基因工程的酶学基础

(如加入0．5mol／L的EDTA使之在溶液中的终浓度达到
10mmol/L)螯合Mg2+，以终止反应。 此外，还可用等体积的酚抽提酶解产物，提取DNA。 如果用限制性内切酶消化DNA分子后，为了进行凝胶 电泳分析,则可直接加入凝胶电泳加样缓冲液，振荡混合
后，直接上样进行凝胶电泳。
3. DNA分子的双酶切消化
一、限制性内切酶
限制性内切酶也是一种水解酶，主要从细菌中分 离得到。在细菌体内的作用是水解“入侵”的外源 DNA 序列而保护自身DNA。水解后产生的DNA 产物 是带有5′-P和3′-OH的。
在基因克隆中使用的是R- 的 E.coli 菌株作为细菌转化的受体菌
早在20世纪中期，以Arber等人对λ噬菌体在大肠杆菌不同菌 株上的平板培养效应的研究为基础，发现了原核生物体内存在着寄 生控制的限制(restriction)和修饰(modification)系统。
（b）两条链上的断裂位置是处在一个对称结构的中心，这样 形式的断裂是形成具有平末端（Blunt end）的DNA片段。
同裂酶 (isoschizomers)
有一些来源不同的限制酶识别的是同样的核苷酸靶 序列，这类酶特称为同裂酶。
同裂酶产生同样的切割，形成同样的末端。例如， 限制酶HpaⅡ和MspI是一对同裂酶，共同的靶DNA序列 是C↓CGG。
5. DNA的分子结构
DNA分子的不同构型对限制性核酸内切酶的活性也有 很大的影响。某些限制性核酸内切酶切割超螺旋的质粒 DNA或病毒DNA所需要的酶量要比消化线性DNA的高出许 多倍，最高的可达20倍。
6.限制性核酸内切酶的缓冲液
限制性内切酶的标准缓冲液的组分包括：氯化镁、氯 化钠或氯化钾、Tris-HCl，ß -巯基乙醇或二硫苏糖醇(DTT) 以及牛血清白蛋白（BSA）等。酶活性的正常发挥，是绝 对地需要二价的阳离子，通常是Mg2+。
4.酶切消化反应的温度
DNA消化反应的温度，是影响限制性核酸内切酶活 性的另一个重要因素。 不同的限制性核酸内切酶，具有不同的最适反应温 度，而且彼此之间有相当大的变动范围。大多数限制性 核酸内切酶的标准反应温度都是37℃，但也有许多例外 的情况，它们要求37℃以外的其它反应温度。其中有些 限制性核酸内切酶的最适反应温度低于标准的37℃，例 如SmaI是25℃；有些限制性核酸内切酶的最适反应温度 则高于标准的37℃，例如Mael II是55℃。
3. DNA的甲基化程度
限制性核酸内切酶是原核生物限制—修饰体系的组成 部分，因此识别序列中特定核苷酸的甲基化作用，便会强 烈地影响酶的活性。为避免产生这样的问题在基因克隆中 使用的是失去甲基化酶/M- 的E.coli 菌株制备质粒DNA。？
如何使用 Methylase（甲基化酶） 对克隆 DNA 进行 保护？此步骤有什么意义？
在限制-修饰系统中限制作用是指一定类型的细菌可 以通过限制性酶的作用，破坏入侵的外源DNA(如噬菌体 DNA等)，使得外源DNA对生物细胞的入侵受到限制； 而生物细胞(如宿主)自身的DNA分子合成后，通过修 饰酶的作用：在碱基中特定的位臵上发生了甲基化而得到 了修饰，可免遭自身限制性酶的破坏，这就是限制-修饰 系统中修饰作用的含义。
第2章
基因工程的酶学基础
一、限制性内切酶 二、 DNA连接酶
三、 DNA聚合酶
四、其他工具酶
酶学的基本概念
1、酶的命名原则：
氧化还原酶 转移酶 水解酶 裂合酶 异构酶 连接酶
2、核酸水解酶：水解核酸链中的磷酸二酯键。
按照酶的作用方式可分为内切酶和外切酶； 内切酶在核酸链的内部切割，生成寡核苷酸； 外切酶从核酸链的末端开始，渐进式地水解核酸链，逐渐 释放单核苷酸。
（a）Pst I切割位点 , 切割后形成3′-OH的单链粘性末端， , 5'-CTGCA G-3, 5'-CTGCA G-3 3'-G ACGTC-5， 3'-G + ACGTC-5，
(b) EcoRI切割位点,切割后形成5′-P的单链粘性末端，
5'-G AATTC-3’
3'-CTTAA G-5’
二、DNA连接酶
作用：催化dsDNA分子中相邻碱基的5’-P与3’-OH间连接成磷酸二酯键
1. 大肠杆菌DNA连接酶 作用：只能催化黏性末端间的连接，需NAD＋提供能量。 2. T4噬菌体DNA连接酶 作用：催化黏性末端或平末端间的连接，连接反应需ATP
三、 DNA聚合酶
1、E.coli DNA pol I （Kornberg 酶）
2. DNA的纯度
限制性核酸内切酶消化DNA底物的反应效率，在很大程度 上是取决于所使用的DNA本身的纯度。污染在DNA制剂中的某 些物质，例如蛋白质、酚、氯仿、酒精、乙二胺四乙酸(EDTA) 、SDS(十二烷基硫酸钠)、以及高浓度的盐离子等，都有可能抑 制限制性核酸内切酶的活性。
为了提高核酸内切酶对低纯度DNA的反应效率，一般采用如下三 种方法： ①增加核酸内切限制酶的用量，平均每微克底物DNA可高达10单 位甚至更多些。 ②扩大酶催化反应的体积，以使潜在的抑制因素被相应地稀释。 ③延长酶催化反应的保温时间。 在有些DNA制剂中，尤其是按微量碱法制备的，会含有少量 的DNase的污染。由于DNase的活性需要有Mg2+的存在，而在 DNA的贮存缓冲液中含有二价金属离子螯合剂EDTA，因此在这 种制剂中的DNA仍然是稳定的。然而在加入了核酸内切酶缓冲液 之后，DNA则会被DNase迅速地降解掉。要避免发生这种情况， 唯一的办法就是使用高纯度的DNA。
1. DNA相对分子量标准物（marker); 2. pUC19 质粒 DNA 经EcoRⅠ 完全酶切； 3. pUC19 质粒 DNA 经EcoRⅠ 部分酶切； 4. 商品pUC19 质粒 DNA 总DNA的部分酶切(1～9：不同酶量消化结果)
二）限制性内切酶反应的影响因素
1. 酶的纯度：不应存在其他的酶污染
对绝大多数限制酶来说，在pH=7.4的条件下，其功能最佳。
7、星号活性（star activity）：
在“非最适的”反应条件下(包括高浓度的核酸内切限制酶、 高浓度的甘油、低离子强度、用Mn2+ 取代Mg2+ 以及高pH值等等)， 有些限制性核酸内切酶识别序列的特异性便会发生“松动”，从 其“正确”识别序列以外的其它位点切割DNA分子。
有些核酸内切限制酶的切割特异性，受所用的缓冲液成份的 影响比较明显。例如，最常用的EcoRI限制酶，在正常的情况下， 是在G↓AATTC识别序列处发生切割作用的，但如果缓冲液中的甘 油浓度超过5％(V／V)，那么其识别序列的特异性就会发生松动， 可在AATT或PuPuATPyPy序列处发生切割作用。EcoRI限制酶的这 种特殊的识别能力，通常叫做星号活性，以EcoR制性内切核酸酶相应的 甲基化酶对克隆 DNA 先进行甲基化修饰，将插入片段上该酶可能 的识别序列先行保护起来。用这种方法，不仅保护了插入片段的 大小不会改变，又有利于插入片段的回收，因为插入片段中特定 限制性内切核酸酶的识别位点被保护起来，重组后可以用特定的 限制性内切核酸酶将插入片断回收。
H代表宿主微生物的属名的第一个字母
in 为种名的头两个字母
d 代表该菌菌株
III表示该菌株属于第三个限制-修饰系统的酶
1）识别位点：
绝大多数的II型核酸内切限制酶，都能够识别由4 ～8个核苷酸组成的特定的核苷酸序列。我们称这样的 序列为核酸内切限制酶的识别序列。
切割位点的一个共同特点是，它们具有双重旋转对 称的结构形式，换言之，这些核苷酸对的顺序是呈回 文结构。
用两种不同的限制性内切酶切割同一种DNA分子， 从而产生的DNA分子片段带有两个不同的末端。 如果载体也用同样的两种酶酶切，那么就可以把外 源DNA酶切片段定向地插入到载体分子中。
4. 部分酶切/不完全酶切
有时需要得到仅在DNA片段的内部存在的部分限制 性位点切割产生的DNA，这在用待克隆片段内部存在的 限制酶位点进行克隆或/和构建酶切图谱时特别有用。 即通过控制反应条件使DNA链上 该酶的切口随机断裂，而避免所 有切口断裂的完全降解发生。
同尾酶 (isocaudamer)
与同裂酶对应的一类限制性内切酶,它们虽然来源不 同，识别的靶序列也各不相同,但都能产生相同的粘性末 端,特称为同尾酶。
常用的BamH I，Bcl I，Bgl I，Xho I就是一组同尾酶。 它们切割DNA之后都形成由-GATC- 4个核苷酸组成的粘 性末端，很显然，由同尾酶所产生的DNA片段，是能够 通过其粘性末端之间的互补作用而彼此连接起来的，因此 在基因克隆实验中很有用处。
5'-G
+
AATTC-3’
G-5’
3'-CTTAA
（c）EcoRV切割位点,切割后形成平末端。
5'-GAT ATC-3’ 5'-GAT + ATC-3’
3'-CTA TAG-5’
3`-CTA
TAG-5′
2）切割类型：
检验了非常大量的实验事例之后发现，由核酸内切限制酶的 作用所造成的DNA分子的切割类型，通常是属于下述两种独特的 排列方式之一： （a）两条链上的断裂位置是交错地、但又是对称地围绕着一 个对称轴排列，这种形式的断裂结果形成具有粘性末端（ matched ends 或 cohesive end ）的DNA片段；
克服星号活性的方法： 维持反应体系适当的离子强度、较低的温度或酶浓 度，尽可能缩短反应时间或DNA 样品的重新处理等。
三）DNA限制性内切酶酶切图谱
DNA限制性内切酶酶切图谱又称DNA的物理图谱，它由 一系列位臵确定的多种限制性内切酶酶切位点组成，以直 线或环状图式表示。在DN是不可缺少的环节。 构建DNA限制性内切酶图谱有许多方法。通常结合使用 多种限制性内切酶，通过综合分析多种酶单切及不同组合 的多种酶同时切所得到的限制性片段大小来确定各种酶的 酶切位点及其相对位臵。酶切图谱的使用价值依赖于它的 准确性和精确程度。