中药指纹图谱建立的原则和步骤
中药指纹图谱的原理与应用
气相色谱(GC)以气体为流动相，对于含挥发性 成分中药的鉴别具有一定优势。由于裂解气相 色谱具有操作简便、样品无须化学前处理、提 供信息量大等优点而格外引人注目。该方法将 样品故人裂解器内，在一定的条件下将样品加 热使其瞬间裂解，生成可挥发性的小分子物质， 立即被载气带人气相色谱系统的分析柱上，分 离后得到具有指纹性质的裂解气相色谱图。如 果将气相色谱与质谱、傅立叶变换红外光谱联 用，则不但可以知道不同中药中挥发性成分的 差别，而且可以对这些成分进行鉴定。
高速逆流色谱指纹图谱(HSCCC fingerprintspectrum， 即调整逆流色谱法) HSCCC利用动态液-液分配原理分 离样品，其分离度和重现性与HPLC类似，但样品前处 理简单。具体地说它是一种基于液-液多级逆流萃取建 立的色谱体系，以轻巧的聚四氟乙烯螺旋管作分离柱，
在行星式运动中连续地完成整个分配、传递、分离过
中药指纹图谱，即中药身份证，主要指中 药化学指纹图谱，实际上是一种保证中药质量 的措施，是指对某种中药材或中成药等运用现 代分离分析科学的手段，得到能够标示该中药 的色谱或光谱的图谱，最终用来对中药质量评 价的科学性方式。它有两个显著特点，一是通 过指纹图谱的特征性，能有效鉴别样品的真伪 或产地。二是通过指纹图谱主要特征峰的面积 或比例的制定，能有效控制产品的质量，确保 产品质量的相对一致。
对这种中药材的分子遗传标记的研究，找到具有该种高度特异性
的片段，便可以此为基础，制备出对该种高度特异性的寡核苷酸 探针，再经分子杂交进行指纹分析，即可达到鉴别目的。DNA指 纹图具有高度的个体特异性。DNA指纹图谱技术包括AP-PCR(arb itrary primer PCR，任意引物聚合酶链式反应)和RAPD(随机扩增 多态性DNA，randomly amplified polymorphic DNA)两种指纹图谱 技术。RFLP (限制性[内切酶]片段长度多态性，restriction fragment length polymorphism)是最常用的构建DNA指纹图的方法，但该法 费时费力，使应用受到限制。随机扩增多态DNA(RAPD)标记，可 以在特异DNA序列尚不清楚的情况下，检测DNA的多态性，这是
第五章指纹图谱
S1 S2 S3 S4 S5 对照指纹图谱
1.000 0.997 0.995 0.995 0.997 0.998
0.997 1.000 0.998 0.997 0.996 0.999
0.995 0.998 1.000 0.998 0.991 0.999
0.995 0.997 0.998 1.000 0.990 0.999
♦ 液相色谱 ● 色谱柱：比较试验加以选择
流动相：至少用三种不同组成比较
流动相 1
流动相 2
流动相 3
适宜的柱温和检测波长
15 203
20
210
25
236
30
254
35
365
五、方法学验证
1. 稳定性试验
供试品溶液的稳定性
表3 川芎指纹图谱稳定性试验相似度计算结果（n=5）
对照指纹图谱 S1 S2 S3 S4 S5
红外光谱图
小蓟丁酮提取物的红外 指纹图谱
• 中国药典规定：小 蓟在开花时采。 • 根据1384cm-1处 吸收峰的有无，可 以鉴别其采集时间 是否正确。
质谱（ＭＳ）
• 按照带电粒子的质荷比（ｍ／ｚ）和其相 对丰度大小排列组成图谱。 • 中药特征提取物置质谱仪中进行轰击裂解 为不同的碎片，获得提取物中化学成分的 MS图，不同中药由于所含化学成分的种类 及组成比例的不同，所得质谱图中分子离 子峰和碎片离子峰亦不一致。
HPCE, CE/MS 光谱技术 UV IR
波谱技术 MS NMR X-射线衍射法 分子生物学技术
薄层色谱
●可在同板同时分析多达18个样品， ●展距局限在 10cm~20cm ，‘柱效’ 时效高 相对较低，对复杂组分 ●所用的是正相展开剂，其组成变 不提高分离度则难以提 化灵活，可适应多种成分的分离 取指纹特征的药材受到 限制。 ●离线操作，即可直观比较图谱， 又可扫描得到轮廓图和处理数据 ●开放系统，对环境温 度、相对湿度要求较高 ●占机时间短
中药注射剂指纹图谱研究的技术要求
中药注射剂指纹图谱研究的技术要求中药注射剂指纹图谱研究的技术要求（暂行）为了加强中药注射剂的质量管理，确保中药注射剂的质量稳定、可控，中药注射剂在固定中药材品种、产地和采收期的前提下，需制定中药材、有效部位或中间体、注射剂的指纹图谱。
一、注射剂用中药材指纹图谱研究的技术要求中药材指纹图谱系指中药材经适当处理后，采用一定的分析手段，得到的能够标示该中药材特性的共有峰的图谱。
如原药材需经过特殊炮制（如醋制、酒制、炒炭等），则应制定原药材和炮制品指纹图谱的检测标准。
(一)指纹图谱的检测标准包括名称、汉语拼音、拉丁名、来源、供试品和参照物的制备、检测方法、指纹图谱及技术参数。
有关项目的技术要求如下：1.名称、汉语拼音按中药命名原则制定。
2.来源包括原植、动物的科名、中文名、拉丁学名、药用部位、产地、采收季节、产地加工、炮制方法等，矿物药包括矿物的类、族、矿石名或岩石名、主要成分、产地、产地加工、炮制方法等。
动、植物药材均应固定品种、药用部位、产地、采收期、产地加工和炮制方法，矿物药应固定产地和炮制、加工方法。
供试品的取样参照《中国药典》2000年版中规定的中药材的取样方法，以保证供试品的代表性和均一性。
3.供试品的制备应根据中药材中所含化学成分的理化性质和检测方法的需要，选择适宜的方法进行制备。
制备方法必须确保该中药材的主要化学成分在指纹图谱中的体现。
对于仅提取其中某类或数类成分的中药材，除按化学成分的性质提取各类成分制定指纹图谱外，还需按注射剂制备工艺制备供试品，制定指纹图谱，用以分析中药材与注射剂指纹图谱的相关性。
4.参照物的制备制定指纹图谱必须设立参照物，应根据供试品中所含成分的性质，选择适宜的对照品作为参照物，如果没有适宜的对照品，可选择适宜的内标物作为参照物。
参照物的制备应根据检测方法的需要，选择适宜的方法进行。
5.测定方法包括测定方法、仪器、试剂、测定条件等。
应根据中药材所含化学成分的理化性质，选择适宜的测定方法。
中药指纹图谱的原理与应用
高效液相色谱(HPLC) 具有分离效能高、分析速度快、灵敏度高、
方法重现性好、选择性高、适用的样品类型广泛等特点。已经普 遍应用于中药材及制剂的分析检测，特别是三维高效液相色谱法， 近年来发展很快，非常适合构建中药指纹图谱。与薄层色谱相比， 它是封闭系统色谱，受外界影响小，色谱稳定性、重现性好，其 分离、鉴别能力远远高于薄层色谱。在中药指纹图谱中首推高效 液相色谱指纹图谱。HPLC所分析的中药中，有相当部分为次生 代谢产物，而这些产物的组成和含量不仅和药材本身的种属有关， 同时还与植物后天所处的地域环境、生长条件、采摘时间和炮制 方法有很大的关系。对于中成药来说，与产品的加工过程也有很 大的联系。不同的加工过程与方法都将对所得的指纹图谱有相当 影响，表现在峰高、峰面积、保留时间以及峰数量上的变化等。 因此，HPLC不仅可以用来对生药的真伪、优劣进行鉴定，同时 还可以对中药的加工过程进行监测，可以有效地分析鉴定经过不 同的炮制、加工的中成药。
中药紫外光谱 (UV) 特征的差异，在 — 定
程度上反映了中药化学成分的差异。某 些情况下，伪品虽可在外观上以假乱真， 但其化学成分的组成和含量与正品必有 差异，这种差异在紫外光谱上必有所反 映。如果中药亲缘相近而紫外光谱不易 区别，可采用多阶导数光谱法提高分辨 率。
红外光谱 (IR) 一直是药品鉴定的权威方法，但
X射线衍射法(XRD)是研究物质的物相和晶体
结构的主要方法。当对某一物质进行衍射分析 时，该物质被射线照射而产生不同程度的衍射 现象。物质的组成、晶型、分子内成键方式、 分子的构型等决定该物质产生特有的衍射图谱。 如果是混合物，则所得衍射图是各组成成分衍 射效应的叠加。只要混合物的组成是恒定的， 衍射图就可作为混合物的特征谱。衍射法所获 得的信息量大，指纹性强，稳定可靠，是中药 定性鉴别的可靠依据。另外，该方法所需样品 量小，不破坏样品，操作简单。
中药指纹图谱研究技术要点
中药指纹图谱研究技术要点中药指纹图谱是指中药材经适当处理后，采用一定的分析手段和仪器检测得到的，能够标示该中药及其制剂中的各种组分群体特性的共有峰的图谱。
通过指纹图谱整体特征峰的相对保留时间及含量或比例的制定和比对，可有效地控制中药材及中药产品质量，保证产品质量的相对稳定。
目前，指纹图谱已成为国际公认的控制中药或天然药物质量的最有效手段。
实施中药指纹图谱难免会有一个提高、完善的过程。
从技术上说，中药指纹图谱的建立是完全可行的，但在实际应用中，还要解决诸多问题。
中药指纹图谱研究的技术要点主要有以下几个方面。
■中药材来源及样品处理对制作指纹图谱的动、植物药材必须做到固定品种、药用部位、产地、采收期、产地加工和炮制方法。
对矿物药应固定产地和炮制、加工方法，这是制定合格指纹图谱的先决条件。
对供试样品的取样应注意样品的代表性与均匀性，以保持实验室取样与实际生产应用药材一致。
除此之外，还必须做到组方和用量固定，生产工艺稳定。
■检测方法作为一张合格的指纹图谱必须具有特征明显、专属性强、重现性好的特点，而且要求做到操作和应用方便。
目前最常采用的制备中药指纹图谱的检测方法有光谱法和色谱法。
光谱方法如紫外光谱和红外光谱在实际应用中能提供识别的信息较少，往往当同类化合物其取代基团发生变化时，对应的光谱却难以体现出来，建议尽量不要采用。
色谱法最大特点在于可进行复杂组分的成分分离，特别是新的高效、通用检测器的发展和引入，使得采用色谱法检测可得到足够多的图谱识别信息，是目前制备指纹图谱的主流方法。
尤其是薄层色谱(TLC)、气相色谱(GC)和高效液相色谱(HPLC)技术已成为3种公认常用的指纹图谱分析手段。
其中特别又以HPLC分离效率高、分析速度快、样品适应性广、检测器种类多、灵敏度高、稳定性、重复性好而备受推崇，成为制备指纹图谱的首选方法。
参照物的选择：以色谱法制备得到的特征指纹图谱识别信息，主要是色谱峰的相对保留时间和相对峰面积比值。
中药指纹图谱的原理与应用
核磁共振波谱(NMR)是鉴定有机化合物结构的
常规方法和重要手段。植物中药特征性化学成 分往往不限一种，多表现为特征性成分组。因 此，其特征性标准提取物的NMR谱是其中各种 成分图谱的叠加。在混合物的NMR图谱上，除 每个信号在磁场中的共振数据外，信号的相对 强弱反映了混合物中各组分的相对含量。当图 谱不太复杂时，也可观察到某些信号的偶合关 系。通过对各化合物进行结构鉴定和NMR研究， 可实现植物中药NMR指纹图谱的解析。
三维荧光光谱指纹技术是研究样本的三
维荧光指纹特征，建立起对照品的三维 荧光指纹图谱，而不同的药物具有各自 特征的指纹图类型和特征指纹，药物的 荧光强度与其含量成正相关关系。因此， 荧光强度可作为药物含量评估的依据之 一。三维荧光光谱技术比常规荧光分析 方法更能反映激发波长和发射波长同时 变化时的荧光强度信息，而且具有灵敏 度高、选择性好等优点。
气相色谱(GC)以气体为流动相，对于含挥发性
成分中药的鉴别具有一定优势。由于裂解气相 色谱具有操作简便、样品无须化学前处理、提 供信息量大等优点而格外引人注目。该方法将 样品故人裂解器内，在一定的条件下将样品加 热使其瞬间裂解，生成可挥发性的小分子物质， 立即被载气带人气相色谱系统的分析柱上，分红外光谱联 用，则不但可以知道不同中药中挥发性成分的 差别，而且可以对这些成分进行鉴定。
下面，对各种指纹图谱 分门别类加以介绍。
薄层色谱(TLC)由于操作简单，展开剂组成灵
活多样，色谱后衍生方便，可以提供色彩斑澜 的彩色图像，直观易辨，在中药鉴别中应用频 率最高。采用合格材料和标准操作，可得到高 质量的色谱图像，于同板同时比较鉴别多个样 品，配合数码成像和数据处理，还可瞬间形成 轮廓图谱，并给出各峰积分值，加大信息量， 从而提高综合分析能力，比较适合原料药材指 纹图像分析。由于薄层色谱法是一种开放系统， 外界影响因素较多，必然会增加实验的难度。
中药指纹图谱研究的基础程序
3. 相似度评价
相似度(similarity extent )是评价样品和对照 品图谱一致性程度的参数。相似度的计算 可借助软件完成，如国家药典委员会推荐 的《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》 。
一、中药指纹图谱的含义及建立的原则
中药指纹图谱系指药材、饮片、提取物或 中药制剂等经适当处理后，采取一定的分 析技术和方法得到的能够标示其化学的、 生物学的或其他特性的图谱。中药指纹图 谱的建立应以系统的化学成分研究和药理 学研究为依托，并体现系统性、特征性、 稳定性三个基本原则。
系统性指的是指纹图谱所反映的化学成分，应包 括中药有效部位所含大部分成分的种类，或尽可 能多的指标成分。
(三)供试品溶液的制备
应根据所含化学成分的理化性质和检测方 法的需要，选择适宜的方法进行制备。制 备方法必须确保尽可能多的化学成分在指 纹图谱中反映出来。
(四)参照物的制备
建立指纹图谱应设立参照物，应根据供 试品中所含化学成分的性质，选择适宜 的对照品作为参照物；如果没有适宜的 对照品，可选择适宜的内标物作为参照 物。参照物的制备应根据检测方法的需 要，选择适宜的溶剂配制而成。
1. 共有指纹峰的标定采用色谱法建立指纹图 谱，必须根据参照物的保留时间计算指纹 峰的相对保留时间，根据10批次以上供试品 的检测结果，标定共有指纹峰。
2. 共有指纹峰面积的比值以对照品作为参照 物的指纹图谱，以参照物峰面积作为1，计 算各共有指纹峰面积与参照物峰面积的比 值;以内标物作为参照物的指纹图谱，则以 共有指纹峰中其中一个峰(要求峰面积相对 较大、较稳定的共有峰)的峰面积作为1，计 算其他各共有指纹峰面积的比值。各共有 指纹峰的峰面积比值必须相对固定。
指纹图谱的色谱条件选择是整个研究检测 方法过程中最重要、关键性的内容。以 HPLC法为例，色谱柱、流动相、检测器、 柱温和进样量等均是影响指纹谱建立的重 要因素。
中药指纹图谱建立的原则和步骤
中药指纹图谱建立的原则和步骤(一)建立指纹图谱的一般原则中药指纹图谱的建立,应以系统的化学成分研究与药理学研究为依托,体现系统性、特征性与稳定性三个基本原则。
唯此,才能保证指纹图谱的标准化、规范化、客观化,从而便于推广与应用。
1、系统性就是指指纹图谱中反映的化学成分应包括该中药有效部位所含大部分成分,或指标性成分的全部,如中药两头尖中抗肿瘤的有效成分为皂苷类化合物,则其指纹图谱应尽可能地反映其中的皂苷类成分;银杏叶的有效成分就是黄酮类与银杏内酯类,则其指纹图谱可采用两种方法,针对这两类成分分别分析,达到系统全面的目的。
2、特征性就是指指纹图谱中反映的化学信息(如保留时间)应具有较强的选择性,这些信息的综合结果,将能特征性地区分中药的真伪与优劣,成为中药自身的“化学条码”。
如北五味子的HPLC指纹图谱与TLC指纹图谱,不仅包括多种的五味子木脂素类成分,而且具有许多未知类成分,这些成分的峰位顺序、比值在一定范围内就是固定的,并且随药材品种不同而产生差异,依此可以很好地区别其来源、产地,判别药材的真伪优劣。
3、稳定性就是指所建立的指纹图谱在规定的方法、条件下的耐用程度,即不同操作者、不同实验室所重复做出的指纹图谱应在所允许的误差范围内,以体现其通用性与实用性。
因而要求包括样品制备、分析方法、实验过程、数据采集、处理、分析等全过程都要规范化操作,同时,还应建立相应的评价机构,对其进行客观评价。
(二)建立指纹图谱的一般步骤1、方案设计与思路(1)研究对象的确定在调研有关文献、新药申报资料(质量部分与工艺部分)及其它研究结果的基础上,尽可能的详尽地了解药材、中间体及成品中所含成分的种类及其理化性质,综合分析后找出成品中的药效成分或有效成分,作为成品与中间体指纹图谱的研究对象,即分析检测目标。
例如,黄芪含黄酮、皂苷及多糖三类有效组分,黄芪多糖注射液及其中间体的指纹图谱则以多糖为研究对象,黄芪原药材的指纹图谱应把黄酮、皂苷及多糖作为研究对象。
第三部分-中药指纹图谱研究关键技术及规范
3．2参照物溶液的制备
精密称取样品，用适宜的溶剂制成标示浓度的溶液，备用。
4 实验
选用的原则都是良好的专属性、重现性和可行性；
专属性： 建立的指纹图谱必须能够表达该品种的惟一特点，即惟一性； 重现性：同一品种同一样品指纹图谱中构成指纹的各特征峰作为整体 (峰位、峰数、峰的丰度、各峰的大致比例)在不同实验室和不同操作 者之间得到的色谱整体特征应有较高的相似度，以表明方法的可行性。 同一品种不同样品之间的相似度不属于此范围； 可行性：色谱方法和试验条件应易于推广和便于执行，即一旦由药品 监督管理部门批准成为质量标准的内容后，生产厂家、中等水平的分 析实验室和省级以上的法 指纹图谱的参照物质一般选取容易获取的一个以上注射剂中的主 要活性成分或指标成分，主要用于考察指纹图谱的稳定程度和重 现性，并有助于色谱的辨认。在与临床药效未能取得确切关联的 情形下，参照物(复方注射剂应首选君药的活性成分或指标成分) 起着辨认和评价色谱指纹图谱特征的指引作用，它并不等同于含 量测定的对照品。指纹图谱一般色谱比较复杂，内标物不易选择， 也不易插入，指纹图谱不是含量测定，故内标物的作用也不等同 于含量测定的内标物，因此应慎重考虑选用内标物质的必要性和 可能性。参照物应说明名称、来源和纯度。如无参照物，可选择 指纹图谱中的稳定的色谱峰作为参照峰，说明其色谱行为和有关 数据，并应尽可能阐明其化学结构及化学名称。如情况需要，且 有可能，也可考虑选择适当的内标物插入色谱中。
实验中的注意事项2
如需梯度洗脱时，应尽量采用线性梯度，并应报告仪 器梯度滞后时间。测定梯度滞后时间，可用一零死体 积连接器代替色谱柱，以甲醇为溶剂A，含O．1％丙 酮的甲醇为溶剂B，检测波长为260nm，运行0～100 ％B的线性梯度，梯度时间20分钟，流速1．Oml／ mm，记录梯度图形，测定梯度曲线中间点的时间， 减去10分钟，即得。不同的仪器，由于梯度滞后时间 的不同，可能影响方法的重现性，通常可通过调整进 样和梯度起始时间减少这种影响；
指纹图谱
＊选择试验方法及试验条件须根据供试品的特 点和需要设计合适的试验方案，在保证专属 性、重现性的前提下，宜选择简单、实用、 便于实施的方法和试验条件。
＊色谱中的参照峰由于作用不同于含量测定， 提高其分离度应以不牺牲色谱泊整体特征为 前提，所以不应孤立地苛求分离度必需达到 含量测定的要求。
中药材指纹图谱 质量控制及仪器方法
江苏省中医药研究院 钱大玮 段金廒
一、中药材指纹图谱的基本含义
定义：中药材指纹图谱是指某种(或某产地） 中药材中所共有的，具有特征性的某类 或几类成分的色谱或光谱的图谱。
特点：(1)通过指纹图谱的特征性,能有效鉴 别样品的真伪；
(2)通过指纹图谱主要特征峰的面积和比 例的制定，能有效控制样品质量，保证 样品质量的相对稳定。
2 应用实例
图9 黄连TLC指纹图谱
（六）高效毛细管电泳（HPCE）指纹图谱
1. 仪器简介
仪器装置通常包括高压电源、进样系统、 毛细管柱、检测器和记录系统5部分,其中毛细管 柱是分离的核心部分。
2. 应用实例
图 10 天麻及其伪品HPCE图 a天麻水提液 b天花粉水提液 c黄精水提液 d 商陆水提液e大九股牛水提液
（九）质谱（ MS）指纹图谱
将中药提取液置质谱仪中进行电子轰击 电离，可获得提取液中化学成分的MS图，不 同中药提取液所含成分不同，所得质谱图显 示的分子离子峰及进一步的裂解碎片峰亦不 一致，可资鉴别。但质谱法对提取液中主要 成分的含量要求较高，实验费用亦较大，能 否作为常用的检测方法尚待继续探索。
版一部119页红花项下的各项规定。
中药指纹图谱建立的原则与步骤
（一）建立指纹图谱的一般原则中药指纹图谱的建立，应以系统的化学成分研究和药理学研究为依托，体现系统性、特征性和稳定性三个基本原则。
唯此，才能保证指纹图谱的标准化、规范化、客观化，从而便于推广和应用。
1.系统性是指指纹图谱中反映的化学成分应包括该中药有效部位所含大部分成分，或指标性成分的全部，如中药两头尖中抗肿瘤的有效成分为皂苷类化合物，则其指纹图谱应尽可能地反映其中的皂苷类成分；银杏叶的有效成分是黄酮类和银杏内酯类，则其指纹图谱可采用两种方法，针对这两类成分分别分析，达到系统全面的目的。
2.特征性是指指纹图谱中反映的化学信息（如保留时间）应具有较强的选择性，这些信息的综合结果，将能特征性地区分中药的真伪与优劣，成为中药自身的“化学条码”。
如北五味子的HPLC指纹图谱和TLC指纹图谱，不仅包括多种的五味子木脂素类成分，而且具有许多未知类成分，这些成分的峰位顺序、比值在一定范围内是固定的，并且随药材品种不同而产生差异，依此可以很好地区别其来源、产地，判别药材的真伪优劣。
3.稳定性是指所建立的指纹图谱在规定的方法、条件下的耐用程度，即不同操作者、不同实验室所重复做出的指纹图谱应在所允许的误差范围内，以体现其通用性和实用性。
因而要求包括样品制备、分析方法、实验过程、数据采集、处理、分析等全过程都要规范化操作，同时，还应建立相应的评价机构，对其进行客观评价。
（二）建立指纹图谱的一般步骤1.方案设计与思路（1）研究对象的确定在调研有关文献、新药申报资料(质量部分和工艺部分)及其它研究结果的基础上，尽可能的详尽地了解药材、中间体及成品中所含成分的种类及其理化性质，综合分析后找出成品中的药效成分或有效成分，作为成品和中间体指纹图谱的研究对象，即分析检测目标。
例如，黄芪含黄酮、皂苷及多糖三类有效组分，黄芪多糖注射液及其中间体的指纹图谱则以多糖为研究对象，黄芪原药材的指纹图谱应把黄酮、皂苷及多糖作为研究对象。
复方注射剂应根据君臣佐使的原则，以君药、臣药中的有效成分作为指纹图谱的研究对象，佐使药中的成分可采用其它指纹图谱方法进行辅助、补充研究。
中药注射剂色谱指纹图谱实验研究技术指南
研究传统中药注射的色谱指纹对于确保药品质量达到最高水平至关重要。
该指纹通过分析其色谱特征来显示该药的整体质量和真实性。
这是使传统中医药现代化，确保安全有效地供人们使用的重要内容。
传统中药注射电子脉冲的色谱指纹实验研究技术，色谱条件，数据处理，分析。
样品制备涉及提取和净化传统中药注射。
色谱条件通过选择色谱柱，移动相，检测波长，柱温，用于建立传统中药注射色谱指纹。
数据处理和分析需要建立色谱指纹和对传统中药注射的相似性评价。
这种综合方法与政府按照既定政策和条例促进传统中医药标准化和质量控制的努力相一致。
在中药注射色谱传统指纹实验研究的迷人领域，必须认真选择完善的方法和条件，揭开这些古代灵药的精髓。
每一个微妙的步骤都必须抓住传统中药注射的真正质量，确保其效力和安全。
遵守准则和规定，每个实验都是艺术设计，每个数据都指向辉煌的中风，导致以科学调查的精确性和可信赖性演唱的结果。
中药技术现代化技术-指纹图谱
02
发展新型检测技术和仪器
研发更精确、更灵敏的检测方法和仪器，满足指纹图谱需求。
03
强化传统理念与现代技术融合
在传承中药理念的基础上，运用现代技术手段，推动中药指纹图谱的发
展。
未来发展趋势预测
技术不断创新
随着科技的进步，中药指纹图谱技术将不断创新，提高准确性和 可靠性。
应用范围扩大
中药指纹图谱将逐渐应用于更多领域，如药品质量控制、新药研 发等。
指导。
中药生产过程监控
指纹图谱技术可以实时监控中 药生产过程中的关键环节，确 保生产过程的稳定性和可控性。
通过对生产过程中指纹图谱的 变化分析，可以及时发现生产 过程中的异常情况，避免生产 事故的发生。
指纹图谱技术还可以应用于中 药生产过程的优化和改进，提 高生产效率和产品质量。
中药疗效评价与机理研究
的快速筛选和鉴定。
03 中药指纹图谱建立方法与 流程
样品选择与制备
01
选择具有代表性的中药样品，确 保其能够反映该中药的整体质量 特性。
02
对样品进行适当的制备处理，如 粉碎、提取、浓缩等，以获得符 合指纹图谱分析要求的样品。
数据采集与处理
采用高效、灵敏的现代分析仪器，如 色谱仪、光谱仪等，对中药样品进行 全面的化学成分分析。
面临挑战
技术标准化难度大
中药成分复杂，不同药材、不同批次间存在差异，制定统一标准 面临挑战。
检测方法与仪器限制
现有检测方法和仪器精度、灵敏度等方面可能无法满足指纹图谱要 求。
传统理念与现代技术融合
如何将传统中药理念与现代技术相结合，是中药指纹图谱面临的重 要问题。
解决方案探讨
01
加强标准化建设
中药色谱指纹图谱的建立与评价
第四章 中药色谱指纹图谱的建立 与评价
教学目的、要求
了解对照指纹图谱的建立与指纹图谱评价的 原则。 掌握相似性评价方法 熟悉相关软件。
主要内容
第一节 对照指纹图谱的建立与指纹图谱评 价 第二节 对照指纹图谱的建立方法 第三节 指纹图谱评价方法
第一节 对照指纹图谱的建立与指纹图谱 评价：
相似度的评价方法主要有峰重叠率法(Nei系 数法)、相关系数法、距离系数法、向量夹 角余弦法和峰重叠率与共有峰强度结合法 (改进的Nei系数法)等方法。这些方法都有 各自的特点和应用范围。
中药指纹图谱整体评价方法面临的难题
? 没有足够的标样，能否进行可靠的中药多组份的定性定量分析？
能否建立起基于中药的色谱指纹图谱中要质量的评价标准？
? 如何对待色谱峰保留时间的漂移？ ? 如何对待色谱分析仪器的背景与基线的漂移？ ? 如何处理色谱图中大量的未知成分
主要内容
第一节 对照指纹图谱的建立与指纹图谱评 价 第二节 对照指纹图谱的建立方法 第三节 指纹图谱评价方法
第二节 对照指纹图谱的建立方法
典型指纹图谱的建立模式
Байду номын сангаас
(1)共有指纹峰的标定 采用色谱方法制定指纹图谱，必须根据参照物的保留 时间，计算指纹峰的相对保留时间。根据10批次以上供试品的检测结果，标定中 药材的共有指纹峰。色谱法采用相对保留时间标定指纹峰。
对照指纹图谱的建立与指纹图谱评价的原则
指纹图谱的评价指标是以供试品指纹图谱与该品种 对照用指纹图谱(共有模式)之间的相似性来衡量的，用 “相似度”表达。 国家食品药品监督管理局颁布的《中药注射剂指纹 图谱实验研究技术指南》规定：指纹图谱相似度可以借 助国家药典委员会推荐的“中药计算机辅助相似度评价 软件”计算。一般情况下当成品相似度计算结果在 0.9～1.0(90％～100％)时视为符合要求。
中药指纹图谱操作技巧指南
中药指纹图谱操作指南说明：本实验研究规程指南为在原技术要求的基础上规范中药注射剂色谱指纹图谱试验研究而制订。
本指南未能概括的内容，通过实践可自行补充调整，但申报资料或复核资料中须有相应的说明和申述。
指南中的"色谱指纹图谱"指采用柱色谱及薄层色谱等各种色谱技术实验研究的指纹图谱。
光谱指纹图谱将另行规定。
一、供试品收集供试品收集是研究指纹图谱最初也是最关键的步骤，由于不可能对一个药材的所有样本进行试验，而且生长环境条件对药材代谢产物有影响，所以要收集有代表性的供试品。
收集不少于10批供试品的含义是指样本的数和量要有足够的代表性。
(一) 原料药材：在药材的化学成分与中医临床疗效的之间的关联尚未能阐明的现阶段，基本上是在承认其传统的功能主治及临床验证的基础上进行指纹图谱的实验研究。
原料药材的指纹图谱主要是反映其自然状态的内在质量情况，研究其指纹图谱是以此作为选择原药材投料或混批提取的依据，同时作为研究注射剂成品指纹图谱相关性的基础。
由于自然条件的变化，药材个体之间指纹图谱的差异是正常的，在品种鉴定无误的基础上，力争药材有较为固定和稳定的来源，个体之间的指纹图谱主要特征大致相似即可，使成品指纹图谱特征的稳定有起码的保证。
药材的"批" 不是工业生产的"批"，是指相互独立的供试品，即不能将同一地点或同一渠道同一时间获得的供试品分成若干份供试品，以保证试验结果的代表性。
由于收集药材供试品受主观和客观的条件限制，供试验的供试品严格讲均没有统计学的意义，所以供试品数越多越好，10批是最低的要求。
供试品应保证其真实性，应有完整采样原始记录，内容包括：药材名称供试品来源（真实记录供试品来自何处：传统产地收集或是资源丰富的产地收集，或者来自GAP基地供应；还是产地购买、市场购买或委托购买，等，以便于生产原料的采购选择和测试数据的可追溯）。
收集时间（购买时间）及收集人货源情况调查（货源是否充足和稳定）基原鉴定及鉴定人：产地或GAP基地收集的药材结合植物形态鉴定品种。
9-中药指纹图谱
3
山西太行药业股份有限公司
020802-8
4
山西太行药业股份有限公司
020804-1
5
石家庄神威药业股份有限公司
202221
6
石家庄神威药业股份有限公司
202231
7
常州康普药业有限公司,
208302
8
江苏安格药业有限公司
11202
9
三九企业集团 三九万荣药业有限责任公司
20330
10
常熟雷允上制药有限公司
9
3.指纹图谱的关键环节
1）图谱获取。 2）图谱解析数字化。 3）评价信息化和计算机化。
10
三、指纹图谱的数字化与评价
11
色谱指纹谱研究框架图
色谱指纹图谱
图谱前处理 指纹图谱向量
相似度计算
保留时间校正 色谱峰匹配
12
保留时间校正效果
Sample 采集
Sample 采集
N8o.种丹时参间药材S样ourc品e 来源No.和编时号间
209101
11
常熟雷允上制药有限公司
209171
12
北京双鹤高科天然药物有限责任公司
020601·0105
13
北京双鹤高科天然药物有限责任公司
020601·0210
3
用于建立对照指纹图谱的样品图谱
4
生成的对照图谱
生成的对照图谱（平均值法）
5
样品检查
样品检查
相似度评价结
果
对照指纹图谱
11 12 13 0.999 0.999 0.999 6
16
淫羊藿药材指纹图谱研究
1.淫羊藿样品前处理方法
粉碎过筛 称定0.2g
中药指纹图谱建立的原则和步骤
（一）建立指纹图谱的一般原则中药指纹图谱的建立，应以系统的化学成分研究和药理学研究为依托，体现系统性、特征性和稳定性三个基本原则。
唯此，才能保证指纹图谱的标准化、规范化、客观化，从而便于推广和应用。
1.系统性是指指纹图谱中反映的化学成分应包括该中药有效部位所含大部分成分，或指标性成分的全部，如中药两头尖中抗肿瘤的有效成分为皂苷类化合物，则其指纹图谱应尽可能地反映其中的皂苷类成分；银杏叶的有效成分是黄酮类和银杏内酯类，则其指纹图谱可采用两种方法，针对这两类成分分别分析，达到系统全面的目的。
2.特征性是指指纹图谱中反映的化学信息（如保留时间）应具有较强的选择性，这些信息的综合结果，将能特征性地区分中药的真伪与优劣，成为中药自身的“化学条码”。
如北五味子的HPLC指纹图谱和TLC指纹图谱，不仅包括多种的五味子木脂素类成分，而且具有许多未知类成分，这些成分的峰位顺序、比值在一定范围内是固定的，并且随药材品种不同而产生差异，依此可以很好地区别其来源、产地，判别药材的真伪优劣。
3.稳定性是指所建立的指纹图谱在规定的方法、条件下的耐用程度，即不同操作者、不同实验室所重复做出的指纹图谱应在所允许的误差范围内，以体现其通用性和实用性。
因而要求包括样品制备、分析方法、实验过程、数据采集、处理、分析等全过程都要规范化操作，同时，还应建立相应的评价机构，对其进行客观评价。
（二）建立指纹图谱的一般步骤1.方案设计与思路（1）研究对象的确定在调研有关文献、新药申报资料(质量部分和工艺部分)及其它研究结果的基础上，尽可能的详尽地了解药材、中间体及成品中所含成分的种类及其理化性质，综合分析后找出成品中的药效成分或有效成分，作为成品和中间体指纹图谱的研究对象，即分析检测目标。
例如，黄芪含黄酮、皂苷及多糖三类有效组分，黄芪多糖注射液及其中间体的指纹图谱则以多糖为研究对象，黄芪原药材的指纹图谱应把黄酮、皂苷及多糖作为研究对象。
复方注射剂应根据君臣佐使的原则，以君药、臣药中的有效成分作为指纹图谱的研究对象，佐使药中的成分可采用其它指纹图谱方法进行辅助、补充研究。
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（一）建立指纹图谱的一般原则
中药指纹图谱的建立，应以系统的化学成分研究和药理学研究为依托，体现系统性、特征性和稳定性三个基本原则。
唯此，才能保证指纹图谱的标准化、规范化、客观化，从而便于推广和应用。
1.系统性是指指纹图谱中反映的化学成分应包括该中药有效部位所含大部分成分，或指标性成分的全部，如中药两头尖中抗肿瘤的有效成分为皂苷类化合物，则其指纹图谱应尽可能地反映其中的皂苷类成分；银杏叶的有效成分是黄酮类和银杏内酯类，则其指纹图谱可采用两种方法，针对这两类成分分别分析，达到系统全面的目的。
2.特征性是指指纹图谱中反映的化学信息（如保留时间）应具有较强的选择性，这些信息的综合结果，将能特征性地区分中药的真伪与优劣，成为中药自身的“化学条码”。
如北五味子的HPLC指纹图谱和TLC指纹图谱，不仅包括多种的五味子木脂素类成分，而且具有许多未知类成分，这些成分的峰位顺序、比值在一定范围内是固定的，并且随药材品种不同而产生差异，依此可以很好地区别其来源、产地，判别药材的真伪优劣。
3.稳定性是指所建立的指纹图谱在规定的方法、条件下的耐用程度，即不同操作者、不同实验室所重复做出的指纹图谱应在所允许的误差范围内，以体现其通用性和实用性。
因而要求包括样品制备、分析方法、实验过程、数据采集、处理、分析等全过程都要规范化操
作，同时，还应建立相应的评价机构，对其进行客观评价。
（二）建立指纹图谱的一般步骤
1.方案设计与思路
（1）研究对象的确定
在调研有关文献、新药申报资料(质量部分和工艺部分)及其它研究结果的基础上，尽可能的详尽地了解药材、中间体及成品中所含成分的种类及其理化性质，综合分析后找出成品中的药效成分或有效成分，作为成品和中间体指纹图谱的研究对象，即分析检测目标。
例如，黄芪含黄酮、皂苷及多糖三类有效组分，黄芪多糖注射液及其中间体的指纹图谱则以多糖为研究对象，黄芪原药材的指纹图谱应把黄酮、皂苷及多糖作为研究对象。
复方注射剂应根据君臣佐使的原则，以君药、臣药中的有效成分作为指纹图谱的研究对象，佐使药中的成分可采用其它指纹图谱方法进行辅助、补充研究。
（2）研究方法的选择
研究方法应根据研究对象的物理化学性质来选择。
大多数化合物可采用HPLC。
例如黄芪中黄酮、皂苷、多糖等。
挥发性成分应采用GC。
例如鱼腥草中的鱼腥草素、土木香中的土木香内酯、异土木香内酯和二氢土木香内酯等。
某些有机酸经甲酯化后亦可用GC分析。
采用上述方法难以分离检测的成分，可考虑使用TLC和CE。
一个中药制剂的指纹图谱可以同时采用多种方法进行研究。
选择方法时，还需考虑药品检验系统复核时的设备、技术等因素。
（3）研究内容
根据国家食品药品监督管理局《中药注射剂指纹图谱研究的技术要求》(暂行)的规定，主要研究内容有原药材、中间体、注射剂的指纹图谱，涉及样品名称、来源、制备、测定方法、指纹图谱及技术参数等。
2.样品的收集
这是最初也是最关键的步骤。
至少要收集10个批次样品。
注意样品的代表性。
(1)切不可将同一批次样品分散成数个批次，充当样品。
(2)原药材尽可能固定产地(GAP基地药材，地道药材)、采收期和炮制方法。
对光线稳定，疗效稳定，无临床不良反应的药材批次应重点选择。
(3)中间体、注射剂样品的收集应重点选择工艺稳定、疗效稳定、无不良反应的批次。
(4)留样应不少于实验用量的3倍。
3.供试品溶液的制备(样品的预处理)
（1）药材供试液的制备
根据所含成分的理化性质，通过溶剂提取、液液萃取、沉淀、吸附等方法，分离富集样品。
例如，黄芪中黄酮类成分通过碱的萃取、皂苷类通过大孔吸附树脂吸附；苦参中总生物碱通过阳离子交换树脂分离；挥发性样品常用水蒸气蒸馏法制备。
样品富集后，还需通过氧化铝预柱、C18预柱、硅胶预柱、聚酰胺预柱等，除去色素等杂质，最后通过微孔滤膜，供HPLC测试。
（2）中间体供试液制备
可针对有效成分处理，并参照原药材的制备方法。
（3）注射剂供试液制备
液体注射剂一般无需特殊处理，可直接分析检测。
4.参照物的选择
一般选取样品中容易获得且含量较高的一个主要活性成分或指标成分作为参照物（S）。
参照物主要用于指纹图谱技术参数的确定，如特征峰(共有峰)的相对保留时间，峰面积比值等。
并有助于图谱的稳定性、重现性的考查。
例如三七药材的指纹图谱中以三七皂苷R1为参照物。
由于指纹图谱比较复杂，内标物不易选择、插入，故一般不以内标物做为参照物。
5.实验方法和条件的选择
其目的是通过比较实验，从中选取相对简便易行的方法和条件，获取足以代表品种特征的指纹图谱，以满足指纹图谱的专属性、重现性和普遍适用性的要求。
方法和条件须经过严格的方法学考察。
例如稳定性试验，精密度试验，重现性试验等。
注意事项：供试液的制备和色谱分析时均须定量操作，以保证图谱在整体特征上进行半定量(差异程度或相似程度)的比较。
指纹图谱分析不同于含量测定，提高其分离度应以不牺牲色谱的整体特征为前提，故不应孤立地苛求分离度达到含量测定的要求。
采用HPLC和GC制定指纹图谱，记录时间一般为1小时。
(实测2小时)
6.对照指纹图谱及其技术参数的建立
(1)测得的大量色谱数据需经分析和数据处理，才能获得对照指纹图谱(拟合指纹图谱)及其技术参数，以此作为药品指纹图谱检验的依据。
(2)技术参数主要包括总峰面积、共有峰序号、参照峰(S)、共有峰相对保留时间(RRT)，共有峰峰面积比(RA)，非共峰面积等。
RRT=RTi/RTs RA=Ai/As
共有峰亦称特征峰（包括参照峰），系指所有被检批次中均含有的相同色谱峰，主要来源于样品中主要有效成分或指标成分。
共有峰的化学归属，可采用对照品加入法或HPLC/DAD/MS/MS联用技术进行鉴别，后者可在无对照品的情况下使用。
例复方丹参注射液指纹图谱应有9个特征峰
相对保留时间／分钟(峰序号)：0．145(1) 0．186(2) 0．298(3) 0．378(4) 0．425(5) 0．499( 6) 0．594(7) 1．000(s原儿茶醛) 1．145(8)
峰面积比值：0．059(1) 0．064(2) 0．036(3) 0.112±30％(4) 0．054(5) 0．297±25％(6) 0．055(7) 1．000(s原儿茶醛) 0．040(8)
7.药材、中间体和注射剂指纹图谱的相关性
注射剂中各特征峰均可在药材及中间体指纹图谱中得到追踪，中间体与注射剂的指纹图谱应非常接近，药材图谱中的色谱峰应比注射剂多。
必要时可采用加入某一药材、有效部位或中间体的供试品，或制备某一药材、有效部位或中间体阴性供试品的方法，标定各指纹图谱之间的相关性。
提供相关性研究的指纹图谱。
8.指纹图谱的评价
中药指纹图谱的评价系指将样品指纹图谱与建立起来的对照指纹图谱进行相似性比较，从而对药品质量进行评价和控制。
中药指纹图谱的评价不同于含量测定，它强调的是相似性(Similarity)，而不是相同性(Identity)，也即着重辨识完整图谱“面貌”，而不是求索细枝末节。
分析比较的结果是对供试品与对照品之间的差异或一致性作出的评价。
相似性的比较可以用“相似度”表达，相似度可借助国家药典委员会推荐的“中药指纹图谱计算机辅助相似度评价软件”计算，一般情况下相似度在0．9~1．0之间即认为符合要求。