜培养2)取其中500 µl菌液于一含50mlLB培养液的锥形瓶中，37℃振摇培养至OD600值达到0.3-0.4之间（旋转摇床200～300r/min，培养液调零，每隔20～30min测量）3)取50ml菌液置于离心管内，4 ℃ 4500g离心5分钟溶液，摇荡重悬细胞，冰浴30分钟4)加入30ml ,100mM的冰冷CaCl2溶液轻轻悬浮细胞，5)4℃ 4500g离心5分钟收集细胞后，加2 ml ,100mM的冰冷CaCl2冰上放置几分钟,即成感受态细胞悬液。
6)感受态细胞分装成100 µl的小份，暂且不用的贮存于-70℃可保存半年。
取其中一份进行转化。
3.4.重组DNA的鉴定（酶切）1)质粒DNA三种构型：1.共价闭环超螺旋2.线性3.开环的双链环状2)在琼脂糖凝胶电泳中的迁移率：3)共价闭环超螺旋DNA＞线性DNA＞开环的双链环状DNA3.5.琼脂糖凝胶电泳方法1)凝胶准备① 称2g琼脂糖置三角瓶中，加0.5×TBE 200ml ；② 盖上牛皮纸，用橡皮筋捆紧③微波炉加热n次，直至融解，1min/次，中高温（一般3~5次）；2)胶床准备① 将梳子垂直插入到胶床的小凹槽内，梳齿底端和床面有1mm的间隙；② 将胶床放在调整好的水平台上；3)铺胶：将冷却至60℃的凝胶加入20 µl荧光染料(有毒)倒入准备好的胶床内，凝胶厚度约5 mm；4.实验设备恒温培养箱、恒温摇床、超净工作台、台式离心机、高压灭菌锅5.实验材料及试剂5.1.试剂的配制LB培养基（液体、固体）Bioteke质粒提取试剂盒（北京百泰克，中国）S1;50mmol/L 葡萄糖 25mmol/L Tris·Cl(pH8.0) 10 mmol/L EDTA (pH8.0) 2mg/mL溶菌酶S2;0.2 mol/ L NaOH 1% SDSS3:5mol/L 乙酸钾 60 ml冰乙酸 11.5ml水 28.5ml5.2.材料的处理含pEGFP-N1质粒的大肠杆菌DH5αa琼脂糖凝胶的制备上样：每孔上一个样品，加样前，样品先与6×上样缓冲液混匀(如预加有染料物质，可省此步)电泳：电压80~120v；20~30min结果观察：凝胶成像仪6.实验操作步骤6.1.小实验一:质粒提取6.2.小实验二取0.2 ml PCR反应管一支，用微量加样枪按下述顺序分别加入各试剂(注意每换一种试剂换一个新吸头)：PCR反应体系H2O 6µl质粒DNA（pEGFP-N1）2µl引物GFP1 (10µM) 1µl引物GFP2 (10µM) 1µlPremix Taq 10µl总体积20µl如配好的反应液较多沾到管壁上，可将PCR反应管置离心机中瞬时离心，使反应液集中于管底，然后将反应管放到基因扩增仪(PCR仪)上① 94℃预变性5分钟后开始以下循环② 94℃ 30 秒56℃ 30 秒 30 循环72℃ 1 分钟③ 72℃ 7 分钟④ 4 ℃保温实验过程约1小时50分钟琼脂糖凝胶电泳操作•琼脂糖凝胶的制备•上样：每孔上一个样品，加样前，样品先与6×上样缓冲液混匀(如预加有染料物质，可省此步)•电泳：电压80~120v；20~30min•结果观察：凝胶成像仪6.3.小实验三感受态细菌制备和T连接连接反应体系实验组①对照组②即用型蓝白T载体 1 µl 1 µlPCR扩增产物Control Insert DNA 快速连接缓冲液(2X) 1 µl-----5 µl-----1 µl5 µl超纯水-ddH2O 2.5 µl 2.5 µl Rapid T4 DNA ligase 0.5 µl 0.5 µl 总体积10 µl 10 µl重组DNA的转化感受态细菌制备1.挑取一DH5α单菌落于2.5ml LB培养液中37℃过夜培养2.取其中500 µl菌液于一含50mlLB培养液的锥形瓶中，37℃振摇培养至OD600值达到0.3-0.4之间（旋转摇床200～300r/min，培养液调零，每隔20～30min 测量）3.取50ml菌液置于离心管内，4 ℃4500g离心5分钟4.加入30ml ,100mM的冰冷CaCl2溶液，摇荡重悬细胞，冰浴30分钟5.4℃4500g离心5分钟收集细胞后，加2 ml ,100mM的冰冷CaCl2溶液轻轻悬浮细胞，冰上放置几分钟,即成感受态细胞悬液。