荧光定量PCR实验操作流程
荧光定量PCR实验操作流程
荧光定量PCR实验操作流程1. 检查实验室条件在进行荧光定量PCR实验前，首先要检查实验室的环境是否适合实验。
实验室应该保持干燥、清洁和无菌。
检查PCR仪和读板器是否能正常运转，并准备所有必需的试剂和器械。
2. DNA/RNA的提取和纯化从组织和细胞中提取和纯化DNA/RNA是实验的第一步。
在提取和纯化DNA/RNA的过程中，需要保持无菌和正确的技术。
同时需要注意使用适当的缓冲液和酶切剂，以避免DNA/RNA的损伤和降解。
3. DNA/RNA质量检测检测DNA/RNA的质量和浓度，以确保实验结果的准确性。
可以使用紫外线光谱仪或其他质量检测设备。
同时，需要记录下每个样本的质量和浓度值。
4. 反转录如果需要检测RNA，需要首先进行反转录（Reverse Transcription，RT）。
反转录反应将RNA转录成相应的cDNA，可以使用逆转录酶和随机引物进行反转录反应。
5. 荧光定量PCR反应体系和引物设计荧光定量PCR反应体系包括模板DNA/RNA，荧光探针，引物和PCR反应缓冲液。
引物的设计是至关重要的，需要确保引物与目标序列的特异性和敏感性。
引物的设计可以使用NCBI或其他引物设计软件进行。
6. PCR反应设置PCR反应参数：温度梯度，反应时间和DNA量，浓度和样本装载量等。
注意反应器核心温度的控制，以确保反应的准确性和重复性。
7. 数据分析使用荧光定量PCR的结果进行数据分析。
可以使用数据分析软件，例如GenEx或其他软件。
计算出每个样本的阈值循环数（Ct值），并使用标准曲线法进行定量计算。
总之，荧光定量PCR是一种高灵敏度和高特异性的分子生物学检测技术，不仅可以用于基础研究，还可以用于临床诊断和治疗监测等领域。
在实验前需要认真准备，操作流程中需要注意无菌和正确的技术，以确保实验结果的准确性。
荧光定量PCR实验操作流程
荧光定量PCR实验操作流程1、实验器材多样品研磨珠均质仪台式高速冷冻型微量离心机荧光定量PCR仪超净工作台分光光度计离心管TIP头2、主要实验试剂及耗材RNA提取液三氯甲烷异丙醇无水乙醇引物75%乙醇：HyPure TMMolecular Biology Grade Water配制离心管、TIP头均购湿热灭菌40min，干燥。
二、荧光定量PCR实验步骤1、总RNA抽提（枪头和离心管均经过湿热灭菌，无RNA酶）1）取匀浆器，加入1ml的Trizol Reagent，置冰上预冷。
2）取100mg组织，加入到匀浆器中。
3）充分研磨直至无可见组织块。
4）12000rpm离心10min取上清。
5）加入250 μl三氯甲烷，颠倒离心管15s，充分混匀，静置3min。
6）4℃下12000rpm离心10min。
7）将上清转移到一新的离心管中，加入0.8倍体积的异丙醇，颠倒混匀。
8）-20℃放置15min。
9）4℃下12000rpm离心10min，管底的白色沉淀即为RNA。
10）吸除液体，加入75%乙醇1.5ml洗涤沉淀。
11）4℃下12000rpm离心5min。
12）将液体吸除干净，将离心管置于超净台上吹3min。
13）加入15μl无RNA酶的水溶解RNA。
14）55℃孵育5min。
15)使用UV1800检测RNA浓度及纯度：仪器空白调零后取2.5μl 待测RNA溶液于检测基座上，放下样品臂，使用电脑上的软件开始吸光值检测。
16）将浓度过高的RNA进行适当比例的稀释，使其终浓度为200ng/μl.左右。
2、反转录（枪头和PCR均经过湿热灭菌，无RNA酶）1）取一PCR管，加入含2μg RNA的溶液。
2）加入1μl 逆转录引物。
3）用无核糖核酸酶的去离子水补足至12μl。
4）于PCR仪上65℃保温5min，迅速置冰上冷却。
5）依次加入4μl 5×buffer，2μl 10mM dNTPs，1μl RNA inhibitor和1μl 反转录酶，用枪抽吸混匀。
荧光定量pcr实验步骤
荧光定量pcr实验步骤荧光定量PCR实验步骤引言：荧光定量PCR（qPCR）是一种广泛应用于生物学研究和临床诊断的技术，可用于准确、快速地定量检测DNA的含量。
本文将介绍荧光定量PCR实验的步骤，以及注意事项和数据分析方法。
一、实验准备1. 准备所需试剂和仪器：包括PCR反应体系的各种试剂（如引物、探针、酶等）和实时荧光定量PCR仪。
2. 根据实验设计，制定合适的实验方案。
确定需要扩增的目标序列，设计引物和探针。
二、样品处理1. 提取待测样品中的DNA，确保提取得到高质量的DNA。
可以使用商业DNA提取试剂盒进行提取，按照厂家说明进行操作。
2. 测定DNA的纯度和浓度，确保测量到的DNA适用于PCR扩增反应。
使用比色法或分光光度计检测DNA的纯度和浓度。
3. 对提取得到的DNA进行稀释，以便在PCR反应中使用。
确保稀释后的DNA浓度恰当，以避免PCR反应的干扰。
三、荧光定量PCR反应体系的准备1. 根据实验设计和目标序列的长度，计算出所需的试剂和反应体系的配比。
2. 根据计算结果，将引物、探针和模板DNA按照适当的比例加入PCR反应管中。
注意保持反应管的清洁和无菌。
3. 加入合适的PCR反应缓冲液、酶和核酸酶抑制剂等试剂。
根据实验设计的需要，可以在反应体系中添加适当的试剂，如酶切酶、胶束等。
四、PCR扩增反应1. 将PCR反应管放入实时荧光定量PCR仪中，设置好PCR反应的程序和参数。
通常包括预热、变性、退火和延伸等步骤。
2. 启动PCR反应，开始扩增。
在反应过程中，实时监测PCR产物的荧光信号强度，并记录下来。
五、数据分析与结果解读1. 在实时荧光定量PCR仪中，可以实时获得PCR反应体系中荧光信号的强度和变化趋势。
根据实验设计的需要，可以选择合适的荧光信号通道进行监测。
2. 根据荧光信号和PCR反应的周期数，可以绘制荧光增幅曲线。
通过观察曲线的形态和特征，可以初步判断PCR反应的特异性和效果。
荧光定量PCR实验使用方法
第一部分一、基本步骤：1、目的基因（DNA和mRNA）的查找和比对；2、引物、探针的设计；3、引物探针的合成；4、反应体系的配制；5、反应条件的设定；6、反应体系和条件的优化；7、荧光曲线和数据分析；8、标准品的制备；二、技术关键：1、目的基因（DNA和mRNA）的查找和比对；从/网点的genbank中下载所需要的序列。
下载的方式有两种：一为打开某个序列后，直接点击“save”，保存格式为“.txt”文件。
保存的名称中要包括序列的物种、序列的亚型、序列的注册号。
然后，再打开DNAstar软件中的Editseq软件，点击“file”菜单中的“import”，打开后点击“save”，保存为“.seq”文件。
另一种直接用DNAstar 软件中的Editseq软件，点击“file”菜单中的“open entrez sequence”，导入后保存为“.seq”文件，保存的名称中要包括序列的物种、序列的亚型、序列的注册号。
然后要对所有的序列进行排序。
用DNAstar软件中的Seqman软件，点击“sequence”菜单中的“add”，选择要比较的“.seq”的所有文件，点击“add”或“add all”，然后点击“Done”导入要比较的序列，再点击“assemble”进行比较。
横线的上列为一致性序列，所有红色的碱基是不同的序列，一致的序列用黑色碱基表示。
有时要设定比较序列的开始与结尾。
有时因为参数设置的原因，可能分为几组(contig)，若想全部放在一组中进行比较，就调整“project”菜单下的“parameter”，在“assembling”内的“minimum math percentage”默认设置为80，可调低即可。
再选择几个组，点击“contig”菜单下的“reassemble contig”即可。
选择高低的原则是在保证所分析的序列在一个“contig”内的前提下，尽量提高“minimum math percentage”的值。
荧光定量PCR操作流程
荧光定量PCR操作流程1.目的基因引物的合成设计合成200-300bp目的基因片段的引物，利用primer 5.0引物设计工具或者手工合成，引物合成过程中注意上下游的Tm值要相似、GC碱基在上下游的引物里均匀、引物与模板序列紧密互补、引物间避免形成稳定的二聚体或发夹结构等事项。
2 总RNA提取（1）准备研钵（灭菌）、离心管（1.5ML），枪头、手套（一次性）、异丙醇、乙醇，三氯甲烷2）取适量家蚕组织，加液氮充分研磨；匀浆加1ml RNAiso Plus后匀浆；3）室温放置5min （可在-70℃下保存1个月）4）加0.2ml氯仿（chloroform），振荡混匀，室温放置5分钟；5）12000g，15min，4℃；6）取上清（约0.6ml），加与上清等体积异丙醇，室温放置10分钟；7）12000g，10min，4℃；8）取沉淀（RNA呈胶状沉淀），加1ml 75%乙醇（可在-20℃保存1年）洗涤；9）12000g，5min，4℃；10）取沉淀，室温干燥10min；11）溶解于DEPC处理水中12）-80℃保存，尽快使用，或在8）保存。
3 反转录（TOYOBO试剂盒）Nuclease-free water up to 10ul5ⅹRT buffer 2ulRT Enzyme Mix 0.5ulPrimer Mix 0.5ulRNA 0.5-1ug4定量PCR反应（本实验室7300系统）SYBR 10ulForward Primer 1ulReverse Primer 1ulROXⅠ 0.4ulc DNA模板2ul一个模板重复三次以尽量减小误差；每个模板都要设内参。
内参是生物体或者细胞中稳定表达的基因，表达量几乎不变。
而后按照试剂盒说明操作流程设定仪器参数即可。
abi quantstudio 荧光定量pcr仪操作规程
abi quantstudio 荧光定量pcr仪操作规程以下是abi quantstudio 荧光定量pcr仪的操作规程：1. 打开仪器：确保电源线插入到电源插座中，按下电源开关，荧光定量PCR仪开始启动。
启动完成后，屏幕会显示主界面。
2. 准备样品：将待测样品按照实验方案进行处理和准备，包括提取和纯化核酸、制备反应体系等，确保样品标签的正确性。
3. 设置反应模板：在主界面上选择“新建实验”的选项，并选择荧光定量PCR反应模板。
根据实验需求设置反应模板，包括样品的位置、引物和探针的浓度和体积等。
4. 加载样品：根据设置的标本位置，使用注射器或微量移液器将样品逐一加载到相应的孔中。
确保每个孔都正确对应到相应的标本。
5. 设置PCR反应参数：通过点击“设置反应参数”按钮，进入PCR反应参数设置界面。
根据实验需求设置温度、时间和周期等参数。
设置完成后，保存反应参数。
6. 开始PCR反应：点击“开始实验”按钮，启动PCR反应。
仪器会自动根据设置的参数进行PCR反应。
在PCR反应过程中，可实时监测反应的进展和荧光信号的变化。
7. 数据分析：PCR反应结束后，仪器会自动停止反应。
通过点击“数据分析”按钮，可查看PCR反应结果，包括荧光信号曲线、阈值循环数和浓度等数据。
可以保存数据文件或导出结果。
8. 关机：实验结束后，点击主界面上的“关机”选项，按照仪器提示进行关机操作。
拔下电源线，清理实验平台和反应模板，保持仪器的整洁。
以上是abi quantstudio 荧光定量pcr仪的操作规程，一定要按照实验方案和操作规程进行实验，以保证实验结果的准确性和可靠性。
实时荧光定量PCR具体实验步骤
实时荧光定量PCR具体实验步骤
实时荧光定量（Real Time quantitative PCR）是检测RNA或DNA的一种常用技术，通过检测特定目标的增加（或减少），可以用来测定RNA 或DNA的表达水平，或者基因等的转录水平。
下面我们就对实时荧光定量PCR(RT-qPCR)的实验步骤进行具体介绍。
1.搭建实验
第一步是搭建实验，即准备实验所需的干燥试剂，第二步是准备RNA 样本，第三步是准备标准曲线，最后是根据实验需要准备实验板和实验试管。
2、RNA样品提取
在实验中，会使用到多种RNAs，一般情况下使用TRIzol或Phenol 抽提方法进行RNA抽提，不同的细胞、组织中RNA的杂质含量不一样，因此需要根据实验需求进行适当调整抽提浓度。
3、RT-qPCR反转录
在RT-qPCR反转录之前，首先要准备反转录试剂，一般采用qPCR反转录试剂盒，这种试剂盒含有足够的反转录荧光探针以及反转录引物，它可以有效帮助反转录过程。
反转录过程通过复制DNA片段的过程完成，最终转录出的cDNA存在细胞核中。
4、qPCR扩增实验
qPCR扩增实验是在反转录完成后进行，一般来说，这个步骤可以采用qPCR扩增试剂盒，该试剂盒中包含所需的扩增物质如DNA聚合酶、前驱核苷酸、dNTPs，检测细胞核中的cDNA。
qpcr的操作流程
qpcr的操作流程
实时荧光定量PCR（qPCR）是一种高效、准确的分子生物学技朧，广泛应用于基因表达分析、病原体检测、基因型鉴定等领域。
下面将介绍qPCR的操作流程。
1. 样品处理：首先需要从样品中提取RNA或DNA，并进行适当
的纯化处理。
确保提取的核酸质量和浓度符合实验要求。
2. 质控检测：对提取的核酸进行质控检测，包括测定纯度、浓
度和完整性。
确保核酸的质量符合实验要求。
3. 反转录：对RNA进行反转录反应，将RNA转录为cDNA。
反
转录反应需要使用逆转录酶和引物，确保反转录产物的质量和完整性。
4. 准备qPCR反应体系：根据实验设计和引物设计，准备qPCR
反应体系。
包括模板DNA或cDNA、引物、探针、核酸酶、缓冲液等。
确保反应体系的配比准确。
5. 进行qPCR反应：将准备好的反应体系加入到qPCR仪器中，
进行PCR扩增反应。
根据实验设计和引物特性，设置合适的PCR程
序和参数。
6. 数据分析：分析qPCR反应的数据，包括计算Ct值、绘制标
准曲线、计算目标基因的相对表达量等。
确保数据的准确性和可靠性。
7. 结果解读：根据数据分析结果，解读实验结果。
判断目标基因的表达水平、基因型等信息，为后续实验和研究提供参考。
总的来说，qPCR操作流程包括样品处理、质控检测、反转录、准备反应体系、进行PCR反应、数据分析和结果解读等步骤。
通过严格的实验设计和操作规范，可以获得准确、可靠的实验结果，为分子生物学研究提供重要的数据支持。
实时荧光定量PCR具体实验步骤
实时荧光定量PCR具体实验步骤1.提取样本RNA/DNA：首先，从研究对象中提取出所需的RNA或DNA样本。
可以使用商业化的提取试剂盒来完成这一步骤。
2. 反转录酶链反应（RT）：如果提取的样本为RNA，则需要先进行反转录酶链反应，将RNA转录成cDNA（即DNA拷贝），反转录酶具有多样性（M-MLV逆转录酶）和过程性（RTase）。
3.准备PCR反应体系：根据实验所需的扩增模板和引物，将PCR反应体系按照厂家提供的信息制备，通常需要包括PCR反应缓冲液、dNTPs、引物、酶、模板DNA/cDNA和稀释水。
4. 调整荧光探针的浓度：如果实验中使用到了荧光探针（如TaqMan探针、MGB探针等），需要根据实验要求对荧光探针的浓度进行调整。
5.放置PCR板：将所需的PCR试管或板放置在适当的位置，以便加载反应体系。
6.反应体系加载：按照实验所需的样品数量和模板浓度，依次向PCR反应管或板中加入反应体系。
注意，需要设置相应的阳性对照和阴性对照。
7.封闭PCR反应管/板：闭合PCR反应管或板，以防止反应体系的挥发和样品的交叉污染。
8.准备PCR仪：根据PCR仪的要求，调整PCR仪的温度和时间参数。
9.PCR扩增：将已封闭的PCR反应管或板放置在预热的PCR仪中，开始PCR扩增。
根据实验需要，设置不同的PCR程序（如热启动PCR、两步PCR和三步PCR等）。
10. 实时监测PCR过程：在PCR反应过程中，实时监测PCR反应管或板中产生的荧光信号，并记录下每个周期（cycle）的荧光值。
11. 数据分析：根据荧光信号的变化，结合标准曲线法或相对表达量法，对PCR反应中目标序列的数量进行定量分析。
常见的分析软件包括Stratagene MxPro QPCR软件和Applied Biosystems SDS软件等。
12.结果分析和解释：根据数据分析的结果，对实验结果进行解释和讨论，并在图表中呈现。
13. 结果验证：可以使用其他方法验证RT-qPCR的结果，如Western blotting、细胞免疫化学分析等。
荧光定量pcr原理和操作方法
荧光定量pcr原理和操作方法荧光定量PCR（Fluorescence quantitative PCR）是一种基于PCR技术，通过荧光信号来实时监测和定量PCR反应中的目标序列数量的方法。
本文将从原理和操作方法两个方面来详细介绍荧光定量PCR。
一、原理：荧光定量PCR的原理基于PCR反应进行，但其独特之处在于在PCR反应中引入荧光探针，通过荧光信号的实时监测来定量PCR反应中的目标序列数量。
1.引物设计：荧光定量PCR中仍需要设计引物。
引物是一对DNA片段，分别位于目标序列的上下游，用于对目标序列进行扩增。
扩增反应是由引物特异性地结合到目标序列上，并在PCR过程中进行DNA链的合成，增加DNA片段的数量。
2.荧光标记探针：与常规PCR不同的是，荧光定量PCR还需要引入荧光标记的探针。
探针是一个具有荧光标记物和荧光猝灭物（quencher）的特殊DNA片段。
探针要与目标序列上某一特定区域的序列互补，使探针与目标序列结合。
在探针结合的情况下，荧光标记物和荧光猝灭物相互靠近，导致荧光信号被猝灭。
3.荧光信号监测：荧光定量PCR在PCR反应过程中，实时检测荧光信号。
在荧光信号监测仪器的作用下，对PCR试管中的荧光强度进行连续采样。
在PCR初期，目标序列数量较少，探针与目标序列结合较少，荧光信号较小。
随着PCR反应的进行，目标序列数量增加，探针与目标序列结合增多，荧光信号增强。
通过监测PCR过程中荧光信号的变化，可以得到PCR反应过程中目标序列的实时数量。
二、操作方法：荧光定量PCR的具体操作步骤如下：1.实验室准备：准备好PCR试剂盒，包括引物、探针、聚合酶、dNTPs等。
根据实验需要，配制PCR试剂的工作液。
2.样品提取：根据实验的需要，从样本中提取出DNA模板。
如血液、组织、细胞等。
3.PCR反应体系的配制：根据实验需求和试剂盒说明书，配制PCR反应体系。
包括目标序列特异性的引物和探针，以及其他试剂如聚合酶、dNTPs等。
荧光定量PCR(染料法)实验操作SOP
荧光定量PCR实验操作SOP一、 实验目的：通过本操作获得准确、无误差、客观的样品基因扩增数据，用于下一步实验结果的分析；二、 实验准备：A.进行荧光定量PCR实验操作之前，荧光定量PCR操作实验室需紫外灯照射15分钟，关闭紫外灯后开启通风系统抽风15分钟。
B.进入荧光定量PCR操作实验室后需要佩戴一次性无菌口罩、无菌乳胶手套、实验中尽量避免与同事交谈，防止PCR模板污染；C.实验前将70%乙醇涂布于操作台及器具（移液器等）表面，两分钟后用纸巾擦除。
D.准备实验中放污染材料的器皿、用于荧光定量PCR实验操作的耗材（要求无菌）1ml 枪头、200ul枪头、10ul枪头、1.5ml离心管，用荧光定量PCR操作的试剂: 荧光定量PCRMaster Mix、Taqman Probe（实验前预先稀释浓度至25pmol）、H2O，DNA或CDNA模板（注意必须在配置完荧光定量PCR所需MIX后才可以取出）；E.一个实验区域在同一时间段只进行一种实验。
F.实验结束后移出个人专用材料（实验记录本）至个人专用区域保管；封好污染材料盛放器皿并移出至污物袋；移出共用器具至专门区域保管；将70%乙醇涂布于操作台或器具表面，两分钟后用纸巾擦除；打开紫外灯照射至少15分钟。
三、 实验步骤：1、荧光定量PCR MIX的配置：在实验记录本上记录下要进行实验的样品内容、日期、探针名称、实验样品孔信息（无特殊要求每样品每基因均按照3倍平行孔实验），然后计算出所需MIX 体积，分别加入后混匀分装至PCR扩增板，单孔荧光定量PCR孔Master Mix内容如下：Primer F: 0.5ul( 25pmol)Primer R: 0.5ul(25pmol)20×SYBER GREEN : 1.5uldNTP: 1ul(2.5mM)10*Buffer(含Mg2+) 3ulBT Taq: 0.5ulH2O: 22ulTotal: 29ul2、MIX配置好后混匀快速分装至PCR反应板，快速准确的将样品DNA/cDNA小心加入装有反应液体的反应管内，：DNA/CDNA Template: 1ul(200ng)荧光定量PCR 反应总体积：30ul3、模板加好后, 盖紧盖子并做好标记, 写上编号（用防水笔书写）；4、严格按照荧光定量PCR仪的操作手册启动机器，设置实验扩增程序（包含荧光定量PCR扩增程序、荧光定量PCR样品孔及探针激发荧光程序、反应孔体系程序），保存文件，最好以日期及样品名称命。
荧光定量pcr操作流程
荧光定量pcr操作流程荧光定量PCR操作流程。
荧光定量PCR（Quantitative PCR，qPCR）是一种用于定量检测DNA或RNA的技术，通过测定PCR反应过程中的荧光信号来定量目标分子的含量。
本文将介绍荧光定量PCR的操作流程，希望能对相关研究工作者提供一些帮助。
1. 实验前准备。
在进行荧光定量PCR实验前，首先要准备好所需的试剂和设备。
包括PCR试剂盒、引物、模板DNA或RNA样品、荧光定量PCR仪等。
确保所有试剂和设备的质量良好，避免对实验结果产生影响。
2. 反应体系设计。
根据实验需要，设计好PCR反应体系，包括引物浓度、模板DNA或RNA浓度、试剂盒成分等。
合理的反应体系设计是保证实验成功的关键，需要根据目标分子的特性和实验要求进行合理的优化。
3. PCR反应条件设置。
根据所用的PCR试剂盒和目标分子的特性，设置好PCR反应的温度、时间和循环次数等条件。
合理的PCR反应条件能够提高PCR 反应的特异性和效率，减少非特异性产物的形成。
4. 荧光定量PCR仪操作。
将混合好的PCR反应体系加入到荧光定量PCR仪中，按照仪器操作手册设置好检测参数，并启动荧光定量PCR仪进行检测。
在检测过程中，要及时观察荧光信号的变化，并根据实验要求进行数据记录和分析。
5. 数据分析与结果解读。
根据荧光定量PCR仪输出的数据，进行数据分析和结果解读。
通过标准曲线法或绝对定量法，计算出目标分子的含量，并进行结果的统计和图表展示。
同时，对实验结果进行科学的解读和讨论，得出合理的结论。
6. 实验后清理。
实验结束后，要对实验台面和仪器进行清理，保持实验环境的整洁。
同时，对实验数据进行归档和整理，做好实验记录和报告。
以上就是荧光定量PCR的操作流程，希望能为相关研究工作者提供一些参考和帮助。
在进行实验时，一定要严格按照操作流程进行，确保实验结果的准确性和可靠性。
祝实验顺利！。
荧光定量pcr实验步骤
荧光定量pcr实验步骤荧光定量PCR实验步骤荧光定量PCR（Quantitative PCR，qPCR）是一种用于测量特定DNA序列数量的技术。
它可以快速、准确地定量检测目标DNA的含量，广泛应用于基因表达分析、病原体检测、遗传变异分析等领域。
下面将介绍荧光定量PCR实验的步骤。
一、实验前准备在进行荧光定量PCR实验之前，需要做好实验前的准备工作。
1. 设计引物和探针：根据目标DNA序列设计引物和探针，确保其特异性和互补性。
2. 准备模板DNA：从样品中提取目标DNA，并进行纯化和定量。
3. 制备PCR反应体系：根据PCR反应的需要，准备好PCR反应体系，包括引物、探针、模板DNA、Taq DNA聚合酶、缓冲液和dNTP等。
4. 验证引物和探针的特异性：使用目标DNA和非目标DNA进行聚合酶链式反应，通过凝胶电泳验证引物和探针的特异性。
二、荧光定量PCR实验步骤1. 反应体系配置：按照实验设计，配置好PCR反应体系。
将引物、探针、模板DNA、Taq DNA聚合酶、缓冲液、dNTP等加入反应管中，然后加入适量的去离子水。
2. PCR反应条件设定：根据引物和探针的特性，设定PCR反应的温度和时间参数。
一般来说，PCR反应包括预变性、变性、退火和延伸四个阶段，其中变性温度为95℃，变性时间为30秒，退火温度为60℃，退火时间为30秒，延伸温度为72℃，延伸时间根据目标片段的长度而定。
3. PCR反应体系装入仪器：将装有PCR反应体系的反应管放入荧光定量PCR仪器中。
4. 荧光定量PCR实验运行：启动荧光定量PCR仪器，按照预设的PCR反应条件进行PCR反应。
仪器会根据设定的温度和时间参数进行PCR反应，并实时检测荧光信号。
5. 数据分析与结果解读：荧光定量PCR仪器会自动记录PCR反应过程中的荧光信号，根据荧光信号的变化可以计算出目标DNA的数量。
通过对比不同样品的荧光信号差异，可以定量分析目标DNA 的含量。
荧光定量PCR操作流程总结
荧光定量PCR操作流程一、RNA提取准备物品：无RNA酶大中小枪头；一套枪；trizol试剂；无RNA酶EP管（1.5mL、200uL）；DEPC水；氯仿；75%DEPC乙醇；异丙醇等1、1mLTrizol样品加200uL氯仿，用力晃动15s2、冰上静置5min3、4℃12000rpm 离心15min4、小心吸取上清水相400-500uL至新的无酶EP管5、按照体积1:1加异丙醇，颠倒混匀6、置于冰上30min7、4℃12000rpm 离心10min8、倒掉上清，加入500uL75%DEPC乙醇，轻弹管底使RNA沉淀漂起9、4℃12000rpm 离心5min10、吸上清弃掉，尽量吸干净11、12000rpm 离心5min12、吸上清弃掉，尽量吸干净，开盖超净台内凉置5min13、每管加20uLDEPC水溶解，弹管底使溶解混匀14、56℃助溶10min15、置于冰上测RNA浓度（Gen5 核酸检测执行）16、擦手纸蘸蒸馏水擦RNA浓度检测板加样孔，再用擦镜纸擦干17、1234孔各加2uLDEPC水，检测，本底为绿色即可继续测样本（2uL）18、依次按编号加入2uL样本，软件关闭后重新打开，选择样本检测19、批准出结果260/280=1.8-2则样品合格二、反转录qPCR准备物品：无RNA酶大中小枪头；无RNA酶EP管（1.5mL、200uL）；RTmix；DEPC水1、计算1000ng（反转录RNA上样量1000ng）的RNA体积，必要时稀释2、反转录体系20uL（RTmix 4uL ；RNA样品约2uL ；DEPC水补齐20uL ）3、弹管底混匀瞬时离心4、Bio-rad 中间选项takaraRT run 16min5、dd水稀释cDNA，使cDNA浓度约为10ng/uL，100uL分装后-20℃保存三、荧光定量PCR准备物品：8联管；引物；cDNA；200uLEP管；无菌枪头1、引物稀释dd水溶解稀释引物，旋涡混匀，引物储存浓度10nM/uL2、定量PCR10uL体系引物F 0.4uL引物R 0.4uLcDNA 1uL(终浓度为1ng/uL)SYBR 5uL(含染料、DNA扩增酶、DNTP、Mg2+、扩增缓冲液等)dd水3.2uL3、布板一个指标三个重复4、取10个200uL无酶EP管，按顺序编号123456789105、按照一个指标：六个孔+2个孔（防止枪误差导致各孔不均）=8孔的剂量配制混合：引物F 0.4uL*8=3.2 uL引物R 0.4uL*8=3.2 uLSYBR 5uL*8=40 uLdd水3.2uL*8=25.6 uL6、按照布板依次加入8联管中（置于冰上），最后每孔加1 uL cDNA（P5 P10 cDNA不同），设置不加cDNA模板的阴性对照。
荧光定量PCR标准操作程序
荧光定量PCR标准操作程序ABI 7500荧光定量PCR仪标准操作程序1.打开UPS电源。
2.UPS电源稳定后，依次打开电脑和PCR仪，PCR仪开机时绿、黄、红3个灯全亮，最终绿灯常亮（如果是红灯常亮，则仪器运行不正常需联系仪器维护工程师排除仪器故障）。
3.双击桌面7500Sofeware V2.0.4图标，弹出Login界面，输入用户名，单击OK，进入实验设计主界面。
4.依次Set up→Advanced Setup→Experiment Menu，进入实验手动设计界面。
5.Setup→Experiment Properties→Experiment Name输入实验名称，选择染料类型，（如需选择SYBR Green Reagents，则必须选上溶解曲线选项）。
6.Setup→Plate Setup→Define Targets and samples设定染料探针名称、添加或删除探针和选择染料探针的报告基团和猝灭基团。
→Define s amples选择添加或删除样品。
→Assign Targets and samples 图标，可设定样品（S）、阴性对照（N）和标准品（S），并在右侧的96孔显示界面中设置每管的具体位置，尽量将样品管集中于96孔界面的中央位置。
注意：每管中都需选择加入染料探针。
7.Setup→Run Method→Graphical view设定PCR反应体系总体积、循环次数、添加或删除反应的阶段和步骤，以及反应的各个阶段和步骤的时间和温度。
（注意：由于数据的采集是在实验的延伸阶段，因此延伸阶段一定要选上数据采集图标，并且延伸时间不能少于35s。
）8.设置完毕后，向样品板中加入样品，单个样品管8连管需用专用平盖封好，96孔管用专用封膜封好，轻按样品槽右侧按钮，弹出样品槽，放入样品板，使A1朝向左上角，单手按住样品槽右侧按钮，将样品槽轻轻送进机体即可。
9.单击右上角绿色START RUN图标，开始实验。
实时荧光定量PCR详细操作步骤
实时荧光定量PCR详细操作步骤1.实验前准备a.首先，准备所需的引物和探针。
引物是用于扩增待测DNA或RNA序列的短链DNA片段，而探针是荧光标记的DNA分子，用于标记和检测扩增产物。
可以使用商业引物和探针，或者设计自定义的引物和探针。
b.准备样品。
样品可以是DNA或RNA提取物，也可以是cDNA反应产物。
确保样品的质量和纯度，避免污染和降解。
c. 准备Master Mix。
Master Mix是一个预混合的反应液，包含引物、探针、核酸酶、逆转录酶、聚合酶和其他所需的试剂。
根据实验设计确定Master Mix的配方和浓度。
2.反应管设定a. 将适量的Master Mix加入每个反应管中。
根据实验设计，确定每个反应管中所需Master Mix的体积。
b.加入适量的模板DNA或RNA溶液。
根据实验设计，确定每个反应管中所需模板溶液的体积。
c.加入适量的引物和探针。
根据实验设计，确定每个反应管中所需引物和探针的体积。
d.加入适量的缓冲溶液和其他试剂。
根据实验设计，确定每个反应管中所需缓冲溶液和其他试剂的体积。
3.PCR程序设定a.设定PCR程序。
根据引物和探针的特性，确定PCR程序的温度和时间参数。
通常包括一个初始变性步骤（95°C，5分钟），40个循环的扩增步骤（95°C，30秒；温度调节，30秒；扩增，30秒-1分钟），以及最终的降温步骤（4°C或25°C）。
b.设定数据采集方式。
实时荧光定量PCR系统可以实时监测PCR反应过程中的荧光信号变化，并实时记录和分析数据。
根据实验设计和PCR程序，选择合适的数据采集方式，在合适的时间点记录荧光信号。
4.实验操作a.将反应管安置在实时荧光定量PCR仪中。
确保反应管正确放置在PCR仪的样品槽中，并密封好。
b.启动PCR程序。
根据PCR仪的操作说明，启动PCR程序并开始反应。
c. 监测PCR反应过程。
实时观察PCR反应过程中的荧光信号变化。
荧光定量PCR实验操作流程
➢用ddH2O，对仪器进行调零；取1ul的RNA溶液进行测定； ➢测定样品纯度和浓度。 ➢ 纯度：OD260/OD280 = 1.9-2.1 <1.8 蛋白质或酚类污染 >2.2 RNA水解 ➢ 浓度：RNA(ug/ml)=40﹡OD260*稀释倍数
逆转录
实验材料：HiFi-MMLV cDNA第一链合成试剂盒，RNA 实验步骤：
➢ 重复步骤8；12,000rpm离心2min，弃废液，吸附柱置于室温数分钟，以彻底晾干；
Hale Waihona Puke 细胞RNA提取5. 洗涤：
➢ 将吸附柱置于一个新的无RNase离心管（CollectionTube1.5ml）中向吸附柱的 中间部位加入30-50μl•RNase-FreeWater，室温放置1min，12,000rpm离心1min，
做5个样本，配制8个样本的预混体系，配制方式如下：
3. 将配制的预混体系，分装到八连管中。共加6个孔，每个孔中加 入18 μl的预混体系。
荧光定量PCR
4. 模板加入：
每个孔中分别加入2 μl模板，加样顺序如下：
5. 混匀，短暂离心，使管壁上的溶液收集到管底 6. P。CR反应程序：
注意事项： 1．首先配制预混体系，再将预混体系分
4. 洗涤：
➢ 向吸附柱加入700 μl Buffer RW1，12,000rpm离心20s，倒掉收集管中的废液， 将吸附柱重新放回收集管中；
➢ 向吸附柱中加入500μl•Buffer•RW2（使用前检查是否已加入无水乙醇）， 12,000rpm离心20s，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中；
上层无色水相， 中间白色蛋白质相， 下层红色有机相，
RNA在上层水相中
探针法荧光定量pcr实验流程
探针法荧光定量pcr实验流程下载温馨提示:该文档是我店铺精心编制而成，希望大家下载以后，能够帮助大家解决实际的问题。
文档下载后可定制随意修改，请根据实际需要进行相应的调整和使用，谢谢!并且，本店铺为大家提供各种各样类型的实用资料，如教育随笔、日记赏析、句子摘抄、古诗大全、经典美文、话题作文、工作总结、词语解析、文案摘录、其他资料等等，如想了解不同资料格式和写法，敬请关注!Download tips: This document is carefully compiled by theeditor. I hope that after you download them,they can help yousolve practical problems. The document can be customized andmodified after downloading,please adjust and use it according toactual needs, thank you!In addition, our shop provides you with various types ofpractical materials,such as educational essays, diaryappreciation,sentence excerpts,ancient poems,classic articles,topic composition,work summary,word parsing,copy excerpts,other materials and so on,want to know different data formats andwriting methods,please pay attention!1. 设计引物和探针：根据目标基因的序列，设计特异性的引物和探针。
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细胞RNA提取
5. 洗涤：
将吸附柱置于一个新的无RNase离心管（CollectionTube1.5ml）中向吸附柱的 中间部位加入30-50μl• RNase-FreeWater，室温放置1min，12,000rpm离心1min， 收集RNA溶液，进行后续试验或-70℃保存RNA，防止降解。• 注意：1）RNase-FreeWate体积不应小于30μl，体积过小影响回收率。 • 2）若提高RNA的产量，可用30-50 μl新的RNase-FreeWater重复步骤5。 • 3）若提高RNA浓度，可将得到的溶液重新加入到吸附柱中，重复步骤5。•
人cDNA RNase-Free Water
0 μl 57.6 μl
2 μl 7.2 μl
3. 将配制的预混体系，分装到八连管中。共加6个孔，每个孔中加 入18 μl的预混体系。
荧光定量PCR
4. 模板加入：
每个孔中分别加入2 μl模板，加样顺序如下：
加样孔 样品 1 原液 2 稀释10倍 3 稀释100 倍 4 稀释1000 倍 5 稀释10000 倍 0 水
6. RNA检测：
用ddH2O，对仪器进行调零；取1ul的RNA溶液进行测定；
测定样品纯度和浓度。
纯度：OD260/OD280 = 1.9-2.1 <1.8 蛋白质或酚类污染 >2.2 RNA水解 浓度：RNA(ug/ml)=40﹡OD260*稀释倍数
逆转录
实验材料：HiFi-MMLV cDNA第一链合成试剂盒，RNA 实验步骤：
荧光定量PCR
北京康为世纪生物科技有限公司
细胞RNA提取
样品：293T细胞 试剂：超纯RNA提取试剂盒、氯仿、70%乙醇 方法：柱式
原理：
• • 细胞在变性剂异硫氰酸胍的作用下被裂解，核蛋白体上的蛋白变性，核酸释放。 释放出来的DNA和RNA由于在特定pH和盐浓度下溶解度的不同而分别位于整个 体系中的中间相和水相，从而得以分离。
Thank You !
加入体 积
2 μl
2 μl
2 μl
2 μl
2 μl
2 μl
5. 混匀，短暂离心，使管壁上的溶液收集到管底。 6. PCR反应程序：
步骤 预变性 变性 退火/延伸 融解曲线分 析 温度 95℃ 95℃ 60℃ 95℃ 60℃ 95℃ 60℃ 时间 10min 15s 1 min 15s 1 min 15s 15s 注意事项： 1．首先配制预混体系，再将预混体系分 装到八连管中。 2. 稀释模板时，需要混匀。 不要直接在八连管管壁或管盖上做标
原液 5 μl （从1号管取） 5 μl（从2号管取） 5 μl（从3号管取） 5 μl（从4号管取）
6
45ul
对照
荧光定量PCR
2. 配制PCR预混反应体系：
做5个样本，配制8个样本的预混体系，配制方式如下：
试剂 2×UltraSYBR Mixture Forward Primer，10 µ M Reverse Primer，10 µ M 配制的8个孔的预混 体系 80 μl 6.4 μl 20 μl反应体系 10 μl 0.8 μl
材料：2×UltraSYBR Green Mixture，cDNA，actin引物
实验步骤：
1. 稀释模板：每稀释一个倍数，需要将溶液混匀，并短暂离心。
编号
1 2 3 4 5
模板稀释 倍数
1倍 10倍 100倍 1000倍 10000倍
水用量
0ul 45 μl 45 μl 45μl 45 μl
模板用量
细胞RNA提取
3. 过柱子：
吸取上层水相，至新的RNase-Free管中（注：不要吸到中层） 加入等体积70%的乙醇，颠倒混匀； 将溶液全部加入到已装入收集管（CollectionTube 2ml)的吸附柱 （Spin• Column RM）中。若一次(700ul)不能加完溶液，可分多次入； 12,000rpm离心20s，弃废液，将吸附柱重新放回收集管中；
1. 将 RNA模板、Primer Mix、dNTP Mix、DTT、RT Buffer、HiFi-MMLV和
RNase- Free Water溶解并置于冰上备用。
2. 根据以下表格配置反应体系，总体积为20 μl。
试剂 dNTP Mix，2.5 mM Each Primer Mix RNA Template 5×RT Buffer DTT，0.1 M HiFi-MMLV，200 U/μl RNase-Free Water 20 μl 反应体系 4 μl 2 μl 2 μl 4 μl 2 μl 1 μl 5 μl
4. 洗涤：
向吸附柱加入700 μl Buffer RW1，12,000rpm离心20s，倒掉收集管中的废液， 将吸附柱重新放回收集管中； 向吸附柱中加入500μl• Buffer• RW2（使用前检查是否已加入无水乙醇）， 12,000rpm离心20s，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中； 重复步骤8；12,000rpm离心2min，弃废液，吸附柱置于室温数分钟，以彻底晾干；
冰上配制 短暂离心
42℃ 50min 70℃ 15min
逆转录
3. 涡旋震荡混匀，短暂离心，使管壁上的溶液收集到管底。
4. 42℃孵育3Байду номын сангаас~50分钟，70℃孵育15分钟。反应结束后，短暂离心，置于
冰上冷却。 5. 逆转录产物可直接用于PCR和荧光定量PCR，或置于-20℃长期保存。
荧光定量PCR
细胞RNA提取
1. 裂解： 细胞悬液离心，倒掉上清，加入1ml RLT； 反复吹打，使样本充分裂解； 室温放置5min，使核酸蛋白复合物完全分离 2. 抽提： Ø 加入200ul氯仿，剧烈振荡15s，室温放置2min； Ø4℃ 12,000 rpm 离心10分钟，此时样品分为三层； 上层无色水相， 中间白色蛋白质相， 下层红色有机相， RNA在上层水相中