04碘淀粉比色法测定唾液淀粉酶

碘-淀粉比色法测定唾液淀粉酶

一 实验目的

1、 掌握比色法测定a-淀粉酶的原理；

2、 掌握分光光度计的正确使用方法；

二 实验原理

1、比色法作为一种定量分析的方法，是以生成有色化合物的显色反应为基础，通过比较或测量有色物质溶液颜色深度来确定待测组分含量的方法。常用的比色法有两种：目视比色法和光电比色法，两种方法都是以朗伯-比尔定律 (A ＝εbc)为基础。

2、血清中α-淀粉酶催化淀粉分子中α-1，4糖苷键水解，产生葡萄糖、麦芽糖及含有α-1，6糖苷键支链的糊精。

ａ-淀粉酶

淀粉 葡萄糖+麦芽糖+糊精

+

碘液 蓝色复合物

在底物过量的条件下，反应后加入碘液与未被水解的淀粉结合成蓝色复合物，其蓝色的深浅与未经酶促反应的空白管比较，从而推算出淀粉酶的含量。

3、酶活力的大小、即酶量的多少用酶活力单位（U ）（active unit ）表示。1961年国际生物化学学会酶学委员会提出采用统一的“国际单位”（IU ）来表示酶的活力，规定为：在最适条件（25℃）下，每分钟内催化1微摩尔（μmol ）底物转化为产物所需的酶量定为一个活力单位，即1IU = 1μmol /min 。这样酶的含量就可用每克酶制剂或每毫升酶制剂含有多少酶活力单位来表示（U/g 或U/ml ）。

4、 计算公式：

A A 1.65100AMY A 55X

-=⨯⨯⨯空白管吸光度测试管吸光度空白管吸光度 其中，A A A -空白管吸光度测试管吸光度

空白管吸光度

代表测定管淀粉的大致水解程度，大小范围为0～l 。当测定管淀粉未被水解时，其蛋白酶活性为0；当测定管淀粉被完全水解时，其值为1。1.61515151100

X

⨯⨯⨯⨯中，5151100⨯⨯”为碘一淀粉比色法中淀粉酶活性的单位定义-100ml 唾液中的淀粉酶，在37度5min 水解淀粉5mg 为1个单位，1.6151X ⨯⨯表示实验的测试条件：X 代表稀释后的唾液量，稀释倍数根据个人的情况而定，若50倍稀释唾液0.1ml ，则唾液量为0.002ml ，反应时间为5分钟，1.6g/L 淀粉溶液1.0ml ，即淀粉量为1.6mg 。1.61515151100

X ⨯⨯⨯⨯含义即为在实验条件下，

Xml 唾液中的淀粉酶在5分钟内水解1.6mg 淀粉，则其活性为32/X 个单位，再将其乘以水解程度，则整个公式代表了测定管淀粉酶的活性。

三 仪器与试剂

仪器：分光光度计及1cm 比色皿；吸量管；水浴锅；量筒；移液器等

试剂：1.6g/L淀粉溶液；蒸馏水；碘化钾-碘溶液

四实验步骤

1、溶液的配制：

（1）淀粉溶液的配制：称取80mg的可溶性淀粉，溶于50ml蒸馏水中，配成1.6g/L 的淀粉溶液；

（2）碘-碘化钾储备液：称取4g碘化钾及2g碘溶于100ml蒸馏水中，作为储备液；

2、取新鲜唾液，取0.1ml唾液进行稀释，稀释倍数根据个人情况而定；

3、唾液淀粉酶的测定：按下表所列在两支干净的比色管中分别加入1ml淀粉，37℃水浴5min后，在测试管中加入稀释的唾液0.1ml，充分混匀，37℃水浴5min后，分别加入0.5ml 的碘化钾—碘溶液，然后再分别在空白管和测试管中加入蒸馏水至刻度线25mL，混匀。以波长660nm，蒸馏水调零，读取各管吸光度。

加入物（ml）空白管测定管淀粉溶液（37℃水浴5min） 1.0 1.0

稀释唾液0.1

混匀，置37℃水浴水浴5m i n 碘化钾—碘溶液0.5 0.5

蒸馏水加至25mL 加至25mL

五数据处理

六注意事项

1、缓冲淀粉溶液若出现混浊或絮状物，表示缓冲淀粉溶液受污染或变质，不能再用，应重新配制。

2、如测定管吸光度小于空白管吸光度一半时，应加大唾液稀释倍数或减少稀释唾液加入量，测定结果乘以稀释倍数

3、本法亦适用于其他体液淀粉的测定，如尿液、血清等。