实时定量PCR技术综述
实时荧光定量PCR的研究进展及其应用
实时荧光定量PCR的研究进展及其应用一、本文概述实时荧光定量PCR（Real-Time Quantitative PCR，简称qPCR）是一种在分子生物学领域广泛应用的分子生物学技术，它能够在PCR 扩增过程中实时监测反应产物的积累，从而精确地定量目标DNA或RNA的初始浓度。
自20世纪90年代诞生以来，qPCR技术以其高灵敏度、高特异性、快速性和定量准确等优点，在基因表达分析、病原体检测、基因型鉴定、基因突变分析、药物研发等多个领域发挥了重要作用。
随着技术的不断发展和完善，实时荧光定量PCR已成为现代生物学研究中不可或缺的工具。
本文旨在全面综述实时荧光定量PCR技术的最新研究进展，包括其原理、方法、技术优化、应用领域的拓展以及面临的挑战等。
文章首先简要介绍qPCR技术的基本原理和常用方法，然后重点论述近年来在技术优化、多重PCR、数字化PCR等方向上的进展。
接着，本文详细探讨实时荧光定量PCR在基因表达分析、病原体检测、基因型鉴定、基因突变分析、药物研发等领域的应用案例和前景。
文章还将讨论实时荧光定量PCR面临的挑战，如引物设计、数据分析等问题，并提出相应的解决方案。
通过本文的综述，读者可以对实时荧光定量PCR技术的最新进展和应用有一个全面的了解，为相关研究提供参考和借鉴。
二、实时荧光定量PCR的基本原理与技术特点实时荧光定量PCR（Real-time Fluorescent Quantitative PCR，简称qPCR）是一种在PCR扩增过程中，通过对荧光信号的实时检测，对特定DNA片段进行定量分析的技术。
其基本原理是利用荧光染料或荧光标记的特异性探针，在PCR反应过程中实时检测PCR产物量的变化，从而得到DNA模板的初始浓度。
实时性：通过荧光信号的实时检测，可以实时了解PCR产物的生成情况，无需PCR结束后进行电泳等后续操作，大大缩短了实验时间。
定量性：通过标准曲线的建立，可以准确地计算出DNA模板的初始浓度，实现了PCR的定量分析。
实时荧光定量PCR技术综述_邓文星
生物技术通报ＢＩＯＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹＢＵＬＬＥＴＩＮ・技术与方法・２００７年第５期收稿日期：２００７－０４－１１作者简介：邓文星，山西农业大学聚合酶链反应（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｃｈａｉｎｒｅａｃｔｉｏｎ，ＰＣＲ）技术是１９８５年开始出现的一项基因检测技术。
由于ＰＣＲ技术简便易行、灵敏度高等优点，该技术被广泛应用于基础研究，成为分子生物学必不可少的研究工具。
由于传统的ＰＣＲ技术存在，不能准确定量，且操作过程中易污染而使得假阳性率高等缺点，使其应用受到局限。
对ＰＣＲ产物进行准确定量成为ＰＣＲ技术发展的重要方向［１￣３］。
定量ＰＣＲ（ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅＰＣＲ，Ｑ－ＰＣＲ）先后出现了多种方法，目前为止，其中结果最为可靠的就是实时荧光定量ＰＣＲ（Ｒｅａ１ｔｉｍｅｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅＰＣＲ，Ｒｅａｌ－ｔｉｍｅＱ－ＰＣＲ）。
１９９６年，实时荧光定量ＰＣＲ技术由美国ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ公司首先推出。
这项技术是指在ＰＣＲ反应体系中加入荧光染料或荧光基团，利用荧光信号来实时监测整个ＰＣＲ进程，最后通过标准曲线对未知模板浓度进行定量分析。
其特点有：（１）用产生荧光信号的指示剂显示扩增产物的量，进行实时动态连续的荧光监测，避免终点定量的不准确，并且消除了标本和产物的污染，且无复杂的产物后续处理过程。
（２）荧光信号通过荧光染料嵌入双链ＤＮＡ，或荧光探针特异结合目的检测物等方法获得，大大提高了检测的灵敏度、特异性和精确性［４，５］。
Ｒｅａｌ－ｔｉｍＱ－ＰＣＲ可以应用于ｍＲＮＡ表达的研究、ＤＮＡ拷贝数的检测、单核苷酸多态性的测定、细胞因子的表达分析、肿瘤耐药基因表达的研究以及病毒感染的定量监测。
１实时荧光定量ＰＣＲ技术的基本原理在ＰＣＲ反应体系中加入荧光染料或荧光基团，这些荧光物质有其特定的波长。
仪器可以自动检出，利用荧光信号积累，实时监测整个ＰＣＲ进程，在ＰＣＲ循环中，测量的信号将作为荧光阈值的坐标。
简述实时荧光定量PCR技术的原理
简述实时荧光定量PCR技术的原理
实时荧光定量PCR（Real-time quantitative PCR, qPCR）是一种用于检测和定量DNA或RNA的方法。
它结合了传统的PCR技术和荧光探针技术，可以实时监测PCR反应的进程，并根据荧光信号的强度来确定目标物质的数量。
实时荧光定量PCR的原理如下：
1. PCR反应体系：反应体系中包含目标DNA或RNA模板、引物（一对用于扩增目标序列的寡核苷酸片段）、荧光探针和酶。
荧光探针通常由一个与目标序列互补的序列和一个带有荧光物质和荧光物质猝灭物质的序列构成。
2. 扩增过程：PCR反应通过一系列的温度循环来进行。
首先是变性步骤，将DNA 或RNA模板变性为单链。
然后是退火步骤，引物与目标序列互补结合。
最后是延伸步骤，酶在合适的温度下合成新的DNA链。
3. 荧光信号检测：在PCR反应过程中，荧光探针与目标序列的结合会导致荧光信号的释放。
荧光信号的强度与目标序列的数量成正比。
实时荧光定量PCR系统可以实时监测荧光信号的强度，并记录下来。
4. 分析和定量：通过实时荧光定量PCR系统记录的荧光信号强度曲线，可以确定PCR反应的阈值周期数（CT值）。
CT值表示在达到阈值信号强度时，PCR 反应的循环数。
根据CT值，可以计算出目标序列在初始反应体系中的起始数量。
实时荧光定量PCR技术具有高灵敏度、高特异性和高准确性的特点，广泛应用于基因表达分析、病原体检测、突变分析等领域。
简述实时定量pcr的原理和应用
简述实时定量PCR的原理和应用1. 实时定量PCR简介实时定量PCR（quantitative real-time PCR, qPCR）是一种用于检测和定量DNA 或RNA的技术。
相比传统PCR技术，实时定量PCR可以快速、准确、高灵敏地测量靶分子的数量。
该技术广泛应用于生物医学研究、基因表达、疾病诊断等领域。
2. 实时定量PCR原理实时定量PCR基于传统PCR技术，通过引入荧光探针来实时监测PCR反应的进行。
其基本原理如下：•步骤1：DNA样本的准备与处理。
从待检测的样本中提取DNA，并对其进行纯化和定量。
•步骤2：引物设计和荧光探针制备。
根据目标DNA序列设计特异性引物和荧光探针。
•步骤3：PCR反应的进行。
将DNA模板与引物、荧光探针和PCR反应液混合，通过一系列的温度循环对DNA进行扩增。
•步骤4：荧光信号检测与分析。
在PCR反应过程中，荧光探针与目标DNA结合，并发出荧光信号。
荧光信号的强度与目标DNA的数量成正比，通过荧光信号的实时监测和分析，可以推断出DNA的起始量。
3. 实时定量PCR的应用实时定量PCR广泛应用于许多领域，包括：3.1 基因表达分析实时定量PCR可以定量检测基因在不同组织、不同时期、不同条件下的表达水平变化。
通过相对定量和绝对定量分析，可以研究基因的功能、调控机制及调控因子。
3.2 病原体检测实时定量PCR对病原体的检测具有高度灵敏性和特异性。
通过特异性引物和荧光探针的设计，可以快速、准确地检测病毒、细菌、真菌等病原体。
3.3 疾病诊断实时定量PCR在疾病诊断方面有广泛应用。
例如，它可以检测癌症相关基因的突变、染色体重排等变异，从而为癌症的早期诊断和治疗提供重要参考。
3.4 转基因检测实时定量PCR可以用于转基因生物的快速检测。
利用特异性引物和荧光标记的转基因探针，可以检测食品、农作物中是否存在转基因成分。
3.5 环境监测实时定量PCR可以用于环境中微生物的监测和定量分析。
实时荧光定量PCR技术详解和总结
实时荧光定量PCR技术详解和总结
一、什么是实时荧光定量PCR
实时荧光定量PCR（Real-Time Quantitative Polymerase Chain Reaction，简称RT-qPCR）是一种PCR扩增技术，具有灵敏度高、重复性好等特点，可以在实时监测PCR扩增过程中特定片段DNA的产生。
它可以用来检测细胞中其中一特定基因mRNA的表达水平，从而揭示基因活动和表达情况，同时用于特定基因检测，如非病毒性疾病的病原检测以及芯片高通量分析等。
二、实时荧光定量PCR的基本原理
实时荧光定量PCR其基本原理就是利用PCR技术，在特定温度、适当时间内，将少量的模板 DNA 放大成数十亿倍以上。
实时荧光定量PCR的一大特点就是，它能够在实时监测PCR的扩增过程中，随时得知扩增物（amplicon）的数量。
根据扩增的量，从而确定所检测样本中的特定片段DNA的数量，即“定量”。
实时荧光定量PCR可实现定量检测，是因为它引入了一种特殊的参考基因，即“内参基因”，其用来抵消PCR条件、酶种类、反应液等的影响，从而测定量结果的准确性。
三、实时荧光定量PCR的实验步骤
（一）模板提取和核酸纯化：根据实验材料，提取DNA或RNA模板，进行核酸纯化，获得纯度较高的核酸。
（二）制备PCR反应液：制备由dNTPs、PCR酶、聚合酶等试剂组成的PCR反应液，根据所要检测的基因。
实时荧光定量PCR技术研究进展及其应用
实时荧光定量PCR技术研究进展及其应用实时荧光定量PCR技术研究进展及其应用随着分子生物学和遗传学的发展，实时荧光定量PCR技术（quantitative real-time PCR）在生物医学研究和医学检测中得到了广泛的应用。
实时荧光定量PCR技术是PCR技术的一种改良版，能够实时监测PCR反应的进程，实现对DNA或RNA的定量分析。
本文将综述实时荧光定量PCR技术的研究进展以及其在医学领域中的应用。
一、实时荧光定量PCR技术的原理及方法实时荧光定量PCR技术利用特定荧光探针以及相应的荧光探测系统，通过测量荧光信号的增加来定量分析PCR反应中基因的拷贝数。
具体步骤如下：首先，通过DNA提取或RNA提取获得待检测物质的样本。
接着，将获得的DNA或RNA经过逆转录反应合成cDNA，以备进行PCR扩增。
然后，在PCR反应混合液中加入特定引物和荧光探针。
引物是用于扩增待检基因的片段，而荧光探针则是用于实时监测扩增过程中产生的DNA量。
荧光探针通常由一个碱基特异的标记染料和一个荧光供体相连，当探针与待检基因的DNA结合时，标记染料和荧光供体的空间关系发生改变，导致荧光强度的变化。
接下来，在实时荧光定量PCR仪中进行PCR扩增。
仪器通过加热、冷却等步骤循环进行，同时测量荧光信号的强度。
实时荧光定量PCR技术能够在PCR反应过程中记录和监测荧光信号的增加，从而实现对样本中待检基因的定量分析。
最后，根据荧光信号的强度变化，通过标准曲线法或绝对定量法计算出待检基因在样本中的拷贝数。
标准曲线法通过制备一系列浓度已知的标准品，绘制标准曲线并求出待检样品中的基因拷贝数。
绝对定量法则是通过计算PCR反应的阈值周期数（Ct值）并结合样品的稀释倍数得出基因拷贝数。
二、实时荧光定量PCR技术的应用实时荧光定量PCR技术在医学领域中的应用广泛且多样，以下列举了其中几个典型应用：1. 疾病诊断实时荧光定量PCR技术能够定量检测体内的病原体，如病毒、细菌等，并帮助医生进行疾病的早期诊断。
实时定量pcr的原理及应用
实时定量PCR的原理及应用一、什么是实时定量PCR？实时定量聚合酶链反应（Real-time quantitative Polymerase Chain Reaction），简称实时定量PCR，是一种高度敏感且快速的核酸检测技术。
它不仅可以定性地检测目标核酸序列的存在与否，还可以精确测量目标序列的数量。
二、实时定量PCR的原理实时定量PCR利用DNA聚合酶的酶活性，在双链DNA模板上合成新的DNA 链。
该技术的原理是：首先，通过一个DNA引物与目标DNA序列特异性结合，并将DNA聚合酶带有荧光标记的探针与其结合。
然后，在每一轮的PCR循环中，DNA聚合酶将合成新的DNA链，并释放一个荧光信号。
这个荧光信号可以实时地被特定的检测设备及时检测到。
根据荧光信号的量，可以判断目标DNA序列的数量。
实时定量PCR主要包含以下步骤：1.DNA模板的制备：包括从生物样本中提取DNA，如细胞、组织或血液等；2.引物的设计：设计两个与目标DNA序列特异性结合的引物，确保引物的长度和温度适宜；3.反应体系的准备：准备PCR反应体系，包括引物、荧光标记的探针以及DNA聚合酶等；4.PCR循环条件的设定：确定PCR循环的温度和时间条件以实现合成新的DNA链；5.实时检测和数据分析：通过特定的实时定量PCR设备实时检测荧光信号，并根据标准曲线计算目标DNA序列的数量。
三、实时定量PCR的应用实时定量PCR在生物医学研究和临床诊断中具有广泛的应用。
以下是实时定量PCR常见的应用领域：1. 生物学研究实时定量PCR可以用于研究基因表达的变化，从而揭示生物体内基因调控的机制。
它可以定量测量不同组织或细胞中特定基因的表达水平，帮助科研人员了解基因在不同生理状态下的功能和调控网络。
2. 分子诊断实时定量PCR在疾病的分子诊断中扮演着重要角色。
通过对人体样本中特定基因的定量检测，可以帮助医生确定某些疾病的存在，并评估疾病的严重程度。
实时荧光定量PCR技术详解和总结
实时荧光定量PCR技术详解和总结实时荧光定量PCR技术是一种用于测定DNA样本中特定序列的数量和表达水平的分子生物学技术。
它能够在PCR反应进行过程中实时监测PCR 产物的扩增情况，通过检测荧光信号的强度和PCR循环次数来确定起始模板的数量。
该技术具有高灵敏度、准确性和广泛的应用领域，被广泛用于基因表达分析、病原微生物的定量检测和分子诊断等领域。
在使用引物和探针系统进行实时荧光定量PCR时，引物通过与模板DNA序列的互补配对，在PCR扩增过程中结合并扩增目标序列，而探针是一种荧光标记的序列，通过与目标序列的特定区域配对来检测PCR产物的扩增。
当目标序列存在于DNA模板中时，引物与探针结合扩增会释放出荧光信号。
荧光信号的强度与PCR产物的数量成正比，通过监测荧光信号的强度和PCR循环数，可以推导出起始模板的数量。
SYBR Green是一种无标记引物的特殊荧光染料，可以与扩增产物的双链DNA结合并发出荧光信号。
在PCR扩增反应中，SYBR Green会通过与扩增产物结合形成复合物，并发出荧光信号。
由于SYBR Green能与任意DNA结合形成复合物，所以在使用SYBR Green进行实时荧光定量PCR 时，需要进行特异性验证和内参基因的设计，以确保准确测量目标序列的数量。
在实时荧光定量PCR技术中，还需要进行标准曲线法来定量PCR产物的数量。
标准曲线法是通过制备一系列已知浓度的标准DNA模板并进行PCR反应，测量荧光信号的强度和标准DNA模板的浓度之间的关系，建立一个标准曲线。
然后，通过测量待测样品PCR反应的荧光信号强度，根据标准曲线来计算待测样品中目标序列的起始模板数量。
总结来说，实时荧光定量PCR技术是一种高灵敏度、准确度和广泛应用的分子生物学技术，可以实时监测PCR反应中荧光信号的强度来确定PCR产物的数量。
它的基本原理包括使用引物和探针系统或SYBR Green 染料来检测PCR反应产物的扩增，并通过荧光信号强度和PCR循环数来推导起始模板的数量。
实时荧光定量PCR技术及其应用研究进展
实时荧光定量PCR技术及其应用研究进展实时荧光定量PCR技术是近年来迅速发展的一种生物技术手段，它具有快速、精准、高灵敏度和高特异性等特点，被广泛应用于基因表达分析、基因型鉴定、细菌和病毒等微生物检测、肿瘤标志物测定等多个领域。
本文将介绍实时荧光定量PCR技术的原理、方法及其在不同领域中的应用研究进展。
一、实时荧光定量PCR技术原理实时荧光定量PCR技术是一种将PCR扩增与实时荧光检测相结合的技术，它可以同时进行DNA扩增和检测，实时监测扩增过程中荧光信号的强度，从而直接定量目标DNA的含量。
其原理主要包括引物设计、扩增反应、荧光探针和检测系统。
1. 引物设计实时荧光定量PCR技术需要使用两对引物，分别是特异性引物和荧光标记的引物。
特异性引物即PCR扩增所需的引物，而荧光标记的引物是一种能够与目标DNA结合并产生荧光信号的特殊引物。
2. 扩增反应扩增反应是实时荧光定量PCR的核心部分，它通过多轮循环反应使目标DNA序列不断扩增，同时释放出荧光信号。
荧光信号的强度与目标DNA的数量成正比，可以实时监测扩增过程。
3. 荧光探针在扩增反应中加入荧光标记的探针，这种探针通常由一个荧光素和一个受体组成，当探针与目标DNA结合时，荧光素就会释放出荧光信号。
4. 检测系统实时荧光定量PCR技术需要使用专门的实时荧光PCR仪来检测荧光信号，不同的仪器有不同的检测系统，但原理基本相同，即通过检测荧光信号的强度来定量目标DNA的含量。
实时荧光定量PCR技术主要包括SYBR Green I法和探针法两种方法。
1. SYBR Green I法SYBR Green I是一种DNA结合染料，可以与PCR扩增产物结合并产生强烈的荧光信号。
使用SYBR Green I法时，需要同时使用特异性引物和SYBR Green I染料，PCR扩增产物会结合SYBR Green I染料产生荧光信号，实时检测扩增过程中的荧光强度。
2. 探针法探针法是另一种实时荧光定量PCR技术，它需要使用荧光标记的探针来与目标DNA结合产生荧光信号。
实时荧光定量PCR技术
简述实时荧光定量PCR技术1.实时荧光定量PCR技术的原理所谓实时荧光定量PCR技术，是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。
该技术结合了实时定量PCR仪、实时荧光定量试剂、通用电脑和自动分析软件，构成PCR-DNA/RNA实时荧光定量检测系统。
实时PCR的设想是由Higuchi于1992年最早提出[1]。
荧光探针技术是根据标记基团的荧光共振能量转移(fluorescence resonance energy transfer，FRET)原理而实现的。
当某个荧光基团的发射光谱与另一个荧光基团的吸收光谱重叠，且2个基团距离足够近时，能量可以从短波长(高能量)的荧光基团传递到长波长(低能量)的荧光基团，相当于短波长荧光基团释放的荧光被屏蔽，这个过程称为FRET。
定量原理：实时荧光定量PCR是在反应体系中加入荧光基团，使产物的数量与检测到的荧光强度成线性关系，从而得出产物的扩增曲线。
理想的扩增曲线应为J型，符合2N方程(其中N为PCR的循环次数)，但实际上扩增曲线为S型。
在PCR 反应早期，不能将产生荧光的水平与背景明显区别，之后荧光的产生进入指数期、线性期和最终的平台期，因此可以在指数期的某一点上检测PCR产物的量，并由此推断起始模板含量[2-3]。
实时荧光定量PCR的标准扩增曲线如图1。
其中Rn+表示每点测量的荧光强度，代表反应管含有模板DNA；Rn-表示荧光基线强度，代表反应管不含有模板DNA，其在理想情况下是一条平线，只具有背景荧光数值；△Rn的值表示PCR过程中，探针降解的量，也即PCR产物的量。
基线(baseline)是背景曲线的一段，范围为从反应开始不久荧光值开始变得稳定，到所有反应管的荧光都将要但是还未超出背景。
图1 实时荧光定量PCR的标准扩增曲线荧光阈值(threshold)是以PCR反应前15个循环的荧光信号作为荧光本底信号(baseline)，荧光阈值的缺省设置是3-15个循环的荧光信号标准差的10倍，即：Threshold=10SD(cycle 3-15)，一般认为在荧光阈值以上所测出的荧光信号是一个可信的信号，可以用于定义一个样本的Ct值。
实时荧光定量PCR应用技术综述
反 应 体 系 中加 入荧 光染 料 或 荧 光 基 团 ，利 用 荧 光 信 号 来 实 时
监 测 整个 Ｐ Ｒ进 程 ，最 后 通 过 标 准 曲线 对 未 知 模 板 浓 度 进 定 Ｃ
病 毒 感 染 的 定 量 监测 。
敏 感 、产 率 高 、快 速 、简 便 、重 复 性 好 、易 自动 化 等 突 出优
点 。 １８ ９ ５年 美 国 Ｐ — ｅｕ 公 司 人 类 遗 传 研 究 室 的 Ｍｕｌ 等 Ｅ Ｃ ｔｓ ｌｓ ｉ
发 明 了具 有 划 时代 意 义 的 聚 合 酶 链 反 应 。该 技 术 被 广 泛 应 用
这 个 方 程 式 计 算 出 未 知 样 本 的 初 始 模 量 。实 时荧 光定 量 Ｐ Ｒ Ｃ
仪 都有 软 件 ，可 以从 标 准 曲线 中 自动地 计 算 出 未 知 样 本 的初
始模 板 量 。
或荧 光探 针 特 异 结 合 目的检 测 物 等 方 法 获 得 ．大 大 提 高 了 检 测 的 灵 敏 度 、 特 异 性 和 精 确 。Ｒ ａ ｉ — Ｃ 可 以 应 用 于 ｅｈｍ Ｑ Ｐ Ｒ
实 时荧 光定 量 Ｐ 应 用技术 综述 Ｃ Ｒ
栗文凯 张 智勇 胡建 和 （ 南科 技 学院 动物科 学 学院 ４ ３ ０ ） 河 ５ ０ ３ 李 军 （ 州牧 业 工程 高等 专科 学校 ４ ０ １ ） 郑 ５ ０ １
聚 合 酶 链 反 应 （ ｏ ｍｅ ｓ ｈｉ Ｒ ａｔ ｎ Ｃ Ｐ ｌ ｒ ｅＣ ａｎ ｅｃｉ ，Ｐ Ｒ） 技 术 ｙ ａ ｏ 是８ ０年代 中期 发 展 起 来 的体 外 核 酸 扩 增 技 术 。它 具 有 特 异 、
实时荧光定量PCR技术详解及总结
实时荧光定量PCR技术详解及总结实时荧光定量PCR技术的原理是基于PCR扩增过程中的荧光信号变化。
在PCR过程中，当荧光标记的探针与待扩增模板的特定序列结合时，荧光信号增加。
通过实时监测PCR反应体系中荧光信号的强度变化，可以定量计算起始模板数量。
与传统PCR技术相比，实时荧光定量PCR技术具有更高的灵敏度和准确性。
实时荧光定量PCR技术在现代生物学研究中有广泛的应用。
首先，它被广泛应用于基因表达分析。
通过检测特定基因的mRNA水平，可以揭示基因在生物体内的表达情况及其调控机制。
其次，实时荧光定量PCR技术在病原微生物的检测和分析中也发挥了重要作用。
例如，可以利用实时荧光定量PCR技术检测病毒、细菌等病原微生物的存在，并确定其数量，这对于疾病的早期诊断和治疗具有重要意义。
此外，该技术还常用于遗传多态性的分析、基因突变的检测、DNA甲基化的检测等。
相对于传统PCR技术，实时荧光定量PCR技术具有多项优势。
首先，实时荧光定量PCR技术具有更高的灵敏度。
实时荧光定量PCR技术可以实时监测扩增反应的进程，不仅可以提供扩增过程中的荧光信号变化曲线，还可以精确计算起始模板数量，从而实现对少量模板的高灵敏度检测。
其次，实时荧光定量PCR技术具有更高的准确性。
实时荧光定量PCR技术通过测量荧光信号，可以排除PCR反应中的假阳性结果，并准确计算起始模板的数量，从而提高了实验结果的准确性。
此外，实时荧光定量PCR技术的操作流程简单、快速，并以其高通量特点被广泛应用于高通量筛查和生物信息学研究中。
总结而言，实时荧光定量PCR技术是一种重要的分子生物学技术，它通过结合PCR扩增和荧光探针技术，实时监测和定量DNA扩增过程中的荧光信号变化，以实现对目标DNA序列的高灵敏度、高准确性的定量分析。
该技术在基因表达分析、病原微生物检测、遗传多态性分析等领域具有广泛应用。
实时荧光定量PCR技术的发展和应用，为生物学研究和临床诊断提供了重要的工具和方法。
实时荧光定量PCR技术
模板含有抑制物；···
火/延伸时间；提高引物浓
度；添加K+；改用三步法扩
增；添加增强剂；换酶；重
新设计引物；···
特异性差 探针，引物设计不合理，二级 提高退火/延伸温度；适当降
结构过多；探针，引物浓度 低探针，引物浓度；调整
过高；退火/延伸温度偏低； Mg2+的量；重新设计探针，
···
引物；换酶···
体系稳定性差 原料储存不当；体系配制时间 探针应避光；体系在冰上配制
过长；模板浓度低；模板不 ；使用合格的试剂盒制备模
纯，降解；
板，避免反复冻融；
···
谢谢
–反应体系监控：蒸发、操作
荧光定量PCR过程
一 体系配制
组分名称
作用
10×buffer（Tri-Hcl、 ( NH4)2SO4、K+、Mg2+等）
引物mix 探针mix Taq酶（10U/ul） UNG酶（1U/ul）
缓冲液-提供反应环境
PCR反应的出发点 发出信号，指示扩增 聚合酶-催化合成反应
• 二，Ct值为扩增曲线与阈值线的交点所对应的循环次数，即Ct值与荧光 阈值有关。
实时荧光定量PCR技术的数学原理
• 理想的PCR反应： Xn=X0×2n
n：扩增反应的循环次数 Xn：第n次循环后的产物量
• 非理想的PCR反应： Xn=X0(1+Ex)n
X0：初始模板量 Ex：扩增效率
方程式两边同时取对数得: log Xn=log (X0 (1+Ex)n) 整理方程式得:log X0= (- log(1+Ex) )×n+ log Xn
• 此外，还其它非荧光类淬灭基团如BHQ1，BHQ2等。
实时荧光定量PCR技术及其应用研究进展
实时荧光定量PCR技术及其应用研究进展实时荧光定量PCR技术（Real-time quantitative PCR，qPCR）是一种快速、精确、灵敏、特异的基因检测技本，广泛应用于医学、生物学、农业和环境学等领域。
本文将介绍实时荧光定量PCR技术及其原理、应用研究进展。
一、实时荧光定量PCR技术原理实时荧光定量PCR技术是通过荧光探针标记的PCR产物进行实时监测，利用荧光信号的强度反映靶基因的数量。
其基本原理是将荧光信号的增加与反应过程中的PCR产物数量成正比。
实时PCR技术相比于传统PCR技术具有以下优势：1. 高灵敏度：实时PCR技术可以检测到非常低浓度的DNA或RNA，通常可以达到几十个分子的水平。
2. 高特异性：通过设计特异性的引物和探针，可以避免非特异性扩增产生。
3. 快速性：实时PCR技术可以在几小时内完成PCR反应，相比于传统PCR技术更快速。
4. 定量性：实时PCR技术可以准确地测量靶基因的数量，比较不同样本中的基因表达量或拷贝数。
二、实时荧光定量PCR技术应用研究进展1. 医学领域在医学领域，实时PCR技术被广泛应用于病原微生物的检测与鉴定，包括细菌、病毒、真菌等。
利用实时PCR技术可以快速准确地检测到呼吸道病毒、肠道病毒、HIV等病原微生物，为临床诊断和治疗提供了重要依据。
实时PCR技术还可以用于检测肿瘤标志物、基因突变和表达水平的变化，为肿瘤的早期诊断和预后评估提供了重要手段。
2. 生物学领域在生物学领域，实时PCR技术被广泛应用于基因表达分析、基因型分析、基因突变检测等研究。
利用实时PCR技术可以快速准确地测量基因的表达水平，在研究基因调控、信号转导、分子途径等方面发挥了重要作用。
实时PCR技术还可以进行单细胞PCR分析，研究细胞在不同状态下基因表达的动态变化。
实时荧光定量PCR技术具有快速、精确、灵敏、特异的特点，广泛应用于医学、生物学、农业和环境学等领域。
随着PCR技术的不断发展和改进，相信实时PCR技术在基因检测领域将发挥越来越重要的作用，为人类健康、生物科学研究和环境保护等方面做出更大的贡献。
实时荧光定量PCR的原理
(3).目前合成价格较贵. (4).不能做熔解曲线分析.
原理概述
8.荧光定量PCR的数学原理
理想的PCR反应： X=X0*2n (扩增效率=1) 实际的的PCR反应： X=X0* (1+Ex)n n：扩增反应的循环次数 X：第n次循环后的产物量 X0：初始模板量 Ex：扩增效率
原理概述
8.荧光定量PCR的数学原理
Ct=
-log X0 + log M log(1+Ex)
(5)
Log（x0的初始模板量）与到达阈值时的循环数（Ct值）呈线 性关系，根据样品扩增达到域值的循环数即Ct值就可计算出 样品中所含的模板量
原理概述
8.荧光定量PCR的数学原理
模板DNA量越多，荧光达到域值的循环数越少，即Ct值越小 Log浓度与循环数呈线性关系，通过已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线， 根据样品Ct值，就可以计算出样品中所含的模板量
原理概述
5.非特异性荧光染料SYBR Green的优缺点
优点：
(1).对DNA模板没有选择性----适用于任何DNA (2).使用方便-----不必设计复杂探针 (3).非常灵敏 (4).可做熔解曲线分析 (5).便宜
缺点： (1).对引物特异性要求较高 (2).与非特异性双链DNA结合，产生假阳性,干扰实验的准确性,尤其 是分析表达量不高的基因时,这类情况尤其突出; 需要不断的优化反 应体系,降低非特异性扩增.
实时荧光定量PCR：在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整 个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方 法。 定量PCR仪是在普通PCR仪的基础上加装了荧光激发装置和荧光检测装置，PCR扩增 和检测同时进行，最终结果不需进行电泳检测，所以有效地避免了样品间的交叉污染。
实时荧光定量PCR技术及其应用研究进展
实时荧光定量PCR技术及其应用研究进展实时荧光定量PCR技术是一种高灵敏度、高精度、高通量的分子生物学分析技术，已经成为生物医学研究和临床检验等领域中最为常用的技术之一。
本文对实时荧光定量PCR 技术的基本原理和应用进行综述。
一、实时荧光定量PCR技术的基本原理实时荧光定量PCR技术是指同时对PCR反应过程中的荧光信号进行实时监测和定量分析的PCR技术。
其基本原理是利用荧光探针的特性，在PCR反应的过程中实时检测待测样品中的目标基因或序列的扩增情况。
实时荧光定量PCR技术有多种实现方式，如荧光染料法、探针法和SYBR Green法等，其中SYBR Green法是最为常用的方法之一。
SYBR Green法是利用SYBR Green荧光染料在PCR反应过程中与扩增产物特异结合并发出荧光信号，从而实现实时监测和分析PCR反应过程中的扩增情况。
SYBR Green法使用简单，不需要标记探针，但对PCR反应产物的特异性和准确性要求较高，容易产生假阳性结果。
因此，需要采用严格的优化条件，如保证PCR反应体系的均一性和减少非特异性扩增等，以提高实验结果的准确性和可靠性。
实时荧光定量PCR技术已经成为分子生物学研究和临床检验等领域中最为常用的技术之一。
其应用范围广泛，主要包括以下几个方面。
1、基因表达分析实时荧光定量PCR技术可用于定量检测不同组织、不同发育阶段或不同病理状态下的基因表达差异，从而深入研究基因调控机制及其相关生物学过程。
例如，在癌症研究中，可以利用实时荧光定量PCR技术检测癌细胞和正常细胞中特定基因的表达差异，为癌症的预防、诊断和治疗提供依据。
2、基因突变和SNP分析实时荧光定量PCR技术可用于检测基因突变和SNP（single nucleotide polymorphism）等分子位点的变异情况，从而分析基因多型性与个体表型之间的关系。
此外，实时荧光定量PCR技术还可用于定量检测DNA甲基化等表观遗传学修饰的变化情况。
实时荧光定量PCR技术
Real Time PCR 原理
• 定量PCR通过Ct和初时模板量的关系进行定量。 • 同一样品的96个重复的终点荧光强度差别很大，但是Ct相同。
C(t)
Ct值的特点： 终点处产 物量不恒定； Ct值则极具 重现性
Cycle
Real Time PCR 原理
模板DNA量越多，荧光达到域值的循环数越少，即Ct值越小。
THANKS
非特异性 SYBR Green I染料法
SYBR Green I与 DNA双螺旋小沟区域结合示意图
• SYBR Green I 与dsDNA结合 • SGI 与dsDNA结合后受激发荧光强度增加1000倍
• 随着产物的积累，越来越多的SGI与dsDNA 结合，
SYBR Green I作用机理示意图 使得荧光信号增强.
Log浓度与循环数呈线性关系，通过已知起始拷贝数的标准品可作
出标准曲线，根据样品Ct值，就可以计算出样品中所含的模板量。
Real Time PCR 检测方法
分别是DNA结Βιβλιοθήκη 染料法、水解探针法、分子信标法、 杂交探针法、荧光引物法。
核酸染料技术 代表：SYBR Green I (SGI)
荧光探针技术
代表：TaqMan probe
非特异性 SYBR Green I染料法
SYBR Green I是一种结合于所有dsDNA双螺旋小沟 区域的具有绿色激发波长的染料 ，在游离状态下， SYBR Green I 发出微弱的荧光，但一旦与双链 DNA 结合后，荧光大大增强 。因此，SYBR Green I的荧 光信号强度与双链 DNA 的数量相关，可以根据荧光 信号检测出PCR 体系存在的双链 DNA 数量。SYBR G reen I 的最大吸收波长约为497nm，发射波长最大 约为 520nm。
实时定量PCR技术综述
实时定量PCR技术综述一．基本原理1.PCR反应动力学右图为PCR反应曲线（横坐标为循环数，纵坐标表征产物量），不同的曲线代表初始模板量不同的 PCR反应。
PCR反应的动力学公式为：C n=C0(1+E)n其中C0和C n分别为初始模板和n循环的拷贝数，n为循环数，E为扩增效率（0≤E≤1），理想状态下（即每个循环中所有模板均与引物结合并等到扩增），E为1。
由上图可知，只有在线性区段E值才为定值，这样才能通过检测C n定量C0，由于终点检测不能保证在线性区段，所以重复性不好，实时检测（每个循环检测一次）技术解决了这个问题。
2.定量PCR原理定量PCR是将待测标本与一系列浓度（C0）已知的标准品在同一条件下共同扩增，并进行实时检测，根据标准品的检测值及已知的C0值作出标准曲线，如右图（横作标为的C0对数值），再根据待测标本的检测值在标准曲线上查到待测标本的C0值。
3.信号产生目前定量PCR技术信号产生都是基于FRET (fluorescence resonance energy transfer)的原理，即在一定波长的光激发下，一个荧光基团A发光，并且被邻近的另一个荧光基团B 吸收，使荧光基团B发光。
如检测荧光基团A，应在FRET消除后；如检测B，则应在FRET 发生时检测。
根据信号产生方式的不同可将定量PCR技术分为三类：TaqMan Probes技术；Hybridization Probes技术；Molecular Beacons技术。
TaqMan Probes技术（右图A）是Perkin Elmer公司1995年研制，利用热稳定DNA聚合酶5’→3’外切酶活性，将TaqMan 探针5’端荧光基团切去，使之与3’端荧光基团分离、荧光淬灭消失，在特定波长下检测5’端荧光基团即可表征PCR产物的量。
Hybridization Probes技术（右图B）是Roche公司建立的，PCR反应退火过程中，两个探针与模板杂交（相邻一个碱基），发生FRET，这时检测第二个荧光基团即可表征PCR产物的量。
实时定量PCR技术总结资料
定量PCR引物的设计---提高扩增特异性
Primer-BLAST在线设计: /tools/primer-blast/
目标基因的序列或者基因号
引物扩增片段（扩增子）的长度 引物的Tm值（退火温度） 相应物种及对应的数据库
点击获取引物序列
报告基团
淬灭基团
5’
3’
定量PCR的化学原理----PCR产物的荧光标记
Taqman探针的工作原理 (1)荧光共振能量转移(FRET)
(2)反应过程中Taq酶的5'→3'外切活性
Förster, Ann. Physik. 1948, 437, 55
定量PCR的化学原理----PCR产物的荧光标记
SYBR Green I染料法
SYBR Green I在PCR过程中的作用原理
变性 退火
• 扩增形成DNA双链的过程随
时有染料结合，染料一旦结合 至双链DNA就产生荧光信号
• 产生的荧光信号强度与体系 中DNA分子总数目成正比
• 优点：经济、方便
延伸
延伸过程 染料结合
• SYBR Green对DNA序列并无
医学、农牧、生物相关分子生物学定量研究
内容提纲
定量PCR的原理 实验操作方法 各参数的一般标准 常见问题及分析
内容提纲
定量PCR的原理 实验操作方法 各参数的一般标准 常见问题及分析
终点定量和起点定量
常规PCR技术：对扩增反应的终点产物进行定性或定量分析。 定量PCR技术：在反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号
判断数据的有效性
正常扩增
扩增 曲线
• S型扩增曲线 • 扩增曲线平滑 • 重复性较好
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
实时定量PCR技术综述
一．基本原理
1.PCR反应动力学
右图为PCR反应曲线（横坐标为循环数，纵坐标表征产物量），不同的曲线代表初始模板量不同的 PCR反应。
PCR反应的动力学公式为：
C n=C0(1+E)n
其中C0和C n分别为初始模板和n循环的拷贝数，n为循环数，E为扩增效率（0≤E≤1），理想状态下（即每个循环中所有模板均与引物结合并等到扩增），E为1。
由上图可知，只有在线性区段E值才为定值，这样才能通过检测C n定量C0，由于终点检测不能保证在线性区段，所以重复性不好，实时检测（每个循环检测一次）技术解决了这个问题。
2.定量PCR原理
定量PCR是将待测标本与一系
列浓度（C0）已知的标准品在同
一条件下共同扩增，并进行实时
检测，根据标准品的检测值及已
知的C0值作出标准曲线，如右
图（横作标为的C0对数值），再根据待测标本的检测值在标准曲线上查到待测标本的C0值。
3.信号产生
目前定量PCR技术信号产生都是基于FRET (fluorescence resonance energy transfer)的原理，即在一定波长的光激发下，一个荧光基团A发光，并且被邻近的另一个荧光基团B 吸收，使荧光基团B发光。
如检测荧光基团A，应在FRET消除后；如检测B，则应在FRET 发生时检测。
根据信号产生方式的不同可将定量PCR技术分为三类：TaqMan Probes技术；Hybridization Probes技术；Molecular Beacons技术。
TaqMan Probes
技术（右图A）是
Perkin Elmer公司
1995年研制，利用
热稳定DNA聚合
酶5’→3’外切酶活
性，将TaqMan 探
针5’端荧光基团切
去，使之与3’端荧
光基团分离、荧光
淬灭消失，在特定
波长下检测5’端荧
光基团即可表征
PCR产物的量。
Hybridization Pro
bes技术（右图B）是Roche公司建立的，PCR反应退火过程中，两个探针与模板杂交（相邻一个碱基），发生FRET，这时检测第二个荧光基团即可表征PCR产物的量。
Hybridization Probes技术要求热稳定DNA聚合酶不具备5’→3’外切酶活性，而是在引物延伸过程中被取代，使探针可在下一循环再与模板杂交，如探针被降解，可导致定量不准。
Molecular Beacons技术（上图C）利用茎环结构的探针，当形成茎环结构时，发生荧光淬灭，退火过程中，探针与模板杂交，荧光淬灭消失，在特定波长下检测5’端荧光基团即可表征PCR产物的量。
二.荧光标记
1.TaqMan Probes
TaqMan探针通常在5’端以荧光基团FAM标记，靠近3’端以荧光基团TAMRA标记，3’端磷酸化以防止探针在PCR扩增过程中被延伸。
下表列出了两种荧光基团的吸收及发射波长。
2.Hybridization Probes
Hybridization探针技术中，上游donor Probe 3’端以荧光基团Fluorescein标记；下游acceptor Probe 5’端以Roche的LC-Red 640标记（当用双荧光基团时还可同时使用
LC-Red 705），3’端磷酸化以防止探针在PCR扩增过程中被延伸。
也有文献报道acceptor Probe 5’端以Cy5标记，下表列出了各种荧光基团的吸收及发射波长。
3.荧光标记基团与PCR仪的激发与检测波长
由于荧光标记基团的选择还受到定量PCR仪所提供的激发和检测波长的制约，所以这里介绍一下临床应用中主流机型所提供的检测波长，见下表。
三.TaqMan Probes技术要点
TaqMan Probes技术要求所用的热稳定DNA聚合酶不但
要具有5’→3’外切酶活性,而且要求所获得的扩增曲线符合
PCR反应动力学。
Matthew J.Longley等（1990）研究了热稳定DNA聚合酶的5’→3’外切酶活性,认为：（１）其5’→3’外切酶活性和DNA聚合酶活性位于同一肽段；（２）5’→3’外切酶活性依赖于双链DNA（如右图）；（３）5’→3’外切酶活性具有热稳定性，之所以70℃较50℃活性低（如右图）是由于高温破坏了探针与模板间的双链结构。
K-A.Kreuzer等（2000）研究了15种热稳定DNA聚合酶（商品）的5’→3’外切酶活性，其中7种声称具有5’→3’外切酶活性，右图是这７种酶的定量PCR反应（TaqMan）曲线,其中部分酶没有5’→3’外切酶活性、部分酶具有较弱的5’→3’外切酶活性、只有一种酶的扩增曲线（A）符合PCR反应动力学。
下表列出了部分文献报道的TaqMan Probes技术所使用的酶和其它相关参数。
四.Hybridization Probes技术要点
Hybridization探针技术要求所用的热稳定DNA聚合酶没有5’→3’外切酶活性,以保证探针有恒定的浓度并能反复与模板杂交。
Jochen,Wilhelm等（2001）研究了Taq酶5’→3’外切酶活性对基于Hybridization探针技术的定量PCR的影响，认为：（１）Taq酶5’→3’外切酶活性降解了部分探针；（２）Taq 酶的stoffel片段（去除N端289个氨基酸）不具有5’→3’外切酶活性，其在高浓度Mg2+
存在下，能获得较好的PCR动力学曲线（如下图）；（３）stoffel片段因高Mg2+浓度造成的非特异性扩增可采用加入TaqStart antibody的方式消除。
五.TaqMan探针与Hybridization探针技术的比较
1. Hybridization探针技术的特异性高于TaqMan探针，因其信号的产生依赖于两个独立探针的特异性。
但其在探针设计上需要更多的可选序列；
2. TaqMan探针技术的开放性优于Hybridization探针技术，原因有二：（１）TaqMan探针技术的荧光标记系统是开放的，易从第三方获得，而Hybridization探针的荧光染料为罗氏专有，易受其控制；（２）TaqMan探针和Hybridization探针分别在ABI Prism7700和罗氏LightCycler上建立，因荧光标记和仪器检测波长的不同，限制了其在两种仪器上的通用性，目前已有文献报道将TaqMan探针用在LightCycler上，但未见报道Hybridization探针用在ABI Prism7700上，可能是ABI Prism7700价格较贵，不适合临床应用，而ABI GeneAmp 5700SDS只有一个检测波长（530nm）；也可能Hybridization探针依赖于LightCycler的快速扩增。
3. Hybridization探针分别标记两个探针，和TaqMan探针的同一探针三种修饰相比，修饰技术要求低，对修饰的质量控制更有利。