胚胎及卵母细胞的冷冻保存技术共26页文档
人类卵母细胞与胚胎玻璃化冷冻中国专家共识(2023年)版解读 PPT课件
操作步骤详解及注意事项
01
注意事项
02
严格遵循无菌操作规范，确保操作环境清洁。
03
选择合适的冷冻载体和平衡液，以提高冷冻效果。
操作步骤详解及注意事项
控制降温和解冻速率，避免细胞内冰 晶形成和渗透性损伤。
VS
对冷冻后的卵母细胞进行定期检测， 确保其质量和活性。
03
胚胎玻璃化冷冻技术及操作规范
胚胎来源及质量评估标准
考核方式
采用理论考试和实际操作考核相结合的方式 ，全面评估操作人员的技能水平。
持续改进
定期对操作人员进行培训和考核，不断提高 操作技能和水平。
质量监测指标设立及持续改进方案
监测指标
包括冷冻存活率、复苏率、受精 率等关键指标，以及实验室环境 、设备性能等质量相关指标。
数据统计与分析
定期对监测数据进行统计和分析 ，评估冷冻胚胎的质量和实验室 运行状况。
胚胎冷冻
在辅助生殖技术中，对多余胚胎进行玻璃化 冷冻，以备后续移植使用，提高妊娠率。
生育力保存项目中价值体现
要点一
年轻癌症患者生育力保存
要点二
高龄女性生育力保存
通过玻璃化冷冻技术保存卵母细胞或胚胎，为年轻癌症患 者提供生育希望。
针对高龄女性，通过冷冻卵母细胞实现生育力保存，延缓 生育年龄限制。
成功案例分享和经验总结
实验室自动化
03
提高操作效率和准确读
伦理和法规关注
对基因编辑和人工智能等技术的监管政策可能收 紧。
辅助生殖纳入医保
政策推动下，更多患者可能获得治疗机会。
商业化运作规范
政策法规对辅助生殖行业的商业化运作进行规范 。
持续改进方向和目标设定
提高冷冻效率和复苏率
冷冻卵子技术
冷冻卵子技术戴致远12307130175简介冷冻卵子，又称雪藏卵子，即取母体健康时的卵子冷冻，阻止卵子随人体衰老，待想生育时取出冷冻的卵子使用即可。
冷冻卵子的技术本身并不成熟，即使可以冷冻、复苏、形成受精卵，胚胎。
主要方式保存卵子有两种方式。
慢速冷冻法，即把卵子储存在脱水的溶液中，然后用电脑系统让它慢慢冷冻起来，最后封存在超冷的液化氮中。
[3]另一种是玻璃化冷冻法，即把卵子放进高浓度渗透液中，然后立即储存到液氮中。
冷冻卵子保存后，待想生育时取出冷冻的卵子，解冻后即可进行体外受精最终获得胚胎。
流程(原理)01试管婴儿登记、体检：我们国家的生殖中心只允许为做试管婴儿的妇女冷冻卵子，如果有多余的卵子，且夫妻双方都同意，也可以进行捐赠。
冷冻卵子之前需要进行相关的身体检查。
02打排卵针、取卵：如果要想取卵，首先要在促性腺激素促卵发育后，给女性打促卵泡成熟的针。
大约36小时后，医生会在B超引导下，经过阴道穿到卵巢内，把卵泡的卵泡液吸出来。
通过B超可以看到，一团透明的像水晶球一样的物质就是卵泡，卵泡中孕育着成熟的卵子。
取卵手术通常不超过10分钟。
03卵泡液送至实验室：医生把卵泡液吸出来至试管中，迅速通过窗口传递到实验室中的显微镜下。
冻卵的过程全部在实验室里进行操作。
卵子很娇气，怕光、怕冷、怕热，所以整个取卵过程，必须在暗环境下迅速完成。
04提取出卵母细胞：卵子细胞悬浮在卵泡液中，实验室的技术人员首先会在显微镜下，把卵泡液中的卵子细胞分离出来。
05卵子脱水：实验室的工作人员把卵子放进高度浓缩的脱水冷冻保护溶液中进行脱水。
06迅速放入有液氮的专用容器中：脱水后的卵子立即投入液氮中，此种方式称之为玻璃化冷冻。
07转移：此时的液氮容器无法永久保存，还需转移至液氮罐中。
08放入液氮罐中：卵子被转移至零下198℃的液氮罐中长期保存，每一份卵子都有相应的编号，便于日后使用。
09使用时进行复温：若干时间后，当妇女需要使用卵子时，专业技术人员从液化氮中取出卵子，复温，用溶液清除掉卵子所用的化学物质。
胚胎冷冻保存技术
胚胎冷冻保存技术摘要; 胚胎冷冻保存技术可使胚胎移植不受时间地点的限制，从而达到提高胚胎移植效率的目的。
研究和优化胚胎冷冻保存技术对胚胎工程的发展有重要的意义。
关键词：胚胎冷冻保存为便于长途运输和随时供移植使用，将那些６～７日龄已有２０～３０个细胞的新鲜活胚胎（或分割后的半胚胎、１／４胎）在－１９６℃的超低温下冷冻贮存就是胚胎冷冻保存技术。
这是在冷冻精子的技术基础上进一步发展起来的一项新技术。
目前用冷冻胚胎移植的成功率约为鲜胚胎的７０％～８０％，胚胎冷冻保存技术可使胚胎移植不受时间地点的限制，从而达到提高胚胎移植效率的目的。
现有的胚胎冷冻保存方法有四种：一、常规冷冻法常规冷冻法：也叫慢速冷冻法、逐步降温法。
将采集到的胚胎用培养液洗涤后置入有不同冷冻保护剂(甘油或二甲亚枫(DMSO)等)浓度的三种冷冻液中(冷冻液浓度由低到高，最终浓度1．4M)，每种冷冻液中平衡5分钟，然后将胚胎和冷冻液装入细管中封口、标记，放入冷冻仪中进行冷冻。
冷冻速率先以1～3~C／分下降至-6～-7℃，在此温度诱发结晶，平衡10分钟，然后，以0．3℃／分的速率降温至-35～_38℃，之后投入液氮中保存。
胚胎解冻后，需按胚胎进入冷冻液时的相反浓度，即从高到低浓度脱除冷冻保护剂，每步5分钟，最后置入含20％血清的PBS保护液中洗涤3次，彻底脱除冷冻保护剂。
或者将解冻后的胚胎放入0．5M(或1．0M)的蔗糖溶液中平衡10分钟，再用上述PBS液洗涤3次。
二、一步冷冻法一步冷冻法：也叫一步细管法。
该方法是由慢速冷冻法改进而来，细管内的冷冻液和蔗糖液是分开的，因此，在细管内用蔗糖液可一步脱除甘油抗冻剂，从而利于在生产中推广应用。
三、程序冷冻法程序冷冻法主要采用低浓度冻结保存剂梯度脱水,经程序冷冻仪缓慢降温。
主要操作步骤包括:将细胞顺序放入一系列逐渐增加保存剂浓度的溶液中梯度脱水,置入程序冷冻仪快速降温至-6℃植冰(人工诱导冰晶形成),然后程序冷冻仪缓慢降温至-30℃~-80℃后液氮贮存。
胚胎冷冻技术
人类胚胎冷冻的应用现状
到目前为止,超低温冷冻人的体外受精(IVF)胚 胎,在国内外均获得成功。 2004年,意大利学者应用ICSI对慢速冷冻卵母 细胞与冻融睾丸精子受精后再次冻存多余胚胎,解 冻胚胎移植后分娩一健康女婴,为世界首例。 北京大学第三医院生殖医学中心应用冷冻精 液中精子、冷冻卵母细胞、冷冻胚胎即“三冻” 技术,成功获得世界第2例、我国第1例“三冻”婴 儿。并在卵母细胞冷冻技术方而,采用了与世界首 例不同的简捷的玻璃化冷冻卵母细胞的方法。
另外,从理论上讲,冷冻胚胎可长期 保存,但对于保存过程中胚胎细胞是否 发生老化的问题还缺乏直接的实践证 据;对于冷冻效果鉴定,主要采用形态学 方法鉴定冻胚质量,对其移植后的发育 潜力无法判断。
• 在多种冷冻方法中,现较多采用慢速冷 冻、快速溶解方法,但是其他方法也有 其自身优点。因此,在实验中应综合考 虑多方面因素,根据具体的胚胎情况选 择恰当的方法。
胚胎冷冻技术
发展历史
• 胚胎冷冻保存的研究起始于20世纪50年代， 当时Smith用甘油坐防冻剂，保存兔胚胎获 得成功。
• 1971年Whittingham用慢速冷冻方法获得小 鼠胚胎的成功保存。 • 1978年willadsen建立了快速冷冻方法。 1984年Takeda等采用一步冷冻方法首次冷 冻小鼠胚胎获得成功。
临床应用
应充分重视高浓度玻璃化冷冻溶液对胚 胎的毒性作用,合理选择玻璃化冷冻溶液,严 格控制胚胎和玻璃化冷冻溶液接触的总时间。 目前较简单的玻璃化溶液的组成是25%甘油、 25%PROH或25%乙二醇。 玻璃化冷冻技术正处于实验研究到临 床应用的过渡阶段,随着玻璃化冷冻方法的 逐渐成熟,有望成为程序冷冻方法外的另一 种选择。
医疗应用
• 若有剩余的质量较好的胚胎，可以冷冻保存，待 以后自然周期或人工周期解冻后植入子宫腔内， 将增加受孕的机会。 • 可用于一个超排卵周期得到的胚胎数量多，质量 好，不能一次全部移植，可将多余的胚胎冷冻保 存。 • 以及发生严重卵巢过度刺激综合征的患者，不宜 在治疗周期移植胚胎者，可将胚胎冷冻，待以后 的自然周期或人工周期进行胚胎复苏移植。
卵母细胞的冷冻技术
一、冷冻技术概述
2.细胞损伤假说
冷冻损伤是卵母细胞冷冻保存的主要障碍，有报 道认为冷冻常会使细胞膜，透明带发生变化，细胞骨 架被破坏，染色体出现异常等。
一、冷冻技术概述
1.2冷冻保护剂分为渗透性和非渗透性两种
①渗透性冷冻保护剂主要有丙二醇（PROH）、二
甲基亚砜（DMSO)、甘油和乙二醇(EG)等。 渗透性冷冻保护剂主要通过细胞膜，降低溶液的冰 点，增加溶液的粘性，稀释溶液中的溶质浓度。
一、冷冻技术概述
②非渗透性冷冻保护剂主要有蔗糖、葡萄糖和脂蛋白等。
研究发现包裹卵母细胞的卵丘细胞层数越多，解冻 后卵母细胞存活率越高。Jack等比较冷冻GV期卵母细 胞前后变化，发现致密的COC与裸卵相比具有较高的成 熟率。可能是卵丘细胞参与了卵母细胞的成熟，如果去 除卵丘细胞，成熟率则会大幅度降低。
三、实验
⑴冷冻方法与保护剂对牛卵母细胞解冻后细胞 发育的影响
1.卵母细胞的采集与成熟培养
一、冷冻技术概述
随着生物学、医学和低温制冷技术的发展，低温冷冻 技术已逐渐形成的一门边缘学科低温生物学，该领域主 要应用是在保存各种细胞、组织、胚胎、器官甚至是活 体的冷冻保存。 在超低温条件下动物种质细胞之所以能长期保存，是 因为种质细胞内一切新陈代谢过程中的化学变化被超低 温所抑制，当温度降到一定限度时，细胞内所有的化学 变化也就处于一种“暂停”状态而使细胞得以长期保存； 低温保存的细胞以一定的方式复苏后，又具有存活的能 力。
动物繁殖基础课程教学大纲
动物繁殖基础课程教学大纲第一部分大纲说明一、本课程的性质和任务本课程是中央广播电视大学“一村一名大学生计划”高等专科养殖类各专业的专业基础课。
其主要任务是使学生通过对本课程的学习，掌握畜禽生殖生理的基础理论知识、主要繁殖技术及其繁殖管理方法，为专业课的学习打下基础。
二、本课程的教学基本要求繁殖是动物生产过程中的关键环节。
现代繁殖技术是提高畜禽繁殖力的主要手段，也是改进畜禽品质、提高其生产性能的必要措施，是增加畜牧业生产经济效益的重要途径。
此外，繁殖控制技术的进展和应用也为现代集约化畜牧业解决了一系列生产组织、计划管理方面的问题。
作为研究畜禽繁殖的学科，动物繁殖基础主要内容包括生殖激素、公母畜的生殖生理、人工授精技术、受精、妊娠与分娩、繁殖控制技术与胚胎工程、繁殖力等内容。
教学基本要求包括掌握畜禽生殖生理的普遍规律及其种属特征，掌握和运用这些规律指导畜禽的繁殖实践；了解现代繁殖技术的理论基础和操作技术及其繁殖管理方法。
三、本课程的教学方法和教学形式由于本课程是一门紧密联系生产实际的学科，理论和实践技能都不能偏废。
学习过程中应以文字教材为基础，掌握动物繁殖学中的基本概念和基本理论；结合观看录像教材（电视课），以进一步了解、掌握现代繁殖技术的操作和要求。
在实验和教学实习中多观察、多了解，并通过实际操作掌握主要的繁殖技术操作。
四、课程教学要求的层次本课程按“了解”、“掌握”、“重点掌握”三个层次对学生的学习进行要求。
考核难度及题量的梯度对应于教学要求的三个层次，未作具体要求的教学内容不作考核要求。
五、学时分配本课程总学时为90学时，5学分，其中录像教材（电视课）17学时，课程学习指导录像课2学时，实验课15学时，另安排一周教学实习，具体学时分配如下：章次教学内容总学时分配录像教材（电视课）学时分配绪论1学时0.5学时第一章家畜的生殖器官3学时0学时第二章生殖激素4学时1学时第三章母畜生殖生理6学时 2.5学时第四章公畜生殖生理6学时 2.5学时第五章人工授精技术6学时2学时第六章受精、妊娠与分娩8学时4学时第七章繁殖控制技术与胚胎工程8学时 3.5学时第八章繁殖力3学时1学时实验与实习45学时课程学习指导2学时合计90学时18学时第二部分教学内容和教学要求绪论(1学时)●教学内容动物繁殖的目的、任务和要求，同其它学科的关系，动物繁殖科学进展概况。
卵母细胞和胚胎玻璃化冷冻方法
卵母细胞和胚胎玻璃化解冻方法用途：本品用于卵母细胞和胚胎的玻璃化解冻配套。
安全解冻配套：1.1瓶4ml解冻液（TS）2.1瓶1.5ml稀释液(DS)3.1瓶1.5ml 冲洗液(WS)4.1个25mm 的培养皿(用于解冻液)5.1个6孔生殖板使用说明准备：*用载体和生殖板将解冻液放到37℃的培养箱里加温—将所有解冻液倒入生殖板里。
*用微细管吸取DS,WS1和WS2各300ul，放进培养皿。
注意：用巴斯德管吸取一个大小合适的卵母细胞（直径：140um）或者胚胎(直径：140-180um)解冻：1.迅速地将载体顶放进解冻液中，浸泡1分钟。
（图一）2.用巴斯德管吸取卵母细胞（胚胎），轻轻地将其放入DS底部，浸泡3分钟。
（图二）3.用巴斯德管吸起卵母细胞（胚胎），轻轻地将其放入WS1 底部，浸泡5分钟。
（图三）4.用巴斯德管吸起卵母细胞（胚胎），轻轻地将其放入WS2 顶部，当卵母细胞（胚胎）自动沉到底部的时候，重新再重复这一步骤。
（图四）5.将卵母细胞（胚胎）转移到装有合适培养液的培养皿中。
放进37℃的培养箱中完成恢复。
注意：卵母细胞要放置2小时，胚胎则要3小时。
质量控制测试：每一批安全解冻配套都得到以下测试：*溶液：UPS不孕不育无菌测试（SAL 10-3）LAL拉尔内毒素测试小老鼠胚胎试验（一个细胞）保存方法：*保存于4-8℃*在标签所示有效日期前，本品性质稳定。
成分：*血清替代补充*基本培养基M-199 内含的HEPES*蔗糖参考文件（此部分请看原件）.玻璃化第一部分：所需材料*玻璃化配套No.0 基础液（BS）：1.5ml x1 (只用于卵母细胞玻璃化冷冻)No.1 稀释液（ES）: 1.5ml x1No.2 玻璃化溶液（VS）: 1.5ml x2*冷冻管x4, 建议每个冷冻管最多储存3个卵母细胞或者3个胚胎*复制板x2: 6孔*冷却架(蓝盒液氮，型号：VT-CLB)*巴斯德管（型号：MT-150）*显微镜（关掉加热板）*秒表或计算器（带计算功能）*液氮（消毒过滤功能，聚四氟乙烯滤膜过滤）*镊子*显微针x2: 2-20ul, 100-1000 ul*罐子*储存罐注意：使用的巴斯德管大小要与卵母细胞或胚胎大小合适。
第五章动物卵母细胞与胚胎冷冻保存技术
2、细胞外冰晶损伤
慢速冷冻时，冰晶首先在细胞外形成。细胞外 液冰晶形成后，使得溶液中离子浓度的升高， 对细胞产生了离子影响，此损伤又称盐损伤。
随着更多冰晶的产生，使溶液逐渐浓缩，溶液 的浓缩对细胞的影响越来越大，此现象被称为 溶液效应又称为化学损伤。
冷却的速度越慢，则浓度越高，对卵母细胞的 作用时间也越长，对卵母细胞膜蛋白复合体造 成的伤害也越大。这主要是由于细胞内外的电 解质浓度增高，导致细胞膜蛋白复合体的破坏 和核膜的降解。
单细胞，胚胎为多细胞，受精卵随第二极体 的排出，新陈代谢逐步加强）母细胞和胚胎在低温冷冻保存过程中的 受损机制
卵母细胞的冷冻保存技术来源于胚胎冷冻保存， 由于细胞自身所具有的一系列特殊性质，因而 冷冻保存的难度较大。
在冷冻保存及复温过程中易受到一系列的损伤， 主要包括在以下几个方面：
快速冷冻时，由于降温速率快，结晶时的冰晶 核较多，从而形成数目多且体积小的冰晶，对 细胞造成的损害较小。
如果解冻时采取快速复温，则细胞仍能存活 ，但若在解冻过程中，在温度较高的区域（ 如-40℃或更高）经历较长时间或进行慢速复 温，则会产生重结晶现象，即细胞内小冰晶 重结晶成大冰晶，从而机械性的破坏细胞的 超微结构而造成细胞的致命损伤。
目前，欧、美、日、加等国有上百家胚胎移植公 司从事牛羊胚胎移植业务。
在国内，牛的冷冻胚胎生产与移植已开始逐步商 业化。
第二节 胚胎与卵母细胞的冷冻保存原理
胚胎与精子细胞结构差异： 胚胎数量极少 胚胎体积比精子大很多(精子为9um,卵子直径为
120um),细胞质多,外包特殊膜—透明带。 胚胎结构结构和新陈代谢过程更为复杂（精子为
1998年，Vajita等首次采用OPS法冷冻牛卵母 细胞取得了成功，体外受精后囊胚发育率达 11％～25％。
胚胎及卵母细胞的冷冻保存技术
➢ 冷冻过程
快速冷冻法
由室温开始以1℃/min的速度降至-5~-7℃诱发结晶，在此 温度下平衡10min℃，然后以0.3℃/min的速度降至30℃~40℃，投入液氮保存。
一步冷冻法
牛和山羊目前仍处于试验阶段
牛7日龄囊胚可在2.1mol/L甘油、0.25mol/L蔗糖混合液中 室温下脱水2min，将装有胚胎的细管垂直放在液氮罐颈部 5min，结晶后投入液氮。
非渗透性保护剂
这是一类大分子化合物，能溶于 水，性 保护剂促使细胞脱水，减少细 胞内冰晶形成；组成玻璃化液 时，可有效降低渗透性保护剂 的分子浓度、可使发生玻璃化 的相变温度升高、可促进胞质 及保护液玻璃化；解冻时，为 卵母细胞和胚胎提供一个高渗 环境，避免水分进入胞内过快 而产生的渗透性破裂。
冷冻方法
一、卵母细胞的冷冻 保存
➢ 卵母细胞的获得 活体卵巢采卵 屠宰动物卵巢采卵
1.抽吸法 2.切割法 3.剥离法 刀片切割卵巢可采取卵巢 内部卵泡
➢ 卵母细胞的分级与筛选 牛的卵母细胞可分为以下几个等级：
1. A级：外周有3层以上致密卵丘细胞，卵母细胞胞 质均匀并充满于透明带内。
2. B级：外周有1~3层卵丘细胞，卵母细胞胞质均匀。 3. C级：卵丘细胞扩散，卵母细胞胞质不均匀。 4. D级：无卵丘细胞的裸卵，细胞质不均匀，且有
➢ 细胞的冷冻保存并不在于能 否长期耐受低温，而是在于 冷冻和解冻时对细胞的致死 性作用（致死性温区-50~15℃）
一、胚胎和卵母细胞在低温冷冻保存过程中 的受损机制
➢ 在冷冻过程中，冰晶首先在细胞外液中形成，此时冰晶与 溶质分离，使细胞外液浓度升高、渗透压增加，细胞内水 分渗出产生溶液效应。
➢ 随着温度继续下降，细胞外冰晶不断形成，未冻结部分的 溶液浓度增加，细胞内外的渗透压差增大。这时可能发生 两种情况：
2022女性生育力保存技术全文
2022女性生育力保存技术（全文）随着全球生育力呈现出明显下降的趋势，中国的生育力下降也已经成为比较严重的社会问题。
女性肿瘤患者的一些相关治疗，例如化疗、盆腔放疗、造血干细胞移植、涉及卵巢的手术治疗都可能对生育力造成显著的损伤。
而非肿瘤疾病，主要涉及顽性免疫性疾病、需造血干细胞移植的良性血液性疾病、早发性卵巢功能不全（prematureovarian insufficiency , POI）相关疾病,虽然只占女性生育力保存需求的8%~19% ,但仍然值得我们关注。
目前女性生育力保存相关技术主要涉及胚胎冷冻、卵子冷冻、卵巢组织冷冻及相关衍生技术如卵母细胞体外成熟、卵泡培养等。
1胚胎冷冻及卵子冷冻冻融胚胎移植技术已存在30余年，目前冻融胚胎移植与新鲜胚胎移植妊娠率无明显差别，是已婚育龄女性进行生育力保存的有效方法。
根据国内外生育力保存指南建议，卵母细胞冷冻保存和胚胎冷冻保存一样，都是生育力保存的一线治疗方案，主要针对无配偶的未婚女性。
在我国，胚胎冷冻和卵子冷冻均是以玻璃化为主流的冷冻方法，已经基本代替了程序冷冻法。
对于安全性，从目前的研究随访结果来看，冻融胚胎移植周期除文献报道可能出现新生儿体重高于新鲜胚胎移植外，围产期母儿并发症及新生儿出生缺陷并没有明显的增加。
根据《冷冻胚胎保存时限的中国专家共识》，胚胎冷冻6年内不影响妊娠结局，但尚无足够证据证实胚胎冷冻保存时间超过6年对冻融胚胎移植安全性有影响。
目前也无证据表明长期保存玻璃化冷冻卵子存在安全性问题。
女性卵子冷冻时的年龄与活产率密切相关，35岁以下女性冷冻卵子的活产率随着冷冻卵子数的增多而持续增高，大于35岁女性冷冻卵子累计到20枚其活产率将不再增加。
2卵巢组织冷冻卵巢组织冷冻适用于青春期前的儿童或需紧急生育力保存的患者。
对于已接受化疗的患者，相较于胚胎冷冻与卵子冷冻而言，更推荐选择卵巢组织冷冻，其原因是化疗对于分裂活跃的细胞具有更加明显的毒性作用，而对始基卵泡相对不敏感。
畜禽细胞与胚胎冷冻保种技术规范NYT1900-2010
畜禽细胞与胚胎冷冻保种技术规范 NY T 1900-2010ICS 65.020.30B 43 NY中华人民共和国农业行业标准NY/ T 1900-2010畜禽细胞与胚胎冷冻保种技术规范Procedures for cell and embryo cryopreservation of domestic animals 2010-07-08 发布 2010-09-01 实施中华人民共和国农业部发布NY/T 1900-2010前古目本标准遵照 GB/T 1. 1-2009 给出的规则起草。
本标准由中华人民共和国农业部畜牧业司提出。
本标准由全国畜牧业标准化技术委员会(SAC/TC 274)归口。
本标准起草单位:全国畜牧总站。
本标准主要起草人:xiJ丑生、王志刚、赵俊金、史建民、孟飞、于福清、孙飞舟、邱小田。
INY/T 1900-2010畜禽细胞与胚胎冷冻保种技术规范1 范围本标准规定了用于保种的家畜精液、家畜卵母细胞、家畜胚胎和畜禽成纤维细胞冷冻保存技术要求。
本标准适用于家畜精液、家畜卵母细胞、家畜胚胎和畜禽成纤维细胞等遗传物质冷冻保存和检验人库。
2 规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。
凡是注日期的引用文件，仅注目期的版本适用于本文件。
凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。
GB 4143 .牛冷冻精液GB 20557 山羊冷冻精液NY/T 1234 牛冷冻精液生产技术规程NY/T 1674 牛羊胚胎质量检测技术规程3 术语及定义下列术语和定义适用于本文件。
3. 1超低温保存 cryopreservation在液氮中冷冻保存遗传物质的技术。
3. 2卵母细胞 oocyte来源于有腔卵泡具有繁殖能力的细胞。
3. 3成纤维细胞 fibroblast以畜禽组织或胎儿为材料，体外培养、分离出的梭形或不规则形细胞。
胞质近中央处有椭圆形胞核，胞体→般铺展很开，细胞之间排列疏松，有较大细胞间隙。
卵母细胞的冷冻技术概要
三、实验
⑴冷冻方法与保护剂对牛卵母细胞解冻后细胞 发育的影响
1.卵母细胞的采集与成熟培养
非渗透性冷冻保护剂不能透过细胞膜，但可以增加细胞外溶 质浓度，在细胞膜内外形成渗透梯度，吸引细胞内水分外流， 使细胞脱水。 各种冷冻保护剂都各有千秋，需要按一定比例混合使用， 以加强效果。冷冻保护剂的浓度很重要，它决定了细胞脱水 的速率。
一、冷冻技术概述
2.细胞损伤假说
冷冻损伤是卵母细胞冷冻保存的主要障碍，有报 道认为冷冻常会使细胞膜，透明带发生变化，细胞骨 架被破坏，染色体出现异常等。
现在关于冷冻损伤有两个假说： ①胞内冰的形成，这是过快冷却所产生的，冰晶 会刺破细胞器，破坏细胞膜，造成冷冻损伤，因而冷 却速率越快，此损伤越大；
一、冷冻技术概述
②“溶质损伤”，也叫“溶液损伤”，这 是由过慢冷却所产生的，它使细胞在高浓度的 溶液中存在的时间过长而发生细胞失水，造成 了不可逆的的损伤，因而冷却速率越慢，此损 伤越大。
二、卵母细胞的冷冻保存研究
1.2冷冻保存方法
由于慢速冷冻冷冻与超快速冷冻方法都需要昂贵的 程序化冷冻仪，推广应用并不广泛。现在常用快速冷 冻方法即玻璃化法冷冻。朱士恩等应用OPS法玻璃化 冷冻牛的卵母细胞，得到了很高的囊胚率，成功提高 了冷冻效率。
Open pulled straw（OPS）： 用酒精灯将0．25mi塑料 细管加热拉成OPS管。保证OPS管壁内径0．8～1．0mm，管 壁厚度约0．08mm即可。冷却后用刀片将其切开，细端长度 保持在2cm左右。
哺乳动物卵母细胞与胚胎冷冻保存的研究进展
随 着胚 胎 工 程技 术 和低温 生 物 学 的不 断进 步 ， 研 究人 员对 哺乳动 物 的生殖 细胞 和组 织的冷 冻保 存 作 了大量 的研究 。卵母 细胞 与胚 胎 的冷冻保 存 是胚 胎 生 物技术 的重 要组 成部 分 ， 不仅 可为体 外受 精 、 它 核移 植 、 胎移 植 、 基 因动物 研究 等胚胎 工程 技术 胚 转 提供具 有发 育能 力 的 卵母 细胞 和 胚 胎 ， 而且 可 以与 精液 冷冻保 存一 起 建 立 种 质 资源 库 ， 为有 价 值 的雌 性 个体 和珍 稀濒危 野 生动物 的遗 传资源 的长期 保存 提 供新 的途径 ， 而不 受时 间和 空间 的限制 。 从
（ 而不 是 ２ ～２ ℃ ） 最 显著 的结果 是 断奶 时仔 猪 的 ６ ８ ， 体 重与对 照组 不 同。母 猪在 环境 温度相 对较 低 的环 境 中进 行 分 娩 后 ， 产 仔 猪 在 断奶 时 体 重 达 到 了 所 ８ ５千克 ， ． 而对 照组 母 猪所 产仔 猪 的断 奶 体重 仅 为 ７ ９千克 。 由于两 组母 猪 哺 乳 期 的 失 重 相 同 ， 究 ． 研 人员对 此解 释是 ， 比较 凉 爽 环 境 中 的母 猪 必 然增 在 加 了采食 量从 而增 加 了 自身的泌 乳量 同时 又没有丧 失 更 多的体重 。试 验结 果 见表 ｌ 。
需要 用较 少 的能量来 对 猪圈进行 加温 。 还 ５欧 元 尚需 回收 。 因此 ， Ｓｅｋｅ 中心 的 按 ｔｒｓｌ
推断 ， 要使 该项 改进技 术能 够在 经济上 获得 好处 ， 每
头母 猪 每年获 得 的利 润增 长就 要高 于这个 数 。为 了
第五章 动物卵母细胞与胚胎冷冻保存技术
一、卵母细胞和胚胎在低温冷冻保存过程中的 受损机制
卵母细胞的冷冻保存技术来源于胚胎冷冻保存 ，由于细胞自身所具有的一系列特殊性质，因 而冷冻保存的难度较大。 在冷冻保存及复温过程中易受到一系列的损伤 ，主要包括在以下几个方面：
（二）胚胎冷冻保存的发展概况 胚胎的冷冻保存开始于1972年， 由Whittingham 首次在小鼠上取得成功。
此后，国外在牛（Wilmut等，1973）、绵羊
（Willadsen等，1974）、山羊（Bilton等，1976） 和马（Ramamato等，1982）等动物的冷冻胚胎移 植方面相继取得成功。
储存于液氮内的细胞，需要解冻到常温后才 能应用。若升温的速度不够快，储存的细胞 从液氮温度回升到成核温度时，细胞会从周 围吸热，热力学发生变化后出现再结晶现象 ，即发生所谓的“去玻璃化”现象。 去玻璃化过程有两种类型： 一种是原来降温过程中形成的微小冰核在升 温的过程中形成冰晶； 另一种是没有微小冰核的标本中在复苏的过 程中形成冰核并结晶生长。
5、冷冻保护剂化学毒性损伤 当卵母细胞或胚胎移入冷冻保护剂液平衡时 ，随着时间的延长和浓度的升高，生存率下 降。造成这个结果的原因是冷冻保护剂中渗 透性冷冻保护剂的化学毒性作用。 冷冻过程中渗透性冷冻保护剂渗入细胞，影 响和改变细胞内超微结构和大分子物质的结 构和功能，间接引起高级结构的破坏。毒性 表现在引起细胞膜变脆或破裂、透明带硬化 、微管及微丝聚合或解聚、染色体和DNA损 伤等。
6、低温损伤 卵母细胞和胚胎对温度的降低极为敏感，在温度 高于冰点，细胞内外均无冰晶形成的情况下，仍 会造成细胞的损伤。 不同哺乳动物的细胞在低温保存过程中都会受到 一定的低温影响，特别是脂质含量较多的猪卵母 细胞和牛卵母细胞。 这种由于温度低于正常温度所造成的细胞损伤被 称为低温损伤。这种损伤很大程度上取决于温度 的变化。造成这种损伤的机理可能是的低温引起 膜脂肪相的变化，从而影响细胞的新陈代谢。 低温损伤与细胞质内脂肪颗粒的含量有关，如猪 和牛卵母细胞及早期胚胎此现象由为突出，其他 哺乳动物脂肪含量较少，受低温损伤影响不大。
卵母细胞冷冻保存的方法
卵母细胞冷冻保存的方法（一）卵母细胞的获取随着哺乳动物胚胎操作技术的成熟和胚胎移植技术商业化的迅猛发展，各领域对卵母细胞的需求量与日俱增。
单纯依赖超数排卵获取卵母细胞的方法费用高、对动物生理功能影响大且获得的数量有限，因此不能满足科学研究和生产的需求。
现在主要有两种获取卵母细胞的途径：一是从活体卵巢采集，二是从屠宰厂废弃卵巢中获取卵母细胞。
1.活体卵巢上采集（1）腹腔镜法：此法在手术部先行局部麻醉，以消毒导管针刺入腹腔并向腹腔内轻轻打气、压迫胃肠前移，从导管内插入内镜进行搜索观察。
另用套有聚四氟乙烯套管的吸卵针在内镜引导下刺入卵泡内吸取卵母细胞。
该法在牛上采集排卵前卵母细胞可达80%～90%回收率。
（2）B型超声波法：此法将带有超声波探头和采卵针的采卵器插入到保定和麻醉母畜阴道子宫颈的一侧弯隆处缓慢移动卵巢，用吸卵针刺入直径大于2mm的卵泡，真空吸入卵母细胞和卵泡液。
现在，此法已成为牛活体采卵的主要方法。
（3）活体输卵管采卵法：通过手术方法采集排入输卵管内的卵母细胞。
打开腹部后，找到子宫角和输卵管并牵出腹腔外，自宫管接合部插入注射针、逆向从伞部输卵管腹腔孔冲洗，或者在宫管接合部子宫角尖下1cm处插入接卵管接于平皿中，自伞部输卵管腹腔口顺向注入冲卵液。
该方法目前是猪、绵羊、山羊、兔等动物常用的活体采卵方法。
2.屠宰后卵巢上采集动物屠宰后立即无菌采集卵巢，放入30～39℃灭菌生理盐水或灭菌PBS中，6小时内带回实验室。
尽管有人认为在18～21℃收集和操作牛卵母细胞能提高卵母细胞成熟率，Yang等（1990）的研究结果表明，牛卵巢在24℃保存24小时后收集的卵母细胞体外受精后仍有71.2%的卵裂率，而Solano等1994年的研究更显示将牛卵巢在4℃放置12～24小时后其卵裂率不受任何影响。
卵巢表面卵泡卵母细胞的获得是目前体外成熟培养中卵母细胞的主要来源，其采集方法有如下3种。
（1）抽吸法：用配以16号或18号针头的5ml或10ml注射器从直径2～6mm的卵泡中抽吸卵泡液。
人类卵母细胞与胚胎玻璃化冷冻中国专家共识(2023年)版解读PPT课件
遗传学检测
运用PGD/PGS等技术，对 卵母细胞和胚胎进行遗传 学检测，确保其遗传物质 正常。
冷冻存储条件保障
冷冻保护剂选择
选用合适的冷冻保护剂，以减少冰晶形成和细胞损伤 。
冷冻速率控制
精确控制冷冻速率，确保卵母细胞和胚胎在冷冻过程 中不受损伤。
医保和商业保险覆
盖
推动医保和商业保险覆盖玻璃化 冷冻技术，降低患者立行业合作机制
加强医疗机构、科研机构、企业等之间的合作，实现资源共享、优 势互补，推动玻璃化冷冻技术的发展和应用。
搭建学术交流平台
举办学术会议、研讨会等活动，促进学术交流与合作，提高行业整 体水平。
在不适宜的环境中。
03
胚胎玻璃化冷冻方法及操作规 范
胚胎来源与选择标准
胚胎来源
包括体外受精-胚胎移植（IVF-ET）和卵胞浆内单精子注射（ICSI）后获得的胚 胎。
选择标准
选择发育良好、形态正常的胚胎进行冷冻，通常选择D3天的卵裂期胚胎或D5/6 天的囊胚。
玻璃化冷冻液成分及配置方法
成分
包括基础培养基、冷冻保护剂（如二 甲基亚砜、乙二醇等）和特定比例的 血清或人血清白蛋白。
冷冻操作流程及注意事项
预处理
将卵母细胞在冷冻保护剂中进 行预处理，以降低冰晶形成的
风险。
装载与冷冻
将预处理后的卵母细胞装载至 冷冻载体，并快速投入液氮中 进行玻璃化冷冻。
解冻与复苏
将冷冻后的卵母细胞取出，迅 速进行解冻并移入复苏液中， 以恢复其正常生理状态。
注意事项
操作过程中需保持无菌，避免 卵母细胞受到机械损伤或暴露
生育力保存项目中应用
胚胎保存
（四）低温保存Βιβλιοθήκη 不同动物的胚胎对温度的反应不同，小鼠、家 兔和羊的胚胎冷却到0℃仍能存活，而猪胚胎
抗低温能力较差。目前认为，低温保存一般以
5～10℃较好。几种哺乳动物适宜保存的参考 温度分别是：小鼠5～10℃、家兔10℃、绵羊 10℃、山羊5～10℃、牛0～6℃。而猪胚胎对 低温较敏感，在15℃以下易受低温打击而影响 活力，所以猪胚胎保存一般在15～20℃为宜。
（五）冷冻保存
冷冻保存原理
胚胎冷冻保存关键是要设法减少细胞内冰晶形 成所致的损伤。胚胎冷冻保存实际上是一个脱 水过程，在胚胎冷冻前，要尽量减少胚胎细胞 内的水分。
当胚胎在降到一定温度时，首先是细胞外溶液 形成冰晶，而细胞内尚未结冰，处于超冷状态。 随着细胞外液冰晶逐渐增大，细胞外液的渗透 压升高，导致细胞内水分向外渗出而产生所谓 “溶液效应”。
卵母细胞与胚胎保存
江苏畜牧兽医职业技术学院
胚胎保存的意义
胚胎的保存就广义上说，就是设法在体外把胚 胎暂时贮存起来而不使其失去活力。
1、使胚胎移植具有更大的灵活性和实用性。 2、进行远距离运输，解决家畜引种时运输活
畜的困难。 3、建立动物基因库（胚胎库）。
胚胎与精子细胞结构差异
胚胎数量极少 胚胎体积比精子大很多(精子为9um,卵子直径
分子量小，可通过细胞膜进入细胞内，如GL、 EG、DMSO、PG(1，2－丙二醇）。
非渗透性保护剂
主要作用机制：通过提高细胞外液渗透压，使 细胞内的水分充分外流，使胚胎在冷冻过程中 减少冰晶的形成，从而达到冷冻保护的目的。
分子量大，在冷冻过程中不进入细胞内，如蔗 糖、聚蔗糖、海藻糖和棉子糖等多元醇。
玻璃化冷冻法的共同优点：设备简单，花费少， 冷冻效果好。