T淋巴细胞功能测定
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保保健健品品、、中中草草药药及及生生物物制制品品 卫卫生生毒毒理理学学的的研研究究
本文由探生科技技术人员提供,Fantibody全球抗体搜索引擎，您身边的抗体专家!
实验分组及材料
分组： 每组四人，两人一只小鼠，其中一人胸腺，一人脾脏
❖ 器材
1. 酒精棉球
若干
2. 无菌纱布块
1块/组
3. 无菌平皿
100 µl
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感谢您浏览
❖ 需要相关抗体试剂的可以访问Fantibody全球抗体搜索引擎 ❖ fantibody全球抗体搜索引擎是一个供公共检索的抗体数据库，其抗体信息数据来
源于全球范围的研究机构与商业公司。该引擎由商品化抗体数据库与抗体应用评 价数据库两部分组成，以帮助研究者更高效的寻找并评估该抗体的性能。全球抗 体搜索引擎是继基因与蛋白数据库之后更为复杂的应用型检索平台
NOTE:在稀释前一定将原细胞悬液混匀，否则细胞长时间沉淀使细胞数不准。
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细胞计数板
4
❖ 查出四个大方格的总细胞数(X) ❖ 算出每个大方格的细胞数：Y=X/4 ❖ 每个大方格的体积为V=1mm×1mm×0.1mm=0.1mm3=10-4ml ❖ 制备的细胞悬液的细胞浓度（/ml)=Y ×104×稀释倍数(50)
2011
教学要求
Βιβλιοθήκη Baidu❖ 掌握小鼠血清的分离 ❖ 掌握淋巴细胞转化试验
的基本原理及基本操作
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淋巴细胞转化试验 (Lymphocyte transformation test)
❖ 原理 ❖ 检测方法 ❖ 操作步骤 ❖ 应用
ccppmm SI Con对A照刺管激c管pmcp值m值
MMTTTT法法
((本本次次实实验验采采用用))
M TT法
期期活活的的/增/增细细殖殖胞胞
能能线线量量粒粒代代体体谢谢
琥琥珀珀酸酸脱脱氢氢酶酶 MMTTTT掺掺入入
MMTTTT
还还 原原
甲甲臜臜颗颗粒粒 ffoorrmmaazzaann
测测AA值值
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N.S. OVA N.S.
OVA
❖ 八个人一块培养板，两人加脾，两人加胸腺
加 ❖ 每孔加入100 µl调好的细胞悬液
样 ❖ 1-3孔加入10%FCS-IMDM 培养液， 100 µl
方 法
❖ 4-6孔加入2.5 µg/ml的Con A,
溶溶解解
细细胞胞内内/周/周围围
SI
ConA刺激管 A值 对照管 A值
OOVVAA免免疫疫//生生理理盐盐水水
摘摘眼眼取取血血
获获取取血血清清
无无菌菌取取脾脾//胸胸腺腺 研研磨磨成成单单细细胞胞悬悬液液(1(1//22脾脾//胸胸
腺腺++22mmllIIMM DDMM（（无无FFCCSS))
11..双双向向琼琼脂脂扩扩散散试试验验 22..酶酶联联免免疫疫吸吸附附试试验验（（ EELLIISSAA））
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❖ 细胞培养： 1. 按图所示加板。 2. 将板做好标记，在倒置显微镜下观察细胞，然后放于37℃ 5%C02培养箱 中，培养48小时。
❖ MTT掺入：（隔一天 下午2:00） 1. 在终止培养前2小时，在显微镜下观察细胞转化情况。 2. 每孔内加入MTT（5mg/ml) 10µl，加完后轻轻搕板，使MTT和细胞混 匀。 3. 在37℃ 5%C02培养箱中继续培养2小时，然后离心2000rpm，5min， 轻轻弃去上清，（注意不要将孔底部的颗粒物弃出）。 4. 加入100µl 二甲亚砜（DMSO)，将颗粒溶解。 （隔一天 下午4:00）
根根据据细细胞胞的的大大小小，，核核与与胞胞浆浆的的比比例例，，胞胞浆浆的的染染色色性性和和 核核结结构构以以及及有有无无核核仁仁等等特特征征，，分分别别计计数数淋淋巴巴母母细细胞胞、、 过过渡渡型型母母细细胞胞和和核核丝丝分分裂裂相相细细胞胞以以及及成成熟熟的的小小淋淋巴巴细细 胞胞，，以以前前三三者者为为转转化化细细胞胞，，每每份份标标本本计计数数220000个个细细胞胞，， 按按下下式式计计算算转转化化率率：：
❖ 动物及试剂
1. 小鼠
2只/组
(NS,OVA)
2. 培养液（IMDM) 无FCS 100ml/room
3. 培养液（IMDM)20%FCS 30ml/room
4. ConA（2.5,5,10µg/ml) 各1.5ml/tube
5. 白细胞计数液（2%冰醋酸）2瓶/room
6. MTT（5mg/ml)
22000000rprp mm 55mminin
3377℃℃ 55%%CCOO22培培养养 4488小小时时
酶酶标标仪仪测测吸吸光光度度值值：： AA557700nn mm
结结果果判判定定：：SSII==CCoonnAA孔孔AA值值//对对照照孔孔AA值值
培培养养终终止止前前22小小时时加加入入MMTTTT (5(5mmgg//mmll))1100µµl/l/wweellll
100 µl
❖ 7-9孔加入5 µg/ml的Con A,
100 µl
❖ 10-12孔加入10 µg/ml的Con A,
100 µl
NOTE:ConA用10%FCS-IMDM培养液配制
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返回
N.S. OVA N.S.
OVA
3377℃℃ 55%% CCOO22 继继续续培培养养22小小时时
淋巴细胞转化试验的应用
检检查查患患者者细细胞胞免免疫疫功功能能 估估计计疾疾病病的的疗疗效效及及预预后后 细细胞胞配配型型抗抗原原的的检检查查：：移移植植免免疫疫 免免疫疫药药理理学学：：具具有有免免疫疫调调节节的的药药物物、、
操 作 步 骤
细细胞胞计计数数【【??//mmll】】 取取2200µµll细细胞胞++998800µµll的的1计W 计数数液液
调调细细胞胞浓浓度度 ??//mmll××AA==11.5.5××11××110077
加加板板((三三复复孔孔)) ((加加法法见见附附图图))
小小心心弃弃去去上上清清，，加加入入110000µµl/l/ 孔孔 DDMMSSOO振振荡荡，，使使颗颗粒粒全全部部溶溶解解
❖ 结果测定： 1. 结果测量：用酶标仪测定光密度值：A570nm（用空白孔调零），记录 结果。 2. 结果判定： SI（刺激指数）=Con A刺激孔 A值 / 对照孔A值
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预习内容
❖ 单克隆抗体的制备（理论P70，实验P106） ❖ 双向免疫扩散（理论P241，实验P116）
1.5ml/room
7. 二甲亚砜（DMSO)
5ml/组
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免疫血清分离过程
摘眼球取血
RT for 2hrs
Double diffusion
1.5ml EP
Store at 4℃
Transfer serum to
a new EP
压组织，将其捣碎。然后用1000µl加样器隔着纱布将细胞悬液吸 出，放入1.5ml EP管中。
❖ 细胞计数：
1. 取上述制备好的细胞悬液混匀后取出20µl，加到盛有980µl计数液 的EP管中，在显微镜下计数，计数方法见后。
2. 调细胞浓度至1×107/ml，所需量为1.5ml，设需要的细胞悬液体 积为Aml,可按公式：?/ml×A=1.5×1×107
Rotation
3000rpm for 20min
ELISA
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实验步骤
❖ 单细胞悬液的制备：
1. 小鼠脱臼处死，用酒精棉球擦拭皮毛消毒。 2. 于超净台内取出脾和胸腺组织(各1/2)，分别放入预先盛有2ml
IMDM培养液的平皿内。 3. 将3-4层纱布覆盖到组织上，用直头镊子固定组织，用弯头镊子轻
❖ 需要相关的实验室仪器设备、生物试剂、医疗器械、制药设备、医药原料、体外 诊断试剂及耗材与技术服务信息的，可以访问探生网biomean进行咨询，期待您 的加入
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谢谢
转化率 转化的淋巴转细化胞的数淋 未巴转细化胞的数淋巴细胞数100%
33HH--TTddRR掺掺入入法法
33H-TdR掺入法
GG00
有 丝 分裂 原 特 异 性抗 原
GG11
Pr ,RNA,D NA 前 体 物质
SS 3H-TdR NNeeww DDNNAA
DNA↑ ↑ 33HH--TTddRR TTddRR
❖ 八个人一块培养板，两人加脾，两人加胸腺
加 ❖ 每孔加入100 µl调好的细胞悬液
样 ❖ 1-3孔加入10%FCS-IMDM 培养液， 100 µl
方 ❖ 4-6孔加入2.5 µg/ml的Con A, 100 µl
法 ❖ 7-9孔加入5 µg/ml的Con A,
100 µl
❖ 10-12孔加入10 µg/ml的Con A,
1块/组
4. 无菌吸头（大、中、小）4盒/room
5. 无菌96孔培养板
1块/组
6. 可调微量加样器
4套/room
7. 细胞计数板
1套/组
8. 显微镜
1台/组
9. EP管
若干
10. 眼科剪、小镊子
4套/room
11. 细胞培养箱（37℃ 5%CO2)
12. 酶标仪 13. 离心机 14. 超净台
2个/room 2个/room
原理
Lymphocytes(B/T) Mitogens Proliferation Nucleic Acid↑
Specificity Ag Transformation Protein ↑ Lymphoblast
检测方法
形形态态学学方方法法
形态学方法
淋淋巴巴母母细细胞胞主主要要表表现现有有体体积积明明显显增增大大，，是是成成熟熟淋淋巴巴细细 胞胞的的33--44倍倍；；染染色色质质疏疏松松，，核核仁仁清清晰晰可可见见；；胞胞浆浆丰丰富富并并 形形成成空空泡泡。。
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实验分组及材料
分组： 每组四人，两人一只小鼠，其中一人胸腺，一人脾脏
❖ 器材
1. 酒精棉球
若干
2. 无菌纱布块
1块/组
3. 无菌平皿
100 µl
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❖ 需要相关抗体试剂的可以访问Fantibody全球抗体搜索引擎 ❖ fantibody全球抗体搜索引擎是一个供公共检索的抗体数据库，其抗体信息数据来
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细胞计数板
4
❖ 查出四个大方格的总细胞数(X) ❖ 算出每个大方格的细胞数：Y=X/4 ❖ 每个大方格的体积为V=1mm×1mm×0.1mm=0.1mm3=10-4ml ❖ 制备的细胞悬液的细胞浓度（/ml)=Y ×104×稀释倍数(50)
2011
教学要求
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的基本原理及基本操作
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淋巴细胞转化试验 (Lymphocyte transformation test)
❖ 原理 ❖ 检测方法 ❖ 操作步骤 ❖ 应用
ccppmm SI Con对A照刺管激c管pmcp值m值
MMTTTT法法
((本本次次实实验验采采用用))
M TT法
期期活活的的/增/增细细殖殖胞胞
能能线线量量粒粒代代体体谢谢
琥琥珀珀酸酸脱脱氢氢酶酶 MMTTTT掺掺入入
MMTTTT
还还 原原
甲甲臜臜颗颗粒粒 ffoorrmmaazzaann
测测AA值值
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OVA
❖ 八个人一块培养板，两人加脾，两人加胸腺
加 ❖ 每孔加入100 µl调好的细胞悬液
样 ❖ 1-3孔加入10%FCS-IMDM 培养液， 100 µl
方 法
❖ 4-6孔加入2.5 µg/ml的Con A,
溶溶解解
细细胞胞内内/周/周围围
SI
ConA刺激管 A值 对照管 A值
OOVVAA免免疫疫//生生理理盐盐水水
摘摘眼眼取取血血
获获取取血血清清
无无菌菌取取脾脾//胸胸腺腺 研研磨磨成成单单细细胞胞悬悬液液(1(1//22脾脾//胸胸
腺腺++22mmllIIMM DDMM（（无无FFCCSS))
11..双双向向琼琼脂脂扩扩散散试试验验 22..酶酶联联免免疫疫吸吸附附试试验验（（ EELLIISSAA））
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❖ 细胞培养： 1. 按图所示加板。 2. 将板做好标记，在倒置显微镜下观察细胞，然后放于37℃ 5%C02培养箱 中，培养48小时。
❖ MTT掺入：（隔一天 下午2:00） 1. 在终止培养前2小时，在显微镜下观察细胞转化情况。 2. 每孔内加入MTT（5mg/ml) 10µl，加完后轻轻搕板，使MTT和细胞混 匀。 3. 在37℃ 5%C02培养箱中继续培养2小时，然后离心2000rpm，5min， 轻轻弃去上清，（注意不要将孔底部的颗粒物弃出）。 4. 加入100µl 二甲亚砜（DMSO)，将颗粒溶解。 （隔一天 下午4:00）
根根据据细细胞胞的的大大小小，，核核与与胞胞浆浆的的比比例例，，胞胞浆浆的的染染色色性性和和 核核结结构构以以及及有有无无核核仁仁等等特特征征，，分分别别计计数数淋淋巴巴母母细细胞胞、、 过过渡渡型型母母细细胞胞和和核核丝丝分分裂裂相相细细胞胞以以及及成成熟熟的的小小淋淋巴巴细细 胞胞，，以以前前三三者者为为转转化化细细胞胞，，每每份份标标本本计计数数220000个个细细胞胞，， 按按下下式式计计算算转转化化率率：：
❖ 动物及试剂
1. 小鼠
2只/组
(NS,OVA)
2. 培养液（IMDM) 无FCS 100ml/room
3. 培养液（IMDM)20%FCS 30ml/room
4. ConA（2.5,5,10µg/ml) 各1.5ml/tube
5. 白细胞计数液（2%冰醋酸）2瓶/room
6. MTT（5mg/ml)
22000000rprp mm 55mminin
3377℃℃ 55%%CCOO22培培养养 4488小小时时
酶酶标标仪仪测测吸吸光光度度值值：： AA557700nn mm
结结果果判判定定：：SSII==CCoonnAA孔孔AA值值//对对照照孔孔AA值值
培培养养终终止止前前22小小时时加加入入MMTTTT (5(5mmgg//mmll))1100µµl/l/wweellll
100 µl
❖ 7-9孔加入5 µg/ml的Con A,
100 µl
❖ 10-12孔加入10 µg/ml的Con A,
100 µl
NOTE:ConA用10%FCS-IMDM培养液配制
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检检查查患患者者细细胞胞免免疫疫功功能能 估估计计疾疾病病的的疗疗效效及及预预后后 细细胞胞配配型型抗抗原原的的检检查查：：移移植植免免疫疫 免免疫疫药药理理学学：：具具有有免免疫疫调调节节的的药药物物、、
操 作 步 骤
细细胞胞计计数数【【??//mmll】】 取取2200µµll细细胞胞++998800µµll的的1计W 计数数液液
调调细细胞胞浓浓度度 ??//mmll××AA==11.5.5××11××110077
加加板板((三三复复孔孔)) ((加加法法见见附附图图))
小小心心弃弃去去上上清清，，加加入入110000µµl/l/ 孔孔 DDMMSSOO振振荡荡，，使使颗颗粒粒全全部部溶溶解解
❖ 结果测定： 1. 结果测量：用酶标仪测定光密度值：A570nm（用空白孔调零），记录 结果。 2. 结果判定： SI（刺激指数）=Con A刺激孔 A值 / 对照孔A值
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预习内容
❖ 单克隆抗体的制备（理论P70，实验P106） ❖ 双向免疫扩散（理论P241，实验P116）
1.5ml/room
7. 二甲亚砜（DMSO)
5ml/组
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免疫血清分离过程
摘眼球取血
RT for 2hrs
Double diffusion
1.5ml EP
Store at 4℃
Transfer serum to
a new EP
压组织，将其捣碎。然后用1000µl加样器隔着纱布将细胞悬液吸 出，放入1.5ml EP管中。
❖ 细胞计数：
1. 取上述制备好的细胞悬液混匀后取出20µl，加到盛有980µl计数液 的EP管中，在显微镜下计数，计数方法见后。
2. 调细胞浓度至1×107/ml，所需量为1.5ml，设需要的细胞悬液体 积为Aml,可按公式：?/ml×A=1.5×1×107
Rotation
3000rpm for 20min
ELISA
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实验步骤
❖ 单细胞悬液的制备：
1. 小鼠脱臼处死，用酒精棉球擦拭皮毛消毒。 2. 于超净台内取出脾和胸腺组织(各1/2)，分别放入预先盛有2ml
IMDM培养液的平皿内。 3. 将3-4层纱布覆盖到组织上，用直头镊子固定组织，用弯头镊子轻
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谢谢
转化率 转化的淋巴转细化胞的数淋 未巴转细化胞的数淋巴细胞数100%
33HH--TTddRR掺掺入入法法
33H-TdR掺入法
GG00
有 丝 分裂 原 特 异 性抗 原
GG11
Pr ,RNA,D NA 前 体 物质
SS 3H-TdR NNeeww DDNNAA
DNA↑ ↑ 33HH--TTddRR TTddRR
❖ 八个人一块培养板，两人加脾，两人加胸腺
加 ❖ 每孔加入100 µl调好的细胞悬液
样 ❖ 1-3孔加入10%FCS-IMDM 培养液， 100 µl
方 ❖ 4-6孔加入2.5 µg/ml的Con A, 100 µl
法 ❖ 7-9孔加入5 µg/ml的Con A,
100 µl
❖ 10-12孔加入10 µg/ml的Con A,
1块/组
4. 无菌吸头（大、中、小）4盒/room
5. 无菌96孔培养板
1块/组
6. 可调微量加样器
4套/room
7. 细胞计数板
1套/组
8. 显微镜
1台/组
9. EP管
若干
10. 眼科剪、小镊子
4套/room
11. 细胞培养箱（37℃ 5%CO2)
12. 酶标仪 13. 离心机 14. 超净台
2个/room 2个/room
原理
Lymphocytes(B/T) Mitogens Proliferation Nucleic Acid↑
Specificity Ag Transformation Protein ↑ Lymphoblast
检测方法
形形态态学学方方法法
形态学方法
淋淋巴巴母母细细胞胞主主要要表表现现有有体体积积明明显显增增大大，，是是成成熟熟淋淋巴巴细细 胞胞的的33--44倍倍；；染染色色质质疏疏松松，，核核仁仁清清晰晰可可见见；；胞胞浆浆丰丰富富并并 形形成成空空泡泡。。