酶生物改造
酶的生物改造共65页课件.ppt
4、定向进化的原理
在待进化酶基因的PCR扩增反应中，利用Taq DNA聚合 酶不具有3’->5’校对功能的性质，配合适当条件， 以很低的比率向目的基因中随机引入突变，构建突变 库，凭借定向的选择方法，选出所需性质的优化酶 (或蛋白质)，从而排除其他突变体。
定向进化的基本规则是“获取你所筛选的突变体”。 定向进化=随机突变+选择。前者是人为引发的，后者
3、酶的定向进化技术
定义： 从一个或多个已经存在的亲本酶（天然或人为 获得）出发，经过基因突变和重组，构建一个 人工突变基因库，通过筛选最终获得预先期望 具有某些特性的进化酶；
所谓酶的体外定向进化，又称实验分子进化，属于蛋 白质的非合理设计，它不需事先了解酶的空间结构和 催化机制，通过人为地创造特殊的条件，模拟自然进 化机制(随机突变、重组和自然选择)，在体外改造酶 基因，并定向选择出所需性质的突变酶。
虽相当于环境，但只作用于突变后的分子群，起着选 择某一方向的进化而排除其他方向突变的作用，整个 进化过程完全是在人为控制下进行的
酶定向进化的过程和应用范围
蛋白质
随机突变 随机杂交
•稳定性 •活性 •有机溶液中的活性 •不同的底物的利用 •酸碱度 •蛋白质的表达 •亲和性 •专一性
性能
筛选
目达标到蛋目的白
三、酶定向进化的基本过程
随机突变 不同的定向进化方法构建突变基因 载体的选择，基因重组，组建基因
突变基因的筛选 平板筛选法，荧光筛选法，表面展示法
1、定向进化的方法
无性进化方法：易错PCR法，盒式诱变 有性进化方法
1）DNA改组法（DNA Shuffling) 2）体外随机重组法（RPR) 3）交错延伸法(StEP) 基因家族的同源重组 外显子的改组 杂合进化
蛋白质与酶的工程改造技术及其应用
蛋白质与酶的工程改造技术及其应用蛋白质是构成生物体细胞的基本结构单元，对于生命活动的各种过程都具有重要的作用。
酶则是生物体内催化反应的重要媒介，通过发挥催化活性加速生命过程，维持了细胞的生存。
传统的酶工程技术主要将重点放在酶的分离和纯化上，但是这种方法成本高、效率低，对于大规模生产和应用场景并不适用。
随着现代生物技术的不断发展，蛋白质与酶的工程改造技术不断更新，为生物制药、酶催化反应等领域提供了新的解决方案。
本文将介绍蛋白质与酶的工程改造技术及其应用。
一、蛋白质工程改造技术1.点突变技术点突变技术是将蛋白质基因的某个碱基或氨基酸序列进行改变，从而使其具有不同的功能、活性或特定的理化性质。
这种技术在人类疾病治疗、新型药物研发、工业酵素等领域有着广泛的应用。
例如，通过点突变技术可以将普通抗体转化为更强力、更稳定的人源化抗体，提高其在治疗上的效果；也可以将酵素的催化速率、热稳定性等进行调整，以适应特定的工业需求。
2.融合蛋白技术融合蛋白技术是将两个或多个不同蛋白质结构域进行连接，形成一个新的分子，从而具有多种不同的功能。
融合蛋白技术不仅可以产生新的蛋白质，还可以对原有蛋白质的稳定性、性质等进行调整。
例如，通过将大肠杆菌外膜蛋白（OmpA）与绿色荧光蛋白（GFP）进行融合，可以得到具有膜定位与荧光表达功能的融合蛋白，用于生物成像和药物靶向测定等领域。
3.点突变与融合蛋白技术的结合将点突变和融合技术相结合可以使得蛋白质的活性和稳定性得到双重提升。
例如，通过将发酵产物氨基酸脱羧酶（ADC）与乙醇磷酸酸转移酶（EPAT）进行融合，并进行点突变，可以得到具有更高催化效率和稳定性的蛋白质。
二、酶工程改造技术酶催化反应是生物科学和化学领域中的重要研究内容，具有广泛的应用前景。
酶工程改造技术可以通过改变酶的氨基酸组成、酶的整体结构、酶的环境条件等，调节酶的催化效率和稳定性，达到增强酶活性、改进反应过程、提高酶的选择性等目的。
酶分子的改造名词解释
酶分子的改造名词解释酶是生物体内用于催化化学反应的特殊蛋白质分子。
它们在细胞内起着至关重要的作用，参与几乎所有需要催化的生化反应。
然而，人类科学家发现，通过改造酶分子的结构和性质，可以进一步提高其催化效率和特异性，从而开辟了许多新的应用领域。
酶的改造方法可以分为两大类：一是合成生物学方法，通过改变酶分子的基因组或蛋白质序列来实现酶分子的改造；二是蛋白质工程方法，通过对酶分子的物理化学性质进行改变来实现酶的改造。
在合成生物学方法中，科学家们首先通过基因编辑技术对酶的基因组进行改造。
通过改变酶分子的基因组，可以使其产生特定的突变，从而改变酶的基本结构和性能。
例如，突变可能导致酶结构的稳定性增加，从而提高酶的催化效率；或者改变酶的亲和性，使其对底物的结合更加紧密。
此外，还可以通过引入外源基因来增强酶的催化活性或扩展其底物范围。
通过这些基因编辑技术，科学家们能够创造出全新的酶分子，具有特定的催化性质，可用于合成特定的化合物或处理环境中的有害物质。
另一方面，蛋白质工程方法是通过对酶分子的物理化学性质进行改变来实现酶的改造。
这些方法包括对酶分子的结构进行修饰、改变酶的局部结构以及引入特定的功能基团等。
例如，通过改变酶分子的酸碱性环境，可以改变其催化活性和特异性；或者通过引入特定的化学基团，可以增强酶的催化效率或改变其底物选择性。
蛋白质工程方法的发展使酶的改造更加灵活和高效，为应用于医药、环境保护、食品工业等提供了更多可能性。
酶分子的改造在许多领域中都具有广泛的应用前景。
在医药领域，改造酶分子能够增强药物的活性、改善药物的代谢途径、降低药物的副作用等。
在环境保护领域，改造酶分子可以应用于废水处理、大气污染控制等领域，从而提高环境质量和保护生态系统。
另外，改造酶还可以应用于食品工业中的食品添加剂的生产、酿酒业的发酵过程优化等。
总之，通过改造酶分子，可以创造出具有更高催化效率和特异性的酶，为我们解决许多重大问题提供了强有力的工具。
酶的基因工程改造与生产
酶的基因工程改造与生产酶是指生物体中具有催化生物化学反应的蛋白质，可以在温和条件下促进生物反应的发生。
因其具有高效、高选择性和温和的催化特性，成为工业界生产、医学领域和食品加工等领域的重要工具。
酶的基因工程改造和生产技术是实现大规模工业酶制剂生产的关键技术之一。
酶的基因工程改造酶的基因工程改造是指通过DNA重组技术将基因分离、修饰和组合，进而设计合成出具有新功能和性能的酶。
这项技术可以通过操纵目标酶的基因序列来改变其催化效率、特异性和稳定性等。
因此，酶的基因工程改造被广泛应用于生物技术、农业、医药、化工和食品工业等领域。
具体来说，酶的基因工程改造是通过以下步骤完成：1. 酶基因的克隆和表达。
将目标酶的基因序列扩增、重组和转移到表达载体中，使其可以在表达宿主中进行表达和生产。
2. 酶基因的定向演化。
通过定向演化技术对酶进行系统性改进，使其催化效率、特异性、稳定性等特性得到提高。
其中包括DNA重组、突变、异源启动子和剪接等方法。
3. 酶的进一步扩增和纯化。
将表达的目标酶发酵并经过分离、纯化和结晶等环节，使其可以达到工业生产的标准。
酶的基因工程改造技术优点在于可以通过合成和改进酶基因组达到调节酶的催化性能、调变应用环境等目的。
同时，该技术还能改变酶的物理化学特性，如催化效率、温度特性、酸碱特性，在许多工业酶制剂的生产中具有广泛应用前景。
酶的工业生产酶的工业生产是将酶类产品大规模应用于工业领域，如制浆造纸、合成食品添加剂、医药生产等，进而实现商业盈利和推动经济发展。
酶的高效生产必须结合基因工程改造技术、工艺优化和质量管理等多方面的知识和技能。
目前，酶的工业生产具有以下几个主要环节：1. 酶的基因工程改造。
通过设计合成酶基因组、利用后向技术等手段，使得酶的性能和催化效率得到大幅提升，从而达到酶的工业生产的要求。
2. 酶的发酵和生产。
酶的生产一般采用液体和固体发酵的方式，具有高效生产、规模化生产等特点。
优化发酵条件，利用基因工程的手段增加发酵附带酶的产生，大大提高了酶的生产量和分离纯度。
脂肪酶的生物学改造
脂肪酶的生物学改造叶纯1，2，王玉娟1*（1.中国科学院合肥物质科学研究院强磁场中心，合肥 230031；2.中国科学技术大学生命科学学院，合肥 230036）摘要：脂肪酶作为重要的生物催化剂，由于其反应条件温和、绿色环保被广泛应用于能源、食品、生物医药等领域，但适用于大型工业生产的经济型脂肪酶仍然有限，如何改造、开发出更多适用于工业生产中的理想型脂肪酶成为近年来研究热点。
综述了脂肪酶结构、催化机理，以及近年来脂肪酶改造的相关技术。
以期给相关科研工作者的未来研究工作以启发。
关键字：油脂；脂肪酶；改造；生物技术The biological modification of lipases and its applicationin oil industryYE Chun1,2,WANG Yujuan1*(1. High Magnetic Field Laboratory, Chinese Academy of Sciences, Hefei 230031, China; 2.School of Life Sciences, University of Science and Technology of China, Hefei 230026, China.) 随着绿色工业概念的提出，以酶作为催化剂的生物催化以其底物的高度选择性、专一性以及产物环境友好型的特点，逐渐成为工业生产中被广泛应用的催化手段。
脂肪酶是工业生产中重要的酶制剂[1]，具有催化特异性高、反应条件温和、副产物少以及环境友好等特点，被广泛应用于工业生产中，但是脂肪酶制剂造价高、酶与底物难分离、多余游离脂肪酶难回收等问题制约了天然脂肪酶的工业应用。
近年来，大量研究致力于对脂肪酶进行改造，生物技术的飞速发展更为为改造出更多适用于工业生产的理想脂肪酶制剂提供了有利的技术支持。
本文将综述脂肪酶的结构、催化机理及利用生物学技术对其进行改造的研究现状，对比各种技术优缺点。
酶分子改造的方法及应用
酶分子改造的方法及应用摘要：酶工程是研究酶的生产和应用的一门技术性学科，进入20世纪后，随着微生物发酵技术的发展和酶分离纯化技术的更新，酶制剂的研究得到不断推进并实现了其商业化生产，但直接利用酶制剂时存在酶的稳定性差、使用效率低、不能在有机溶剂中反应等缺点。
通过酶的修饰可提高酶的稳定性，消除或降低酶的抗原性，使之更适合生产和应用的要求。
近年来发展的蛋白质工程技术则使酶的定向改造成为可能。
随着生物技术的发展，酶工程将引起巨大的变革。
关键词：酶分子修饰蛋白质工程模拟酶引言：近年来，酶工程开始兴起，迅速发展，其研究成果也越来越广泛地运用于各个领域。
虽然如此，但是由于酶一离开其特定的环境条件就会变得不太稳定，不适合大批量生产的需求，因此，大规模应用酶和酶工艺的还不多。
在工业应用中，底物及产物带来的影响常常导致pH偏离酶作用的最适条件的中性范围，使酶难以发挥作用。
在临床应用上，绝大多数酶对人体而言都是外源蛋白质，具有抗原性，直接注入会引起人体的过敏反应。
所以人们希望能够通过各种人工方法改造酶，使其更能适应各方面的需要。
1.酶分子改造的方法1.1酶分子修饰酶分子修饰[1]（Modification of Enzyme Molecule）即通过各种方法使酶分子的结构发生某些改变，从而改变酶的某些特性和功能的过程。
酶分子修饰在提高酶的活力、增强酶的稳定性、降低或消除酶的抗原性、研究各种物理因素对酶分子空间构象的影响，进一步探讨酶分子的结构与功能之间的关系等方面具有重要意义。
1.1.1酶分子的主链修饰酶分子的主链修饰[2]就是利用酶分子主链（肽链或核苷酸链）的切断和连接，使酶分子的化学结构及其空间结发生某些改变，从而改变酶的特性和功能的方法。
1.1.1.2主链的切断修饰[3]主链断裂后，引起酶活性中心的破坏，酶的催化功能丧失（用于探测酶活性中心的位置）。
酶活性中心的空间构象维持不变，酶的催化功能也可以保持不变或损失不多，但是抗原性有发生改变。
酶工程改造提升淀粉酶活性策略
酶工程改造提升淀粉酶活性策略酶工程改造提升淀粉酶活性策略一、淀粉酶概述淀粉酶是一类能够水解淀粉分子中糖苷键的酶的总称。
它在众多生物过程和工业应用中都发挥着至关重要的作用。
1.1 淀粉酶的分类根据作用方式和产物的不同，淀粉酶可分为多种类型。
其中，α-淀粉酶能够随机地水解淀粉分子内部的α-1,4-糖苷键，将淀粉分解为糊精和低聚糖；β-淀粉酶则从淀粉分子的非还原端开始，依次水解α-1,4-糖苷键，生成麦芽糖；糖化酶（葡萄糖淀粉酶）可以从淀粉分子的非还原端逐个水解α-1,4-糖苷键和α-1,6-糖苷键，最终将淀粉转化为葡萄糖。
此外，还有一些其他类型的淀粉酶，如异淀粉酶、普鲁兰酶等，它们在特定的应用场景中也具有重要意义。
1.2 淀粉酶的来源淀粉酶广泛存在于自然界中，包括微生物、植物和动物。
微生物来源的淀粉酶因其易于大规模生产、酶活性高等优点而在工业中得到广泛应用。
例如，枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌等细菌能够分泌大量的α-淀粉酶；黑曲霉、米曲霉等真菌则是糖化酶的重要生产菌株。
植物来源的淀粉酶如麦芽中的淀粉酶在酿造工业中有着悠久的应用历史。
动物体内也存在淀粉酶，如唾液淀粉酶和胰淀粉酶，它们在食物消化过程中发挥着关键作用。
1.3 淀粉酶的应用领域淀粉酶在食品、酿造、纺织、造纸、医药等众多行业中都有广泛应用。
在食品工业中，淀粉酶可用于面包制作、淀粉糖浆生产、啤酒酿造等过程，能够改善产品的口感、质地和发酵性能。
在纺织工业中，淀粉酶用于退浆工艺，去除织物上的淀粉浆料，具有环保、高效等优点。
在造纸工业中，淀粉酶可用于纸张的表面施胶和涂布，提高纸张的强度和印刷性能。
在医药领域，淀粉酶可作为助消化药物，用于治疗消化不良等疾病。
二、酶工程改造技术酶工程改造技术是提高淀粉酶活性的重要手段，它主要包括理性设计和非理性设计两种策略。
2.1 理性设计理性设计是基于对酶的结构和功能的深入理解，通过定点突变等技术有目的地改变酶的氨基酸序列，从而提高其活性。
高校生物化学专业酶的工程改造技术应用前景预测
高校生物化学专业酶的工程改造技术应用前景预测随着生物化学领域的进步和发展，酶作为生物催化剂在许多领域中发挥着重要作用。
而酶的工程改造技术则提供了一种有效的手段来改善酶的性能和功能，拓展其在工业生产、医药领域等方面的应用。
本文将对高校生物化学专业酶的工程改造技术应用前景进行预测。
一、酶的工程改造技术概述酶的工程改造技术是通过通过对酶的结构和功能进行改良，以增强其活性、稳定性和选择性。
目前常见的工程改造技术包括理性设计和无序设计两种方法。
理性设计是通过对酶的结构和功能的深入研究，有针对性地进行选择性改造，以获得更高的催化效率。
通过结合计算机模拟和实验方法，可以对酶的底物结合位点、活性位点以及酶和底物之间相互作用进行设计和优化。
无序设计则是通过对酶的序列进行随机突变，进而通过筛选和筛分进行优化，获得具有更优性质的酶。
该方法无需对酶的结构进行深入了解，是一种高通量的改造方法。
二、酶工程改造技术在工业生产中的应用前景1. 生物燃料生产随着对化石燃料的依赖减少的要求越来越高，生物燃料的生产成为了研究的热点。
酶工程改造技术可以通过提高酶的催化效率和耐受性，确保生物燃料的高产出、稳定性和可持续性。
2. 化学合成酶在合成化学中有着重要的应用前景。
通过酶工程改造技术，可以提高酶的催化效率和选择性，降低化学合成的能耗和排放量。
这对于环境友好型化学合成具有重要的意义。
3. 药物生产酶在药物的合成和制备中也有广泛的应用前景。
通过酶工程改造技术，可以提高合成酶的产量和活性，减少副反应的发生，降低生产成本。
这将为药物的生产提供更加高效、安全和经济的方法。
三、酶工程改造技术在医学领域的应用前景1. 酶替代治疗酶工程改造技术可以提高酶的稳定性，并改善酶的药代动力学特性。
这使得酶在替代治疗中具有更好的持续时间和疗效，为一些酶缺陷相关性疾病（如慢性胰腺炎）的治疗提供了新的方案。
2. 酶诊断通过改造酶的底物结合位点和活性位点，可以提高酶的灵敏度和选择性。
酶工程的应用及其发展趋势
酶工程的应用及其发展趋势
酶工程是利用生物技术方法对酶进行改造和优化，以满足工业生产的需求。
它在各个领域都有广泛的应用，包括医药、食品、化学等。
以下是几个酶工程的应用及其发展趋势：
1. 医药领域：酶被广泛应用于药物合成和制药过程中。
例如，通过酶工程可以改进药物合成的效率和产量，减少副产物的生成，提高纯度和质量。
此外，酶还可以用于制造生物药物，包括蛋白质药物、抗体药物等。
未来的发展趋势是开发更多的酶药物，并提高制药过程的效率和环保性。
2. 食品工业：酶在食品工业中有广泛的应用，包括面包、啤酒、酸奶等食品的制作过程中。
通过酶工程可以改善食品的质地、口感和保鲜性。
此外，酶还可以用于食品添加剂的开发，用于改善食品的营养价值和功能性。
未来的发展趋势是开发更多的专用酶用于食品加工，提高食品的品质和安全性。
3. 环境保护：酶工程在环境保护领域有重要的应用。
例如，酶可以用于处理工业废水和污染物，降解有机废弃物和重金属污染物。
此外，酶还可以用于制备生物柴油和生物降解塑料等可再生能源和环保材料。
未来的发展趋势是开发更多具有高效降解性和低成本的酶用于环境治理和再生资源的利用。
4. 新型酶的发现和优化：酶工程的发展趋势是发现和利用新型酶及其应用。
随着生物技术的不断发展，越来越多的新酶被发现和鉴定，可以应用于各种工业过
程。
此外，通过基因工程和代谢工程的方法，可以对酶进行定向进化和改造，提高其催化活性、稳定性和特异性。
未来的发展趋势是开发更多的新型酶和创新技术，提高工业生产的效率和可持续性。
微生物酶分子改造研究进展
近年来，科研人员通过基因工程、蛋白质工程等手段对酶分子进行改造，以 提高其稳定性。以下是这方面的一些研究进展。
1、定点突变技术：通过定点突变技术，可以在酶分子中引入或替换特定的 氨基酸残基，以改变酶的稳定性。例如，将谷氨酸残基定点突变为赖氨酸，可以 提高酶在高温条件下的稳定性。
2、融合技术：将酶分子与其它蛋白质或蛋白质片段进行融合，可以改变酶 的稳定性。例如，将抑酶蛋白与目标酶进行融合，可以显著提高酶的热稳定性。
3、蛋白质工程：蛋白质工程可以利用计算机辅助设计，对酶分子进行全局 或局部的改造。通过优化酶分子的三维结构，可以显著提高酶的稳定性。
4、噬菌体展示技术：噬菌体展示技术可以利用噬菌体为载体，将目标酶分 子与噬菌体蛋白融合表达。通过选择合适的配体，可以得到高稳定性的突变体酶。
5、结构生物学指导：结构生物学可以揭示酶分子稳定性的结构基础。通过 对稳定性和不稳定性的氨基酸残基进行鉴定，可以指导改造过程，提高酶的稳定 性。
研究方法
分子酶工程的研究方法主要包括实验设计、基因克隆、定点突变、蛋白质表 达与纯化、活性检测等多个环节。首先，研究者需要根据具体需求设计实验方案， 确定需要改造的酶基因序列和蛋白质结构。接着，通过基因克隆技术将目的基因 导入表达载体中，实现目的基因的高效表达。
研究结果
近年来，分子酶工程的研究成果显著，主要表现在以下几个方面：
微生物酶分子改造研究进展
基本内容
微生物酶是一种具有高度特异性和催化效能的生物分子，在许多工业和生物 技术应用中具有重要作用。由于微生物酶的特性和功能往往取决于其蛋白质分子 的结构，因此，对微生物酶分子的改造和优化成为一个重要的研究领域。这种优 化可以通过定向进化、理性设计或组合方法来实现，以改进酶的活性、稳定性或 选择性。
定向演化设计改造酶提高酶催化活性
定向演化设计改造酶提高酶催化活性酶是生物体内催化化学反应的催化剂，在生物技术、药物工业、环境保护等领域具有重要的应用价值。
然而，许多酶在实际应用中存在催化活性低或不稳定的问题。
为了提高酶的催化活性，定向演化设计成为一种有效的方法。
定向演化是一种通过模拟进化的方式，通过引入随机突变和筛选，来改造和优化蛋白质的方法。
通过多轮的重组和筛选，可以获得催化活性更高的蛋白质酶。
定向演化设计改造酶的基本步骤如下：1. 设计变异空间：通过对目标酶的序列和结构进行分析，设计出一系列可能的突变位点。
这些突变位点通常是在酶的催化活性中起关键作用的残基。
2. 随机突变：在变异位点引入随机的突变，可以通过诱导突变或者基因重组等方法实现。
目的是获得多样性的突变体。
3. 筛选和放大：将突变体进行大规模的筛选和放大培养。
筛选方法可以是酶活检测、结构筛选、高通量筛选等。
在每一轮筛选后，选择催化活性更高的突变体进行下一轮的变异。
4. 构建遗传图谱：对筛选出来的突变体进行测序和分析，构建出突变的遗传图谱，从中挑选出携带有催化活性增强的突变。
5. 重复循环：根据突变位点和遗传图谱的分析结果，进行下一轮的定向演化，直到获得具有更高催化活性的酶。
定向演化设计改造酶的优势在于可以针对特定的催化反应进行改造，使酶在特定的条件下催化活性显著提高。
同时，定向演化可以通过结合计算生物学和实验生物学的方法，缩短酶改造的时间周期。
此外，定向演化还可以利用进化的原理，实现酶的功能扩展和优化。
然而，定向演化也存在一些挑战和限制。
首先，定向演化的过程涉及大量的实验工作和筛选步骤，需要耗费大量的时间和资源。
同时，酶的结构和功能之间的关系较为复杂，对突变位点的选择和设计也需要一定的经验和技巧。
另外，定向演化设计改造酶的过程中，如果目标酶的性质不清楚或者难以评价，就很难进行有效的设计和优化。
尽管存在一些挑战和限制，定向演化设计改造酶仍然是一种优秀的工具，可以用于改善酶的催化活性。
酶的生物改造
酶活性评估方法
初始速率法
01
通过测定酶促反应初速率来评估酶活性，常用单位时间内底物
消耗量或产物生成量表示。
连续监测法
02
利用自动生化分析仪连续监测酶促反应过程中某一反应产物或
底物浓度随时间的变化，通过计算求出酶活性。
终点法
03
通过测定酶促反应达到平衡时产物或底物的总浓度来评估酶活
性，适用于反应平衡后产物和底物浓度变化较大的情况。
酶选择性评估方法
底物特异性评估
通过测定酶对不同底物的催 化活性来评估其底物特异性 ，一般采用相对活性或选择
性系数等指标。
对映选择性评估
对于手性底物，通过测定酶 催化生成不同对映异构体的 比例来评估其对映选择性， 常用ee值（对映体过量）表
示。
区域选择性评估
对于具有多个可反应位点的 底物，通过测定酶催化不同 位点反应的比例来评估其区 域选择性，一般采用区域选 择性系数等指标。
酶稳定性评估方法
热稳定性评估
通过测定酶在不同温度下的活性保持时间来 评估其热稳定性，一般采用半衰期或失活速 率常数等指标。
pH稳定性评估
测定酶在不同pH值下的活性保持时间，以评估其 pH稳定性，常用指标包括最适pH值和pH稳定性范 围。
贮藏稳定性评估
考察酶制剂在贮藏过程中的活性变化情况， 以评估其贮藏稳定性，一般采用加速试验或 长期贮藏试验等方法。
人工模拟酶的研究进展
人工模拟酶的合成
通过化学合成或生物合成手段制备具有类似天然酶催化功能的人 工模拟酶。
人工模拟酶的催化机制
深入研究人工模拟酶的催化机制，揭示其与天然酶催化机制的异同 点。
人工模拟酶的应用
探索人工模拟酶在药物合成、环境保护、能源转化等领域的应用潜 力。
酶的改造
Myc ds-DNA的富集
实例：天冬氨酸转氨酶的热稳定性的定向进化
研究内容及执行情况
高通量筛选方法的建立
生物信息学技术手段的建立 天冬氨酸转氨酶热稳定性的改造
高通量筛选方法的建立
基于酶联免疫分析方法，选用医用检测试剂盒作为
检测试剂，建立了快速高效的酶活性检测方法，结合 使用96孔酶标板，形成了酶的高通量筛选方法。
提高镁离子浓度（常规PCR时浓度为0.5-2.5mmol/L）； 添加一定浓度的锰离子；
易错PCR方法实例
1993年，Chen and Arnold在非水相DMF中，定 向进化枯草杆菌蛋白酶E活力获得成功，在60
％和85％的DMF中，活力分别提高256和131倍；
优点：操作简便，随机用于较小基因的定向进化
科学家在线形虫体内植入 绿色荧光蛋白质
绿荧光水母—通过体内绿色 荧光蛋白发光
绿色荧光蛋白的应用
分子标记：GFP标记的微管结构
绿色荧光蛋白的应用
(a)
(b)
(c)
（d）
(e)
分子标记： FISH分析菌株
（a）未加探针；（b）DAPI染色（c）α-探针杂交（d） Msint-1268探针杂交菌株Y1；（e）Msint-1268探针杂交M. trichosporium OB3b
4、定向进化的原理
在待进化酶基因的PCR扩增反应中，利用Taq DNA聚合 酶不具有3’->5’校对功能的性质，配合适当条件， 以很低的比率向目的基因中随机引入突变，构建突变 库，凭借定向的选择方法，选出所需性质的优化酶 (或蛋白质)，从而排除其他突变体。 定向进化的基本规则是“获取你所筛选的突变体”。 定向进化=随机突变+选择。前者是人为引发的，后者 虽相当于环境，但只作用于突变后的分子群，起着选 择某一方向的进化而排除其他方向突变的作用，整个 进化过程完全是在人为控制下进行的
合成生物学酶改造设计技术的研究进展
研究现状
合成生物学酶改造设计的基本概 念和原理
合成生物学酶改造设计的基本概念和原理
合成生物学酶改造设计是指通过人工设计和改造酶的序列和结构，提高其催 化活性和稳定性，使其更适合特定的应用场景。其基本原理包括对酶的活性中心、 口袋、微环境等关键部位的定点突变、插入和删除，以改变酶的特性，如催化速 率、底物范围、热稳定性等。
农业领域
农业领域
在农业领域，合成生物学酶改造设计技术主要应用于植物生长调节、农药残 留降解和污染物分解等方面。例如，通过改造设计植物生长激素酶，提高作物的 产量和质量；通过改造设计农药降解酶，降低农产品中的农药残留量等。
环保领域
环保领域
在环保领域，合成生物学酶改造设计技术主要应用于污染物降解、废物资源 化和环境修复等方面。例如，通过改造设计污染物降解酶，清除土壤和水体中的 有害物质；通过改造设计废物资源化酶，实现废物的循环利用等。
引言
引言
合成生物学是在基因组学、蛋白质组学和代谢组学等生物信息学领域的基础 上，结合工程学原理，以重新设计生物系统为目的的一门新兴学科。其中，酶是 生物体内具有高度特异性和催化效能的蛋白质，通过合成生物学方法对酶进行改 造和设计已成为生物技术领域的重要研究方向。本次演示旨在综述合成生物学酶 改造设计技术的研究进展，以期为相关领域的研究人员提供参考和启示。
合成生物学酶改造设计技术的研 究现状和进展
合成生物学酶改造设计技术的研究现状和进展
近年来，随着基因组学和蛋白质组学的发展，越来越多的研究者开始合成生 物学酶改造设计技术的研究。例如，有研究通过基因敲除和定点突变技术，成功 提高了酵母菌中乙醇脱氢酶的活性；还有研究利用蛋白质工程和体外进化技术， 改善了脂肪酶的耐热性和底物范围。这些研究为工业生产、医学领域、农业领域 和环保领域等的应用提供了有力的支持。
酶工程学中的酶改性技术及应用
酶工程学中的酶改性技术及应用酶工程学是一门旨在运用生物化学、分子生物学和工程学的原理和方法来改良和应用酶的学科。
酶改性技术是酶工程学的重要分支之一。
酶改性技术是指对天然酶的结构或功能进行改变，使其更适合于特定的反应环境和反应条件，从而提高反应效率和产率的过程。
酶改性技术在现代工业中的应用非常广泛，被广泛应用于生物制药、食品加工、环境保护、纤维素转化等领域。
本文将从酶改性技术的基本原理、方法和应用方面进行介绍。
一、酶改性技术的基本原理酶就像生物体内的“工人”，它们能够催化化学反应发生，并增强反应中间体与底物（或反应物）之间的相互作用力，从而加速反应进程。
然而，天然酶在使用过程中存在很多限制，如其对温度、 pH 值、金属离子等因素的敏感性和不稳定性。
因此，改变酶的结构或功能是提高其稳定性和活性的关键。
酶改性技术就是通过改变酶的结构和性质，提高酶的稳定性、耐久性和反应效率的方法。
二、酶改性技术的方法酶改性技术的主要方法包括物理改性、化学改性和分子生物学改性。
（一）物理改性物理改性是指通过物理化学手段改变酶的结构和性质，以提高其催化性能和稳定性。
包括酶固定化、超声波处理、辐射处理、干燥和冷冻干燥等方法。
酶固定化是将酶与载体材料结合，形成一种稳定的复合体，使酶能够在反应体系中重复使用，提高反应效率和稳定性。
超声波处理是一种能够改变酶分子结构和剪切酶分子链的方法，可以增强酶的催化效率和稳定性。
辐射处理虽然有一定危险性，但是可以改变酶分子的物理化学性质，提高酶的催化活性和稳定性。
干燥和冷冻干燥则是通过去除水分来延长酶的保存期和增强其稳定性。
（二）化学改性化学改性是指利用化学药剂对酶进行改变酶的结构或性质，来提高酶的催化性能和稳定性。
化学改性包括磷酸化、表面修饰、共价修饰、亲和力滤除和免疫染色等方法。
其中，磷酸化是利用磷酸基与酶分子中的氨基酸残基结合而改变酶分子结构的方法；表面修饰利用化学修饰剂改变酶表面的化学性质，从而实现提高酶的稳定性和催化活性的效果；共价修饰则是利用化学交联剂交联进行酶分子交联，从而提高酶的稳定性和催化活性。
酶体外定向进化
酶体外定向进化酶体外定向进化是一种通过模拟自然进化过程，利用体外手段对酶进行改造和优化的方法。
通过采用分子定向进化技术，酶体外定向进化可以实现对酶的活性、稳定性、立体选择性的优化，甚至可以拓展酶的新功能。
这种技术的应用，使得我们能够更好地认识酶的结构与功能关系，并且为工业酶的改良和高效生产提供了强有力的手段。
在具体应用方面，酶体外定向进化已经渗透到了许多领域。
例如，在医药领域，研究者通过对药物合成关键酶的定向进化，成功提高了药物合成的效率，为药物研发提供了新的途径。
在环境保护领域，酶体外定向进化也被用于降解有毒有害物质，提高环境治理的效果。
此外，在能源和材料领域，酶体外定向进化也能够为可再生能源的转化和高效利用提供新的思路。
为了使酶体外定向进化更好地造福人类，未来的研究应该以下几个方面。
首先，需要进一步探索酶的结构与功能关系，以获得对酶优化改造更为深刻的认识。
其次，针对不同领域的需求，要开发出更加高效、稳定的酶突变体。
最后，结合、生物信息学等跨学科方法，提高酶体外定向进化的效率和预测性。
总之，酶体外定向进化作为一项新兴的技术，为酶的研究和应用开辟了新的方向。
它不仅拓展了酶的应用范围，提高了酶的性能，而且还为相关领域的研究提供了新的思路和方法。
随着技术的不断进步和应用领域的拓展，酶体外定向进化将会产生更加深远的影响，为人类社会的发展带来更多的福祉。
蛋白质工程是一种对蛋白质进行改造和优化的生物工程技术，通过对蛋白质分子的结构和功能进行设计、改造和优化，以实现特定的生物功能和性质。
这种技术在医学、农业、工业和环保等领域都有着广泛的应用前景。
本文将介绍蛋白质工程的核心概念和作用，定向进化、计算设计和实验验证等蛋白质工程的关键技术，并探讨蛋白质工程未来的发展方向和挑战。
定向进化是一种通过模拟自然进化的过程，对蛋白质进行改造和优化的技术。
这种技术的基本原理是通过随机诱变、筛选和扩增等步骤，对蛋白质分子进行选择性的进化和优化。
现代酶工程技术的应用与发展
现代酶工程技术的应用与发展现代酶工程技术是利用基因工程与生物工程的手段，对酶进行改造和优化，以提高其催化性能和稳定性。
这项技术已经在许多领域得到广泛应用，并且正在不断发展和创新。
以下是现代酶工程技术的一些应用与发展：1. 医药工业：酶工程技术可应用于制药过程中的催化反应，包括合成活性药物、生产抗生素和蛋白质药物，以及制备药物中间体等。
通过改造酶的催化活性和特异性，可以提高药物合成的效率和纯度，并减少副产物的生成。
2. 食品工业：酶工程技术可应用于食品加工中的酶解、发酵和调味等过程，例如制作酶解食品、面团添加剂和酿造食品等。
通过改造酶的催化性能和稳定性，可以提高食品加工的效率和质量，并增加产品的附加值。
3. 生物能源产业：酶工程技术可应用于生物质转化和生物燃料生产过程，例如提取可再生能源、生物乙醇和生物柴油等。
通过改造酶的底物特异性和反应温度范围，可以提高生物能源转化的效率和可持续性。
4. 环境保护：酶工程技术可应用于水处理、废弃物处理和土壤修复等环境工程领域。
通过改造酶的催化剂和降解特性，可以减少有机污染物和重金属离子等环境污染物的排放，从而实现环境保护和可持续发展。
目前，现代酶工程技术正朝着以下方向发展：1. 高效催化剂的设计和优化：通过分子模拟和结构改造等手段，探索更高效的酶催化反应机制，并优化酶的结构和活性位点，以提高催化效率和底物转化率。
2. 多功能酶的构建和应用：通过基因融合和蛋白工程等手段，将不同酶的催化活性和特异性整合到一起，构建具有多功能性的酶，并应用于复杂反应体系和细胞环境中。
3. 精准调控酶的表达和分泌：通过基因调控和信号传导等机制，实现对酶的高效表达和分泌，以提高酶的产量和纯度，并降低生产成本。
4. 纳米酶的设计和制备：通过纳米材料与酶的相互作用，实现酶的定向固定和增强其在特定反应中的稳定性和活性，以扩展酶工程技术在纳米材料制备和催化领域的应用。
总的来说，现代酶工程技术的应用和发展，有助于提高化学合成、生物转化和环境保护等行业中酶的效率和可持续性，为人类的生产和生活带来更多价值和福祉。
酶工程与代谢工程在生物催化中的应用研究
酶工程与代谢工程在生物催化中的应用研究在现代生物技术的快速发展中，酶工程和代谢工程作为两个关键领域，为生物催化带来了革命性的变革。
生物催化作为一种绿色、高效、可持续的技术手段，在医药、化工、农业等众多领域展现出了巨大的应用潜力。
酶工程和代谢工程通过对酶和细胞代谢途径的深入研究和精准调控，为生物催化的发展提供了强大的技术支持。
酶工程是指通过对酶的改造、优化和应用，实现生物催化过程的高效和特异性。
酶作为生物体内的催化剂，具有高效性、专一性和温和的反应条件等优点。
然而，天然酶在实际应用中往往存在稳定性差、活性低、对环境条件敏感等问题。
酶工程的核心任务就是解决这些问题，提高酶的性能和应用价值。
在酶工程中，酶的改造是一个重要的研究方向。
通过蛋白质工程技术，如定点突变、定向进化等，可以对酶的氨基酸序列进行改造，从而改变酶的结构和功能。
例如，通过定点突变技术，可以将酶活性中心的关键氨基酸进行替换，提高酶对底物的亲和力和催化效率。
定向进化则是在模拟自然进化的过程中，通过随机突变和筛选，获得具有优良性能的酶变体。
这种方法无需对酶的结构和功能有深入的了解，就能够有效地改进酶的性能。
酶的固定化技术也是酶工程中的关键技术之一。
将酶固定在合适的载体上，可以提高酶的稳定性，便于回收和重复使用，降低生产成本。
常见的固定化方法包括吸附法、共价结合法、包埋法等。
例如，在化工生产中，将葡萄糖异构酶固定在离子交换树脂上，用于将葡萄糖转化为果糖，大大提高了生产效率和酶的使用寿命。
除了酶的改造和固定化，酶的应用也是酶工程的重要内容。
酶在生物制药、食品工业、环境保护等领域都有着广泛的应用。
在生物制药中，酶可以用于药物的合成和修饰，如蛋白酶在胰岛素的生产中发挥着重要作用。
在食品工业中，酶可以用于食品的加工和保鲜，如淀粉酶用于淀粉的水解，果胶酶用于果汁的澄清。
在环境保护方面，酶可以用于污染物的降解，如漆酶可以降解芳香族化合物，减轻环境污染。
代谢工程则是从整个细胞代谢网络的角度出发，通过对细胞代谢途径的设计和改造，实现目标产物的高效合成。
现代生物化工中酶工程技术研究与应用
现代生物化工中酶工程技术研究与应用一、酶的基本原理二、酶工程技术的研究进展酶工程技术是将现代生物技术手段应用于酶的研究与改造上，旨在设计、改造和优化酶的结构和功能，以适应特定的工业需求。
随着生物技术的快速发展，酶工程技术的研究进展也取得了长足的进步，主要体现在以下几个方面：1. 酶的分子设计与改造。
利用分子生物学技术和蛋白工程技术，可以对酶的结构进行设计和改造，以提高其稳定性、活性和特异性。
通过点突变、蛋白工程、启动子优化等手段，可以获得更适合工业应用的酶。
2. 酶的高效表达与分离纯化。
利用重组工程技术，可以在大肠杆菌、酵母等表达宿主中高效表达目的酶，同时利用各种色谱技术和纯化策略进行酶的快速纯化，从而满足工业生产的需要。
3. 酶的固定化技术。
利用固定化技术将酶固定在载体材料上，增强其稳定性和重复利用性。
固定化技术在酶的催化活性、热稳定性和耐受性等方面具有重要的应用价值。
4. 酶的代谢工程与信号通路调控。
通过代谢工程技术和信号通路调控，可以提高酶的产量和稳定性，同时优化细胞代谢通路，提高底物转化效率和产品产量。
以上这些酶工程技术的进展，为酶在生物化工中的应用提供了坚实的技术支持，也为生物化工的发展带来了新的机遇和挑战。
三、酶工程技术在生物化工中的应用酶工程技术的不断进步，为酶在生物化工中的应用提供了更多的可能性。
当前，酶在生物化工中的应用已经涵盖了生物医药、食品、制药、环保等多个领域，为这些领域的发展提供了更多的选择和机会。
1. 生物医药领域。
酶在生物医药领域中广泛应用，如生产生物药物的关键酶、临床诊断的生物酶等。
随着基因工程、蛋白质工程等技术的不断发展，越来越多的新型酶和酶制剂被应用于临床治疗和诊断中。
2. 食品领域。
酶在食品加工领域中也扮演着重要的角色，如面包、酒、奶制品等工业生产中，酶常被用作酶制剂来改善生产工艺、提高产品品质。
3. 制药领域。
酶在制药领域也有重要的应用价值，如利用酶进行新药的发现、药物合成、代谢产物的合成等方面，都有着广阔的应用前景。
酶改造突变位点聚类
酶改造突变位点聚类
首先，从生物化学角度来看，酶改造突变位点聚类可能是由于
在酶的序列中存在着一些特定的氨基酸残基，它们在蛋白质的空间
结构中相互靠近，通过改变这些氨基酸残基的化学性质，可以使得
突变位点在空间上聚集在一起，从而影响酶的催化性能和特异性。
其次，从蛋白质工程的角度来看，酶改造突变位点聚类可能是
蛋白质工程师有意识地设计出来的。
通过对酶的序列进行定点突变，可以使得突变位点在空间上聚集在一起，从而增强酶的催化效率或
者改变其底物特异性。
此外，从生物信息学的角度来看，酶改造突变位点聚类可能会
涉及到对蛋白质序列和结构的分析。
通过对酶的序列和结构进行分析，可以发现突变位点的聚集规律，从而为酶的改造提供理论依据。
总的来说，酶改造突变位点聚类是一个涉及多个学科领域的复
杂问题，需要综合运用生物化学、蛋白质工程和生物信息学等知识
来进行研究和解决。
这个问题的深入探讨有助于我们更好地理解酶
的结构与功能之间的关系，为酶工程和蛋白质设计提供理论指导。
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特点
有效性高，是前景广阔的筛选方法
噬菌体显示筛选模式
噬菌体显示的几种类型
M13噬菌体pIII和pVIII的显示
酵母细胞表面展示法
通过锚定在酵母细胞表面的特点蛋白质与 某些外源蛋白质或多肽形成稳定的化合物，使 外源蛋白或多肽富集在酵母细胞表面的一种分 子展示技术。
核糖体显示技术
RNA-蛋白质融合技术
RNA-蛋白质的融合
寡霉素与核苷酸的连接
Myc ds-DNA的富集
实例：天冬氨酸转氨酶的热稳定性的定向进化
研究内容及执行情况
高通量筛选方法的建立 生物信息学技术手段的建立 天冬氨酸转氨酶热稳定性的改造
高通量筛选方法的建立
基于酶联免疫分析方法，选用医用检测试剂盒作为 检测试剂，建立了快速高效的酶活性检测方法，结合 使用96孔酶标板，形成了酶的高通量筛选方法。
trichosporium OB3b
绿色荧光蛋白的应用
药物筛选
绿色荧光蛋白的应用
融合表达：线粒体中表达的GFP
绿色荧光蛋白的应用
生物传感器： GFP在植物研究中的应用
噬菌体表面展示法
内涵
利用丝状噬菌体的外膜结构蛋白与某些特定 的外源蛋白或多肽分子形成稳定的复合物，使 外源蛋白或多肽富集在噬菌体表面的一种分子 展示技术
无性进化：易错PCR方法
无性进化：易错PCR方法
方法：向单一酶分子基因内随机引入突变(在PCR扩增 过程中调整反应条件），制造突变酶库以便筛选；
特点：遗传变化仅发生在单一分子内部，属于无性进化
改变4种底物的浓度比，或降低一种dNTP的量（降至5
％-10％）,加入dITP来代替被减少的dNTP. 缓冲液中另 加0.5mmol/L Mn2+
成功的例子
Reetz等 (1997) 将脂酶水解对硝基-2-甲基癸酯 的对映体选择性提高了40倍
You和Arnold (1996) 提高了枯草杆菌蛋白酶E 的表达水平和在有机溶剂中的活性，使酶的总活 力提高了500倍
Zhao和Arnold（1998）在保持酶活力不变的条 件下将枯草杆菌蛋白酶E的作用温度提高了17度
建立了改进的可高通量操作的质粒快速检测方法， 改进后的质粒快检工作量为原方法的1/3左右，可用 于高通量筛选和鉴定所构建的基因工程菌。
利用基因操作模拟自然进化的非理性设计：定向进化 不需要准确的酶分子结构信息而通过随机突变、基因 重组等方法模拟自然进化机制在体外改造酶基因，并 定向筛选出所需突变酶；
实例：木糖异构酶的定点突变改造
实例：木糖异构酶的定点突变改造
突变前蛋白与木糖复合物模型
突变后蛋白与木糖复合物模型
氨基酸残基与木糖之间距离比突变前下降，不利于体积 更大的葡萄糖底物，易于结合底物木糖，对木糖活性提高
所谓酶的体外定向进化，又称实验分子进化，属 于蛋白质的非合理设计，它不需事先了解酶的空间结 构和催化机制，通过人为地创造特殊的条件，模拟自 然进化机制(随机突变、重组和自然选择)，在体外改 造酶基因，并定向选择出所需性质的突变酶。
4、定向进化的原理
在待进化酶基因的PCR扩增反应中，利用Taq DNA聚合 酶不具有3’->5’校对功能的性质，配合适当条件， 以很低的比率向目的基因中随机引入突变，构建突变 库，凭借定向的选择方法，选出所需性质的优化酶 (或蛋白质)，从而排除其他突变体。
提高镁离子浓度（常规PCR时浓度为0.5-2.5mmol/L）； 添加一定浓度的锰离子；
易错PCR方法实例
1993年，Chen and Arnold在非水相DMF中， 定向进化枯草杆菌蛋白酶E活力获得成功，在 60％和85％的DMF中，活力分别提高256和 131倍；
优点：操作简便，随机突通过DNA连接酶的作用，将基因与载体DNA 连接在一起形成重组DNA的过程。 重组方法：黏性末端连接
平染活性的 重组噬菌体的过程。 组装方法：重组质粒载体---转化（原核和真核） 重组噬菌体载体-包装
库筛选工作量大； 适用范围：适用于较小基因的定向进化
有性进化：DNA改组方法（1994，Stemmer)
有性进化：DNA改组方法
方法：从正突变基因库中分离得到的DNA序列用酶 随机切割，得到的随机片断经不加引物的多次PCR 循环，获得全长基因，实现优势突变的组合；
特点：遗传变化仅发生在来自不同基因片断之间的 重组，所以称为有性进化；
3、基因突变库的筛选方法
目标
根据定向进化要求，在一定的环境要求下进行筛选，从 突变基因中得到所需的突变基因。 难点
突变库容量大，一般达到106，工作量巨大
关键
高通量筛选：通量大，效率高
方法
平板筛选法，荧光筛选法，噬菌体表面展示法，细胞 表面展示法
平板筛选方法
依据细胞生长情况筛选
实例：对内酰胺酶进行DNA改组，3次循环得到的 进 化酶对抗生物素头孢噻呜抗性增加32000倍；
优点：将已有的正突变基因结合，正突变效率高； 缺点：无引物PCR之前必须把DNase I去除干净，
以
有性进化：体外随机重组法（1998，Arnold)
能以单链DNA为模板，以随机序列引物进行PCR反应， 再除去模板，互为模板和引物进行装配和扩增
科学家在线形虫体内植入 绿色荧光蛋白质
绿荧光水母—通过体内绿色 荧光蛋白发光
绿色荧光蛋白的应用
分子标记：GFP标记的微管结构
绿色荧光蛋白的应用
(a)
(b)
(c)
（d）
(e)
分子标记： FISH分析菌株
（a）未加探针；（b）DAPI染色（c）α-探针杂交（d） Msint-1268探针杂交菌株Y1；（e）Msint-1268探针杂交M.
性能
筛选
目达标到蛋目的白
1
2
3
4 ……
代数
二、酶定向进化的应用
酶定向进化的典型例子
枯草杆菌蛋白酶E热稳定性的分子进化
定向进化的成功例子
β－内酰胺酶的活性提高了32,000倍； β－半乳糖苷酶的底物特异性提高了1000倍，
且活性提高66倍； 天冬氨酸转氨酶对β－支链氧代氨基酸活性提
高105倍且对缬氨酸的催化效率提高2.1×106 倍等。
2008年诺贝尔化学奖介绍
获奖
2008年度诺贝尔化学奖授予日本科学家下村修、美国科 学家马丁·沙尔菲，以及美国华裔科学家钱永健。他们三人 因为在绿色荧光蛋白（ＧＦＰ）研究和应用方面做出的突 出贡献将各分得2008年度1／3的诺贝尔化学奖奖金。
2008年诺贝尔化学奖介绍
评论
生物学有些现象只能在打碎细胞以后才能做，所以实际 上是从“死物”上来推测生物的情况。而下村修、钱永健 和马丁·沙尔菲发明的用荧光分子标记其他分子的方法，使 科学家们能在活细胞、活生物上直接观察一些生物现象。 所以，可以说是把一些“死物学”变成了真正的“生物学 （北大饶毅）
酶的生物改造
——酶的定向进化研究进展
介绍提纲 1. 定向进化技术概述 2. 定向进化技术的应用 3. 定向进化的方法
一、定向进化概述
1、酶分子改造的方法
基于序列的理性设计：化学修饰和定点突变 利用已知酶分子的特征、空间结构、结构和功能之间 关系，以及氨基酸残基功能等信息，对酶分子进行改 造；
热稳定性：温度梯度和高温环境 抗生素度 极端环境：高盐、低温、高浓毒物质
平板筛选方法
依据颜色变化筛选
大肠杆菌ß-半乳糖苷酶基因显色：噬菌体DNA载体（蓝色） 反应产物显色：磷酸酯酶水解硝基酚磷酸生成黄色硝基酚
海因酶筛选
脂肪酶筛选
2、生物自然进化的局限性
自然进化过程： 突变→自然选择→遗传后代
自然进化结果： 生物多样性 基因多样性：为完成同一功能所表现出的 多个基因或同一个基因（同源性）
局限性：周期长，效率低 ； 可控性差；
基因工程技术使得人类快速筛选工业菌种成 为可能，在几天和数月内即可完成；还可以让 人类按照自己的意愿和需要改造菌种，甚至可 以产生自然界中原本不存在的全新酶，以适应 大工业生产的需要。
三、酶定向进化的基本过程
随机突变 不同的定向进化方法 构建突变基因 载体的选择，基因重组，组建基因
突变基因的筛选 平板筛选法，荧光筛选法，表面展示法
1、定向进化的方法
无性进化方法：易错PCR法，盒式诱变 有性进化方法
1）DNA改组法（DNA Shuffling) 2）体外随机重组法（RPR) 3）交错延伸法(StEP) 基因家族的同源重组 外显子的改组 杂合进化
在自然界中，不同分子的内含子间发生同源重组， 导致不同外显子的结合，是产生新蛋白质的有效 途径之一。与DNA改组不同，外显子改组是靠 同一种分子间内含子的同源性带动，而DNA改 组不受任何限制，发生在整个基因片段上；
杂合进化
把来自不同酶分子中的结构单元或是整个酶分 子进行组合或交换，以产生具有所需性质的酶 杂合体。
平板筛选方法
依据透明圈大小筛选
淀粉酶的进化：淀粉平板培养基 豆鼓纤溶酶的进化：血纤维蛋白培养基
荧光筛选方法
利用自身荧光激发特性 生成产物本身是具有荧光激发特性的物质
利用荧光报告基因
辣根过氧化合物酶和单加氧酶的融合基因： 原理：萘→萘酚→醌类化合物（能激发荧光）
绿色荧光蛋白基因：获2008年诺贝尔化学奖
国内海藻糖的酶法制备即采用该方法；
特点：由于定向进化的高效性，被认为是 DNA改组的发展方向；
The Molecular Breeding directed molecular evolution process